Summary
Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.
Abstract
Genetiği fare modelleri (GEMMs) insan hastalıkları kanser gibi başlama ve ilerleme mekanizmalarının içine roman biyolojik anlayışlar ortaya son derece değerlidir. Transgenik ve koşullu nakavt fareler sık gen overexpression için kullanılmış olan veya ablasyon belirli doku veya hücre içinde vivotürleri. Ancak, germline fare modelleri oluşturma zaman alıcı ve pahalı olabilir. Gen teknolojileri ve DNA plazmid tarafından viral enfeksiyon teslim fizibilite düzenleme son gelişmeler hızlı oluşturulmasında çeşitli organları germline sigara otokton fare kanser modelleri etkinleştirdiniz. Mesane urothelium kapsayan bir glikozaminoglikan katman varlığı nedeniyle erişmeye viral vektörler için zor olan bir organdır. Burada, laboratuar DNA plazmid verimli bir şekilde teslim içine fare mesane urothelium içinde vivoiçin geliştirilen bir roman yöntemi açıklanmaktadır. PCAG-GFP DNA plazmid İntravezikal korumak ve cerrahi olarak maruz mesane çoğalmasıyla, DNA plazmid geçici ifade için mesane ürotelyal hücre içine özellikle teslim olduğunu göster. Bizim yöntem overexpression ve fare mesane genlerin nakavt için hızlı ve uygun bir yol sağlar ve GEMMs mesane kanseri ve diğer üroloji hastalıkları bina için uygulanabilir.
Introduction
Genetiği fare modelleri (GEMMs) hayvan geliştirme, gen fonksiyonları vivo içindeve mekanizmaları hastalık ilerleme1,2hakkında bilgimizi genişletmek önemli bir rol oynuyor. Germline GEMMs geleneksel olarak iki şekilde geliştirilmiştir. İlk DNA plazmid pseudopregnant kadın zigotları nakli tarafından takip pronuclear enjeksiyonla transgenik fareler oluşturulmasıdır. Diğer knock-out/knock-gelen fareler tarafından homolog rekombinasyon embriyonik kök hücre üretimi ve chimeras gelişimi bu. Genlerin ilgi belirli doku veya hücre türü koşullu nakavt Cre ve flox siteleri ile genetik allelleri üreme birden çok nesiller için içerir. Kül oluşum-ebilmek var olmak pahalı ve zaman alıcı, özellikle hedef doku-özellikle birden çok gen hedef için ise. Son zamanlarda, gen düzenleme teknolojileri kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) gibi çeşitli organlarda doku özgü genetik değişiklikler otokton kanseri3modelleme için ikna etmek için farelerin uygulanmış olan, 4,5,6,7 veya doğru hastalık mutasyonlar in situ8,9. Bu çalışmalarda gRNA vektörler teslimini genellikle adenoviral veya lentiviral enfeksiyonu organ veya hidrodinamik kuyruk-damar enjeksiyon elde edildi. Akciğer ve karaciğer için CRISPR bileşenlerinin teslimatlar göreli kolaylığı büyük ölçüde kolaylık ve geleneksel Cre-Lox göre fare modellerle karşılaştırıldığında bu organlarda modelleme kanser verimliliği iyileşmiştir.
Mesane urothelium nereden köken çoğu mesane tümörleri var. Mesane urothelium kanser modelleme veya gen tedavisi için DNA vektörel çizimler teslimini glikozaminoglikan katmanı apikal ürotelyal yüzeyinde, bulaşıcı virüs10,11bağlılık için bir engel olarak engel oluyor. Syn3 ve lauryl-β-d-maltoside gibi birkaç tedavi öncesi Aracısı bu bariyer bozabilir ve adenovirus enfeksiyonu verimliliği12,13,14geliştirmek için kullanılmaktadır. Olup olmadığını virüs (AAVs) Adeno ilişkili etkin bir şekilde-ebilmek bulaştırmak mesane bildirilmemiştir. Genel olarak, bir viral tabanlı teslimat yöntemi arzu olurdu. Burada, verimli DNA plazmid teslim edilmek üzere fare urothelium İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon Laboratuarında geliştirilmiş bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Yaklaşımımız kimyasal Önarıtma glikozaminoglikan katman veya virüs üretim anlamına gelmez çünkü o önemli ölçüde DNA plazmid teslim fare mesane urothelium içine kolaylaştırır ve çeşitli in vivo çalışmalar kolaylaştırmak gerektiğini Mesane hastalıkları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yordamları kurallar ve düzenlemeler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kaliforniya Üniversitesi Santa Cruz uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Plazmid ve araçları hazırlama
- Her mesane transfect, DNA plazmid (1 µg/µL) en az 20 µL hazırlamak.
