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Protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Las heridas crónicas se desarrollan a partir de heridas agudas en un modelo de ratón diabético induciendo altos niveles de estrés oxidativo después de una herida cutánea de espesor completo. La herida se trata con inhibidores de la catalasa y glutatión peroxidasa, lo que resulta en un deterioro de la cicatrización y el desarrollo de biopelículas por bacterias presentes en el microbioma de la piel.

Abstract

Las heridas crónicas se desarrollan como resultado de una regulación defectuosa en uno o más procesos celulares y moleculares complejos involucrados en la curación adecuada. Afectan a 6,5 millones de personas y cuestan 40 millones de euros al año solo en los EE. UU. Aunque se ha invertido un esfuerzo significativo en entender cómo se desarrollan las heridas crónicas en los seres humanos, las preguntas fundamentales siguen sin respuesta. Recientemente, desarrollamos un novedoso modelo de ratón para heridas crónicas diabéticas que tienen muchas características de heridas crónicas humanas. Usando ratones db/db-/-, podemos generar heridas crónicas induciendo altos niveles de estrés oxidativo (OS) en el tejido de la herida inmediatamente después de la herida, utilizando un tratamiento único con inhibidores específicos de las enzimas antioxidantes catalasa y glutatión peroxidasa. Estas heridas tienen altos niveles de Sistema Operativo, desarrollan biofilm de forma natural, se vuelven completamente crónicas dentro de los 20 días después del tratamiento y pueden permanecer abiertas durante más de 60 días. Este nuevo modelo tiene muchas características de las heridas crónicas diabéticas en los seres humanos y por lo tanto puede contribuir significativamente a avanzar en la comprensión fundamental de cómo las heridas se vuelven crónicas. Este es un gran avance porque las heridas crónicas en los seres humanos causan dolor significativo y angustia a los pacientes y resultan en la amputación si no se resuelven. Además, estas heridas son muy costosas y requieren mucho tiempo de tratar, y conducen a una pérdida significativa de ingresos personales para los pacientes. Los avances en este campo de estudio a través del uso de nuestro modelo de heridas crónicas pueden mejorar significativamente la atención médica para millones de personas que sufren bajo esta condición debilitante. En este protocolo, describimos con gran detalle el procedimiento para hacer que las heridas agudas se vuelvan crónicas, lo que no se ha hecho antes.

Introduction

La cicatrización de heridas implica procesos celulares y moleculares complejos que están regulados temporal y espacialmente, organizados en etapas secuenciales y superpuestas que involucran muchos tipos de células diferentes, incluyendo pero no limitado a la respuesta inmune y la sistema1. Inmediatamente después de que la piel sufre una lesión, los factores y las células sanguíneas se agregan al sitio de la herida e inician la cascada de coagulación para formar un coágulo. Después de que se logra la homeostasis, los vasos sanguíneos se dilatan para dejar entrar en el sitio de la herida oxígeno, nutrientes, enzimas, anticuerpos y factores quimiotácticos que quimioaparalan polimorproucleocitos para limpiar el lecho de la herida de desechos extraños y secretar enzimas proteolíticas 2.Las plaquetas activadas secretan una variedad de factores de crecimiento para estimular los queratinocitos en el borde de la herida para reepitelizar la zona herida. Los monocitos reclutados en el sitio de la herida diferencian en macrófagos que las bacterias fagocitosas y los neutrófilos muertos y secretan factores adicionales para mantener las señales proliferativas y pro-migratorias de queratinocitos. En la fase de proliferación, mientras continúa la reepitelización, el proceso de reconstrucción de nuevos tejidos de granulación compuestos de fibroblastos, monocitos/macrofagos, linfocitos y células endoteliales continúan el proceso de reconstrucción2. La angiogénesis se estimula promoviendo la proliferación y migración de células endoteliales, lo que resulta en el desarrollo de nuevos vasos. La epitelización y remodelación de la matriz extracelular construyen una barrera contra el medio ambiente. A medida que la herida se cura y el tejido de granulación evoluciona hacia una cicatriz, la apoptosis elimina las células inflamatorias, los fibroblastos y las células endoteliales sin causar daño adicional en los tejidos. La resistencia a la tracción del tejido se ve reforzada por la remodelación de fibroblastos de varios componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, por lo que el tejido recién formado es casi tan fuerte y flexible como la piel no herida2.