- Trypan mavi 1 µL plazmid çözüm 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 20 µL ekleyin. Pipet iyice karıştırın.
- Otoklav tüm cerrahi aletleri ve çalışma alanı % 70 etanol ile sterilize. Cerrahi aletler ve eldiven % 70 etanol ile sık sık sprey veya cam boncuk Sterilizatör steril koşullar korumak için aşağıdaki adımları yerine getirirken kullanın.
2. anaesthetizing hayvan
- Bir tablosu üst anestezi sistemi isoflurane hayvanla anestezi için kullanın. O2 tankındaki açmak ve oksijen akış ölçer 1 L/dk ayarlayın.
- Yetişkin bir kadın C57BL/6J fare indüksiyon odasına koyun. Açmak ve indüksiyon için % 3 isoflurane Buharlaştırıcı ayarlayın. Fare anestezi 2 dk. Yönet buprenorfin analjezik (0.1 mg/kg) içinde subkutan indüksiyon odası preemptive analjezi için fareden kaldırılması üzerine olmalıdır.
Not: İdrar Kateterizasyon sırasında çalışmak daha kolay olduğu gibi bu protokol için dişi fareler, kullanılır. İletişim kuralı da erkek fareler için çalışır ama ekstra dikkatli adım 3 gerçekleştirirken gereklidir. - Oftalmik merhem kuruluğu önlemek için hayvan gözler için geçerlidir. Anaesthetized fareyi onun burun burun koni ile bir Isıtma yastık üzerinde yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Burun konisi git isoflurane izin hava devre anahtarı çevir.
- Baş ve yapışkan bant ile burun konisi dizginlemek. Bakım için % 2 isoflurane Buharlaştırıcı ayarlayın.
- Yapışkan bant ile bacaklarda dizginlemek. Belgili tanımlık hayvan içinde derin anestezi ve karın bölgesi tıraş emin olmak için ayak-çimdik sınamaları gerçekleştirin.
3. idrar tükenmesi ve mesane durulama
- Yağ kateter (24 G, 2.11 cm uzunluğunda, 0,045 cm dış çapı) uygulamak ve dış yüzeyi tamamen kaplıdır sağlamak.
- Kateter üretra ataşını ve hangi zamanda idrar dışarı kateter akışı gerekir mesane ulaşıncaya kadar yavaşça itin. İdrar tükenmesi yardımcı olmak için karın hafifçe bastırın.
- Kateter doğru mesane otomatik idrar dışarı akışı gözlemleyerek eklenir eğer kontrol edin. Üretra ve mesane duvarı piercing önlemek ve yağ gerekirse birden çok kez uygulayın.
- Bir pipet ile idrar atık kabı atın.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) 80 µL pipet ile diğer sonunda hala mesane kateter dış ucunu. Dikkatle 1 mL şırınga için kateter takın. PBS mesane enjekte etmek şırıngayı yavaşça itin. Bazı PBS hava kabarcıkları mesane oluşturmaktan kaçınmak için kateter bırakın.
- Şırınga kaldırın. PBS dışarı mesane boşaltmak bekleyin. PBS boşaltmaya karın hafifçe bastırın.
- Sonda bir pipet ile PBS atık kabı atın.
- (Adım 3.4-3.6) yıkama PBS iki kez daha tekrarlayın.
Not: Hafifçe çamaşır adımları sırasında çalışması için önemlidir. Kateter veya başarısızlık otomatik kan dışı sıvı akımı genellikle üretra yoluyla deldi gösterir. Elektroporasyon verimliliği düşecektir olarak da hava kabarcıkları, tanıtımı önlemek önemlidir.
4. plazmid teslim
- Fare karın % 70 etanol uygulayabilir ve neşter yukarıda mesane karın cildi açmak için 1 cm dikey kesi yapmak için kullanabilirsiniz.