Cualquier desviación de esta progresión altamente concertada hacia el cierre de la herida conduce a heridas deterioradas y/o crónicas3. Las heridas crónicas se caracterizan por un aumento del estrés oxidativo, inflamación crónica, microvasculatura dañada y matriz de colágeno anormal en la herida4. El estrés oxidativo, especialmente en la herida, puede retrasar el cierre de la herida2,5. Cuando, en la primera etapa de la cicatrización de heridas, la fase inflamatoria se vuelve no regulada, el tejido huésped asume un daño extenso debido a una continua afluencia de células inflamatorias5 que liberan enzimas citotóxicas, un aumento de los radicales de oxígeno libre, y mediadores inflamatorios no regulados, resultando en la muerte celular6,7.

En este microambiente destructivo, las bacterias formadoras de biopelículas aprovechan los nutrientes del huésped y contribuyen al daño del tejido huésped2. Estas biopelículas son difíciles de controlar y eliminar porque las sustancias poliméricas extracelulares hidratadas compuestas de proteínas, ADN, ARN y polisacáridos permiten que las bacterias que se encuentran en su interior sean tolerantes a las terapias antibióticas convencionales y evadan la respuesta inmune innata y adaptativa del huésped2,8,9.

El estudio de las heridas crónicas es crucial porque afectan a 6,5 millones de personas y cuestan 40.000 millones de dólares al año solo en los Estados Unidos10. Los pacientes con diabetes tienen mayores riesgos de desarrollar heridas crónicas que requieren amputación para contener la propagación de la infección. Estos pacientes tienen un riesgo de mortalidad del 50% dentro de los 5 años siguientes a la amputación que se atribuye al mecanismo de fisiopatología de la diabetes11. La relación entre el sistema inmunitario del huésped y el microbioma en la cicatrización de heridas es un tema vital de la investigación en curso porque las consecuencias de las heridas crónicas, si no se resuelven, incluyen la amputación y la muerte12.

Aunque se ha invertido un esfuerzo significativo en la comprensión de cómo se desarrollan las heridas crónicas en los seres humanos, todavía no está claro cómo y por qué se forman heridas crónicas. Los experimentos para estudiar los mecanismos de curación deteriorada son difíciles de llevar a cabo en seres humanos, y los especialistas en curación de heridas solo ven pacientes con heridas crónicas que ya han alcanzado la cronicidad durante semanas o meses. Por lo tanto, los especialistas son incapaces de estudiar qué procesos salieron mal que llevan a que la herida se desarrolle para convertirse en crónica2. Hay una falta de modelos animales que recapitulen la complejidad de las heridas crónicas humanas. Hasta que nuestro modelo fue desarrollado, no existía ningún modelo para estudios crónicos de heridas.

El modelo de herida crónica se desarrolló en ratones que tienen una mutación en el receptor de leptina (db/db-/-)13. Estos ratones son obesos, diabéticos y tienen deterioro de la cicatrización, pero no desarrollan heridas crónicas14. Niveles de glucosa en sangre en promedio alrededor de 200 mg/dL, pero puede ser tan alto como 400 mg/dL15. Cuando se inducen altos niveles de estrés oxidativo (SA) en el tejido de la herida inmediatamente después de la herida, la herida se vuelve crónica16. Las heridas db/db-/- se consideran crónicas por 20 días y permanecen abiertas durante 60 días o más. Biofilm producido por bacterias se puede ver desarrollándose a partir de tres días después de la herida; una biopelícula madura se puede ver 20 días después de la herida y persiste hasta el cierre de la herida. Las bacterias formadoras de biopelículas que encontramos en estos ratones también se encuentran en heridas crónicas diabéticas humanas.

El estrés oxidativo es inducido por el tratamiento de las heridas con dos inhibidores de enzimas antioxidantes, catalasa y glutatión peroxidasa, dos enzimas con la capacidad de descomponer el peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno es una especie reactiva de oxígeno y puede causar daño celular a través de la oxidación de proteínas, lípidos y ADN. La catalasa cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en sustancias químicas menos dañinas oxígeno y agua. 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) inhibe la catalasa uniéndose específicamente y covalentemente al centro activo de la enzima, inactivando17,18,19. ATZ se ha utilizado para estudiar los efectos del estrés oxidativo in vitro e in vivo a través de la inhibición de la catalasa20,21,22,23,24. Glutathione peroxidase cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno a través del antioxidante, glutatión, y es una enzima importante que protege la célula contra el estrés oxidativo25. El ácido mercaptosuccinico (MSA) inhibe la glutatión peroxidasa uniéndose al sitio activo de selenocisteína de la enzima con tiol, inactivando26. MSA se ha utilizado para estudiar los efectos del estrés oxidativo in vitro e in vivo así20,27,28.

Este novedoso modelo de heridas crónicas es un modelo poderoso para estudiar porque comparte muchas de las mismas características observadas en las heridas crónicas diabéticas humanas, incluyendo la inflamación prolongada por el aumento del sistema operativo y la formación de biopelícula natural a partir del microbioma de la piel. Las heridas han deteriorado la interacción dérmica-epidérmica, la deposición anormal de la matriz, la mala angiogénesis y la vasculatura dañada. Las heridas crónicas se desarrollarán tanto en ratones masculinos como femeninos, por lo que ambos sexos se pueden utilizar para estudiar heridas crónicas. Por lo tanto, el modelo de herida crónica puede contribuir significativamente a avanzar en la comprensión fundamental de cómo comienzan tales heridas. El uso de este modelo de herida crónica puede proporcionar respuestas a preguntas fundamentales sobre cómo se inicia / logra la cronicidad a través de contribuciones de la fisiología de la cicatrización de heridas deterioradas y el microbioma del huésped.

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Protocol

Todos los experimentos se completaron de acuerdo con las regulaciones federales y las políticas y procedimientos de la Universidad de California han sido aprobados por la Universidad de California, Riverside IACUC.

1. Animal

  1. Use B6 diabético y obeso. BKS(D)-Ratones Leprdb/J para el modelo de herida crónica. Las opciones de compra incluyen heterocigotos para la cría o homocigotos directamente para experimentos.
  2. Criar machos y hembras heterocigotos para producir descendencia. Sólo una cuarta parte de la basura, estadísticamente, crecerá hasta convertirse en diabética y obesa (db/db-/-).
  3. Destete y casa db/db-/- ratones junto con sus littermates 3 semanas después del nacimiento. Separar los ratones db/db-/- de sus littermates 5 semanas después del nacimiento y casa con otros ratones db/db-/- hasta que tengan 5-6 meses de edad y se puedan utilizar para el modelo de herida crónica. Durante este tiempo, se puede desarrollar un microbioma de la piel maduro y complejo.
    NOTA: Los ratones db/db-/- se identifican visualmente a partir de camadas entre 3-5 semanas de edad. Los ratones db/db-/- son obesos, son diabéticos y serán significativamente más grandes y más rosados que el tipo salvaje y los habacotipos. Su abdomen puede aparecer ligeramente más rosado y sus caderas más grandes. Se debe confirmar el aumento de peso antes de la cirugía. Además, es posible medir altos niveles de glucosa en la sangre y genotipo del ratón para confirmar la mutación en el receptor de la leptina.

2. Vivarium y Husbandry

  1. Casa db/db-/- ratones en un vivario convencional (no una barrera / instalación libre de patógenos específicos) para que se pueda establecer una microflora en la piel de los ratones db/db-/-. Para modelar específicamente a los seres humanos que sufren de heridas crónicas, no tome precauciones especiales para prevenir la exposición a patógenos.
  2. Proteja las jaulas con tapas de micro-isolator para minimizar la propagación de la infección dentro del vivario. Cambie las jaulas dos veces por semana con ropa de cama nueva y alimente a los ratones con comida vivarium regular. No autoclave ni la ropa de cama ni la comida.
  3. Ajuste la temperatura ambiente a oscilar entre 21 y 24 oC, con pequeñas fluctuaciones dependiendo de la época del año. La humedad, que refleja el clima y la ubicación, oscilará entre el 19 y el 70%.

3. Requisitos para el desarrollo de heridas crónicas

  1. Utilice sólo ratones machos y hembras que sean fenotípicamente obesos, diabéticos y al menos 5-6 meses de edad para el desarrollo de heridas crónicas. El peso de estos ratones debe variar entre 40-80 g, promediando alrededor de 60 g.
  2. No utilice ratones que se consideren obesos pero que pesen menos de 50 g.
    NOTA: Todos los ratones mencionados en este protocolo superan las cualificaciones descritas aquí a menos que se indique lo contrario.