- Plazmid artı Trypan mavi çözüm en az 20 µL kateter dış ucunu pipet ve şırınga ekleyebilirsiniz.
- Plazmid çözüm mesane enjekte. Mesane onaylamasına enjeksiyon başarılı olur. Bazı sıvı hava kabarcıkları mesane oluşturmaktan kaçınmak için kateter bırakın.
- Cımbız kullanarak dış üretral orifis kapmak ve kateter ve şırınga kaldırın. Dış üretral orifis sıkmak için bir dize kullanın. Dize içeren iki döngüler yapmak ve sonra ile iki knot kravat.
Not: üretral sıkma plazmid sıvı geri tepme önlemek için önemlidir. - Elektroporasyon generator aşağıdaki parametreleri ile açın: 33V, 50 ms çalışma zamanı ve 950 ms aralığı zaman.
- Mesane cımbızla tutup da iki elektrot ile mesane çimdik. Elektroporasyon gerçekleştirmek için ayak pedalı itmek.
Not: Elektrik darbeleri ile 5 kere kısa aralıklarla her pedal itme sonra gerçekleşmesi için ayarlanır. Fare bu süreçte seğirmesine neden. Birden çok kez ayak pedalı itmek teslim verimliliği artırabilir, ancak çok fazla elektrik darbeleri urothelium doku bütünlüğü zarar verebilir.- Bu bir kıvılcım oluşturur cımbız ve elektrotlar arasında herhangi bir temas önlemek.
5. kurtarma
- Steril cerrahi sütür ve klipleri ile karın ve cilt açılış dikiş. İyot yaranın üzerine uygulayın.
- Hayvan isoflurane sisteminizden kaldırın. Subkutan ameliyat sonrası ağrı hafifletmek için buprenorfin analjezik (0.1 mg/kg) yönetmek için.
- Hayvan Isıtma yastığını üzerinde tutun ve sonra tam kurtarma ev kafese geri. İçin içme ve belgili tanımlık kesme iyileşti ve küçük resimleri kaldırmak kadar beslenme davranışları ve enfeksiyon belirtisi yok en az bir kez her gün normal hareket eden, hayvan kontrol edin. Hayvan acı belirti azaltılmış damat, artan saldırganlık ve konser gibi görüntüler, sonraki buprenorfin analjezik enjeksiyonlari yönetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gen teslim mesane urothelium içine başarı göstermek için biz pCAG-GFP15 plazmid elektroporasyon için kullanılır. Plazmid ve Trypan mavi çözüm 20 µL üretra enjekte ettiler ve 5 elektrik darbeleri idare. 48 h sonra fare mesane disseke ve negatif kontrol ise GFP sinyal (şekil 1A) gösterdi elektroporasyon geçmesi değil mesane GFP floresan bir diseksiyon floresan mikroskop altında yamalari gözlendi. Cytokeratin (CK) 5, CK18, ile kesitli mesane dokuların ayirt boyama gerçekleştirildiğinde GFP antikorlar, bulduk GFP şemsiye, orta, mevcut ve Bazal Hücre sinyal ama değil kas (şekil 1B), katman Plazmid teslimat urothelium içine iyi özgüllük gösteren. Yaklaşık %15 ürotelyal hücre GFP+, ve böyle klonal doğa kanser tümörleri genellikle tek tek hücreler başlatmak beri modelleme için ideal olmalıdır.