4. Afeitado y aplicación de loción depilatoria

NOTA: Retire el vello no deseado en el dorso del ratón antes de herirlo. El siguiente procedimiento se realiza en ratones vivos db/db-/- que no están bajo anestesia el día antes de la cirugía. Tome precauciones para prevenir el estrés y el daño al animal.

  1. Afeitar
    1. Coloque el ratón sobre una superficie limpia y agarre la base de la cola del ratón con el pulgar y el segundo dedo para asegurar la posición del ratón. El ratón puede saltar o hacer movimientos repentinos; si lo hace, responda rápidamente y tire hacia atrás de las pinzas para evitar lesiones.
    2. Afeitar el pelo del ratón con un cortapelos (Figuras 1A, 1B). Coloque la hoja paralela a la piel del ratón y afitúe toda la espalda desde el cuello hasta la cola, incluso alrededor de la cola, para permitir una superficie lo suficientemente grande como para colocar un apósito de película transparente (ver Tabla de Materiales). Ejecuta ligeramente la hoja contra la dirección del crecimiento del cabello para el corte más eficiente. (Figura 1B).
      1. No presione la hoja profundamente en la piel, ya que puede dañar la piel por hematomas o corte.
  2. Aplicación de loción depilatoria
    NOTA: Utilice loción depilatoria para obtener una piel muy lisa para que el apósito transparente pueda adherirse firmemente.
    1. Sumerja la piel del ratón con agua para evitar quemaduras químicas presionando ligeramente una toallita de papel empapada contra la piel alazada con suficiente presión para mojar el cabello ya cortado contra la piel.
    2. Mientras la piel esté húmeda, frote ligeramente la piel del ratón con una pequeña dollop de loción depilatoria (ver Tabla de Materiales)para 15-20 s(Figuras 1C, 1D). Esparce la loción por completo dondequiera que se haya cortado el cabello. Utilice más loción si el ratón es más grande.
    3. No aplique loción en las orejas del ratón, la cola o cerca de la cara. Si la loción se pone en las orejas o la cola, simplemente limpie con una toallita de papel húmedo hasta que se enrosque. Si la loción se pone en la cara del ratón, lave inmediatamente el ratón bajo el grifo de carrera o agua desionizada para evitar daños en los ojos, la nariz y la boca.
    4. Deje que la loción reaccione con el cabello durante 20-45 s adicionales después de la aplicación.
    5. Antes de enjuiciar, compruebe la finalización de la reacción depilatoria limpiando ligeramente la loción de la piel en varios lugares(Figura 1E)con un dedo enguantado o una espátula metálica delgada. La reacción es completa si la piel es rosada sin la presencia de pelo negro. Lo mejor es comprobar rápidamente que el cabello realmente se ha eliminado antes de ensuuar que encasillarse prematuramente y luego tener que aplicar loción de nuevo.
  3. Enjuague
    NOTA: Una vez verificada la finalización de la reacción de depilación, lave el ratón con grifo de carrera o agua desionizada para eliminar la loción depilatoria y evitar quemaduras químicas.
    1. Coloque el ratón sobre la mano enguantada izquierda y presione la base de la cola contra la palma de la mano con el pulgar izquierdo para evitar que el ratón se mueva. Cierre y enderezar el resto de los dedos izquierdos para evitar que el ratón muerda.
    2. Coloque el ratón para que la región de la cara/cabeza esté lejos de la corriente de agua y la corriente de agua tibia pueda caer detrás de la cabeza y sólo en la parte posterior. Rápidamente, pero suavemente frota la parte posterior del ratón con la mano enguantada derecha para lavar la loción.
    3. Una vez que la piel del ratón esté libre de la loción, limpie rápidamente el ratón con una toalla de papel para absorber la mayor parte del agua(Figura 1F).
  4. Cuidado después del afeitado y la depilación
    1. Compruebe y limpie cualquier loción depilatoria residual que pueda permanecer en las orejas y la cola con una toallita de papel mojado.
    2. Coloque el ratón de nuevo en su jaula individual y coloque la jaula en una almohadilla de calentamiento (40-45 oC) durante unos 30 minutos. El ratón debe volver al comportamiento normal, correr y acicalarse en pocos minutos.
    3. Casa cada ratón en una jaula separada durante toda la duración del experimento. La piel de los ratones ya no está protegida y puede ser fácilmente rayada y mordida por otros ratones.
    4. Dado que la loción depilatoria puede tener ligeros efectos irritantes que pueden interferir o alterar el proceso de cicatrización de la herida, espere 18-24 h antes de la cirugía para permitir que la piel del ratón se calme y el ratón se ajuste a la falta de pelo en su espalda.
  5. Eliminación del cabello de la piel con pigmentación oscura
    NOTA: Algunos ratones db/db-/- potencialmente tendrán parches oscuros en la piel que tendrán el cabello creciendo más rápido y más fuerte que la piel sin estos parches. (Figura 2A). Estas áreas oscuras de la piel parecen de color más oscuro debido a los folículos pilosos de la etapa anágena media tardía y/o incontinencia de pigmento29,30.
    1. Si se observan parches oscuros, aplique de nuevo la loción depilatoria, pero solo en estas áreas, y repita los pasos 4.2 y 4.3(Figuras 2B, 2C).
      NOTA: Los parches oscuros de la piel crecerán el cabello más rápido durante toda la duración del experimento, así que corta el cabello corto cada 3-5 días, cuando sea necesario. Un parche o dos lejos de la ubicación deseada de la herida es aceptable. Si la parte posterior del ratón está significativamente cubierta por estos parches oscuros, no utilice este ratón para el modelo de herida crónica.

5. Configuración del reactivo

NOTA: El desarrollo de heridas crónicas en ratones db/db-/- se logra mediante el tratamiento con inhibidores específicos de catalasa y glutatión peroxidasa, 3-amino-1,2,4-triazol (ATZ) y ácido mercaptosucapónico (MSA), respectivamente16 . El siguiente procedimiento detalla la dosis y la administración de la analgesia y los inhibidores en función del peso del ratón.

  1. Inyecte el analgésico Buprenex por vía intraperitoneal a 0,05 mg/kg de ratón en PBS estéril. Inyectar un volumen de 120 l para un ratón de 60 g aproximadamente 30 minutos antes de la cirugía. Administrar otra dosis 6 h después de la cirugía. Se puede administrar una dosis adicional según sea necesario.
  2. Inyectar ATZ por vía intraperitoneal a 1 g/kg de ratón en PBS estéril. Inyectar un volumen de 480 l para un ratón de 60 g aproximadamente 20 minutos antes de la cirugía. Inyecte la mitad del volumen en el lado izquierdo del abdomen y la otra mitad en el lado derecho.
  3. Depositar MSA tópicamente en la herida entre el apósito transparente y el tejido de la herida en 150 mg/kg de ratón en PBS estéril. Administrar un volumen de 60 l para un ratón de 60 g dentro de los 10 minutos después de la cirugía.

6. Cirugía

NOTA: El éxito del modelo de herida crónica se basa en condiciones no estériles. Estos ratones no están libres de gérmenes y están alojados en un vivario convencional. El microbioma bacteriano que reside en la piel es crucial para el posterior inicio y desarrollo de heridas crónicas tras el tratamiento con inhibidores de enzimas antioxidantes. Por lo tanto, la preparación prequirúrgica tradicional del sitio está contraindicada.