Şekil 1: pCAG-GFP plazmid başarılı teslimat için fare mesane urothelium. Elektroporasyon (sağ) (solda) o elektroporasyon başarıyla mesane yeşile gösterilen bir negatif kontrol mesane için uygulanan bir mesane(a)karşılaştırılması. (B) ayirt mozaik ifade deseninin GFP+ hücre Şemsiyenin içinde gösterilen kesitli mesane dokuların boyama (CK18+), orta (CK5+CK18+) ve Bazal (CK5+) ürotelyal katmanları. A ölçek çubuğu 1 mm ve B karşılık gelen 50 µm. için Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroporasyon hücre membran geçirgenliği artırır ve gen electrotransfer16için güçlü bir teknolojidir. Gen teslim yaşam kemirgenler tarafından elektroporasyon içine Nörobiyoloji alanları17,18,19,20,21' sık kullanılan. Onun potansiyel uygulamalar birçok diğer organlarda kapsamlı bir şekilde araştırılmalıdır değil. Bilgimizi, burada açıklanan bizim yöntem elektroporasyon ile başarılı gen teslim mesane urothelium için ilk rapordur. Enfeksiyon adenovirus/lentivirus tabanlı yöntemleri için birçok avantaj sunar. İlk olarak, adım daha kolay, daha güvenli ve daha ucuz çünkü non-viral genetik vektörel çizimler kullanılır ve DNA plazmid teslim belirli organ siteleri vivo içinde nispeten basittir benimsemeye yöntemidir. İkinci olarak, çoğu kez teslimat ile virüs vektörel çizimler22tarafından ilişkili istenmeyen ana bilgisayar bağışıklık yanıtı önler. Üçüncü olarak, mesane söz konusu olduğunda, normalde virüs bağlama ürotelyal hücre engeller glikozaminoglikan katmanın kimyasal Önarıtma ihtiyacını olumsuzlar.
Bu iletişim kuralı en kritik adımlarda Kateterizasyon, durulama ve plazmid enjeksiyon vardır. Ekstra bakım ve nazik işleme kateter üretra veya mesane duvar aracılığıyla ekleme işlemi sırasında delip değil olduğunu emin olmak için gereklidir ve şırınga ekleme/kaldırma. Tam dış karşılamak için yeterli yağ uygulamak kateterin yüzeyi de gerekli. Hata başka bir olası nedeni hava kabarcıkları mesane içine giriş durulama ve plazmid enjeksiyon sırasında olduğu için elektriksel iletkenlik azalır. Bunu önlemek için her zaman biraz sıvı kateter içinde bırakarak bu adımları gerçekleştirirken öneririz.
Biz teslim verimliliği daha genç (2 ay) ve büyük (1 yıl) fareler arasında bir fark dikkat değil çünkü bizim protokol herhangi bir yaş yetişkin fareler için çalışması gerekir. Çeşitli faktörler plazmid teslim etkinliğini etkileyebilir. Daha düşük miktar yeterince mesane iç yüzeyine kapsayabilir değil olarak plazmid enjeksiyon için asgari miktar olarak 20 µL öneririz. Plazmid birim ve konsantrasyonu genellikle artan verimleri yüksek penetrasyon, ama ek bir yararı yoktur ötesinde 60 µL. daha fazla elektrik darbeleri veren birimlerin gözlendi ve mesane elektrotlar ile farklı yüzey alanlarını dokunmadan olacak Teslimat verimliliği arttırmak üzerinde büyük etkisi. Bu protokol için açıklanan elektroporasyon parametreleri permeabilization ürotelyal hücre doku bütünlüğü, koruma yüksek gerilim hücre ölümüne neden eğilimi bu yana süre izin ayarlanır. Bu parametreler için daha fazla optimizasyon oynamak mümkündür. Fare fare varyasyonları ve işleme araştırmacının verimliliği büyük ölçüde etkileyebilir. Projenin amacı bağlı olarak, belirli her deneme için en iyi parametreleri belirlemek için denemeler yapmak tavsiye. Örneğin, modelleme kanser başlatma ve klonal büyüme, düşük penetrasyon istenen.
Kanıt-in-ilke bizim teslim yöntemi için GFP ifade mesane 36 h gibi erken elektroporasyon sonra görüntülenmeyecektir ve en az iki hafta boyunca devam edebilir. Bu yeni yöntem ile şimdi hızlı ve ucuza gen overexpression ya da aşağı-Yönetmeliğin ve genom düzenleme için fare mesane DNA plazmid sunmak mümkündür. Mesane gelişimi ve hastalıkları eğitim yanı sıra roman otokton mesane kanseri modeli oluşturmak için yeni yollar açılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip ilgi bildirin.
Acknowledgments
Biz Profesör Bin Chen, Dr Yue Zhang ve Kendy Hoang elektroporasyon sistemi kurma konusunda yardım için teşekkür ederim. Bu iş Z.A.W. için Santa Cruz kanser fayda grubu ve NIH gelen hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