  1. Inyección intraperitoneal
    1. Asegure el ratón en la parte con la lenzonada del estante de la jaula y sostenga la cola con el ratón cómodamente de pie con la cabeza más baja que el cuerpo del ratón. Esto garantiza que intentamos mover los órganos internos lo más lejos posible del punto de inyección.
    2. Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen para evitar la inyección en la vejiga u otros órganos abdominales.
    3. Aspirar la aguja antes de la inyección.
  2. Tratamiento y anestesia
    1. Administrar Buprenex 30 min y ATZ 20 min antes de la cirugía, como se describe en los pasos 5.1 y 5.2.
    2. Coloque el ratón en un recipiente de plástico pequeño encima de una almohadilla de calentamiento caliente como se muestra en la Figura 3A durante aproximadamente 15-20 min. Proporcionar soporte térmico antes del procedimiento protege contra la mortalidad potencial.
    3. Coloque una toallita de papel o una toalla de papel sobre la parte superior del recipiente pequeño para contener mejor el calor. El ratón debe calmarse a medida que se calienta. Figura 3 B muestra los materiales necesarios para la cirugía.
    4. Coloque el ratón en un recipiente cerrado que esté conectado al vaporizador de isoflurano en la campana química si utiliza un sistema abierto.
    5. En un sistema abierto, administre 5% de isoflurano durante 1-2 min a un caudal de 2-3,5 L/min. Monitoree continuamente el estado del ratón.
      1. Una vez que el ratón esté inconsciente o ya no se mueva, coloque el ratón sobre una almohadilla quirúrgica blanca y coloque la cabeza con un cono nasal que se fija al vaporizador para permitir la administración continua de isoflurano durante la cirugía.
    6. En un sistema abierto, administrar 2-3% de isoflurano al mismo caudal durante la cirugía y ajustarse al flujo de isoflurano para mantener la profundidad de la anestesia.
    7. Minimizar tanto la concentración como la duración del isoflurano administrado durante la cirugía. db/db -/- Los ratones son muy sensibles a la anestesia por lo que es mejor mantener la exposición al isoflurano al mínimo. Si el ratón sigue respondiendo después de 2 min a 5% de isoflurano, asegure el cono nasal y administre 3-5% de isoflurano durante 15-30 s antes de comenzar la cirugía.
      1. Confirme la anestesia adecuada antes de herir. La profundidad de la anestesia se confirma por la falta de respuesta a estímulos físicos como el pellizco de dedo del dedo del sol fuerte. La duración del ratón bajo anestesia inhalada es inferior a 5 min por lo que no se aplica ningún pomada de veterinario a los ojos.
  3. Herir
    1. Rocíe una toallita de papel con 70% de etanol o una toallita de etanol clínica y limpie la parte posterior del ratón para limpiar el área del sitio de la herida. Limpie la superficie de la piel para que el apósito transparente pueda adherirse firmemente, ya que el polvo de la ropa de cama, los alimentos o la piel puede impedir que el apósito se pegue correctamente(Figura 4A). No se limpie excesivamente, o habrá riesgo de matar las bacterias presentes en la piel.
    2. Determinar la posición del sitio de la herida. El mejor lugar para realizar la herida es en el lado dorsal del ratón, centrado y lejos de parches de piel con mayor pigmentación.
      NOTA: Hemos determinado por experiencia que estos ratones sólo pueden soportar la carga de una herida.
    3. Crea una herida dentro de 30-45 s usando un punzón de biopsia de piel de 7 mm, pinzas y tijeras quirúrgicas. Presione ligeramente el punzón de biopsia en el sitio deseado de la herida y gire el golpe lo suficientemente profundo como para dejar una ligera impresión del punzón(Figura 4B). Exbozar la piel esbozada tirando hacia arriba del centro del punzón con pinzas y cortando a lo largo del contorno con tijeras quirúrgicas (Figuras 4C-4E).
    4. Cubra la herida firmemente con la mitad de un trozo de apósito de película transparente (6 cm x 3,5 cm).
    5. Detener la administración del 2% de isoflurano al ratón(Figura 4F).

7. Tratamiento y recuperación post-cirugía

  1. Administrar el tratamiento con MSA después de la cirugía se ha completado y se aplica el apósito transparente como se describe en el paso 5.3. Deposite MSA en el área de la herida debajo del apósito.
  2. Vuelva a colocar el ratón en el recipiente pequeño en la almohadilla de calentamiento durante 30 minutos para ayudar con la recuperación. Una vez que el ratón se haya calentado, vuelva a colocar el ratón en su jaula. El efecto del isoflurano es temporal, y el ratón debe moverse poco después.
  3. No deje ratones desatendidos ni los devuelva al vivario hasta que los ratones hayan recuperado suficiente conciencia para mantener la recumbencia esternal.
    NOTA: La anestesia de elección cuando se trabaja con estos ratones es isoflurano precisamente debido a su rápida inducción y posterior aparición de la anestesia.
    1. Ratones domésticos que se han sometido a cirugía individualmente para evitar que un ratón interfiera con la herida crónica de otro. Como se indicó anteriormente, no regresan al vivario hasta que se recuperen por completo.
  4. Administrar la segunda dosis de Buprenex 6 h después de la cirugía.
  5. Observe a los ratones cuidadosamente durante las primeras 48 horas después de la cirugía.
    NOTA: La cirugía, junto con los inhibidores para crear la herida crónica, es muy estresante para el animal que ya es tanto diabético como obeso. Los ratones que sobrevivan los primeros días después de la cirugía generalmente sobrevivirán a la duración del experimento.

8. Recopilación de datos, estrategias de supervivencia, manejo de los ratones después de las heridas, y consejos adicionales

  1. Recopilación de datos
    1. Tome fotografías tan pronto como sea inmediatamente después de la cirugía. Las biopelículas se observan en cualquier lugar entre 5-10 días después de la herida, y tan pronto como 3 días.
    2. Si las bacterias son el foco del análisis, rodar un intercambio estéril con presión ligera alrededor de la herida durante 10-15 s. Almacene el hisopo, en un medio congelador apropiado para el cultivo o seco sin ningún medio para el análisis de secuenciación independiente del cultivo, a -80 oC. Recoger sustancias poliméricas extracelulares a través de una espátula de metal estéril en un tubo de microcentrífuga y almacenar a -80 oC antes del análisis.
    3. No administre anestesia al ratón durante el manejo para la recolección de biopelículas o la toma de imágenes. Durante estos procedimientos, coloque un trozo de comida delante del ratón para calmar el ratón y evitar que se escapa. La mayoría de los ratones se subirán encima de la comida, se sentarán en ella y no se moverán.
  2. Como las infecciones secundarias y las heridas o úlceras crónicas no intencionales pueden desarrollarse si el ratón no se mueve correctamente o si el apósito no se aplica correctamente, compruebe periódicamente la actividad del ratón y del lado ventral en busca de úlceras. La fricción entre la piel y la ropa de cama húmeda (los ratonesdb/db-/- son poliucácicos) pueden perturbar la piel si las jaulas no se cambian con frecuencia.
    NOTA: La acumulación de líquido debajo del apósito puede hacer que el adhesivo pierda su adherencia y permita que el líquido se filtre. Las células muertas de la piel, la ropa de cama y la materia fecal pueden pegarse a la piel y endurecerse. Estos parches secos y agregados en la piel deben eliminarse rápidamente para prevenir una infección secundaria.
  3. Si los ratones se paran o se sentan sobre sus patas traseras, mueva estos ratones a una jaula donde el acceso a alimentos y agua es mucho menor. Si la posición de los alimentos y el agua en la jaula es alta, el ratón puede ponerse de pie o sentarse en sus patas traseras para alcanzarlo. La mayoría de los ratones no tendrán problemas para comer y beber si podrían hacerlo antes de la cirugía, aunque existe la posibilidad de que algunos ratones se volteen sobre sus espaldas. Estas "aletas" pueden tener grandes dificultades para voltearse, por lo que necesitarán ayuda y un mayor seguimiento.
  4. Deje el apósito transparente sobre la piel durante un máximo de 20 días si la piel está libre de escombros, piel de flakey y cabello. Si alguno de estos se produce en la piel, retire el apósito viejo y aplique una nueva pieza.
    1. Para quitar el apósito, pellizca ligeramente la piel directamente detrás de la cabeza, luego tira del apósito lejos de la cabeza en un movimiento suave.
    2. Para colocar un trozo de apósito de forma segura, haga que el ratón se quede lo más quieto posible. Es importante que la piel esté limpia y libre de células muertas de la piel, polvo de la ropa de cama y trozos de comida. Coloque y luego presione el apósito en la piel alrededor de la herida para asegurarlo.
    3. Si colocar un trozo de comida delante del ratón no limita sus movimientos, coloque el ratón encima de la jaula de alambre. Una vez que el ratón haya agarrado un riel en la jaula, sostenga la cola lo más cerca posible del cuerpo y tire con una fuerza mínima. A medida que el ratón tira hacia adelante, la espalda se estirará y enderezará para una fácil aplicación; coloque el apósito firmemente en este punto.
    4. Nunca vuelvas a usar un apósito viejo. Aplicar siempre un apósito nuevo en la parte posterior para una mayor adherencia.

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Representative Results

La Figura 5 muestra un ejemplo de una herida sin tratamiento de inhibidores que progresan hacia el cierre de la herida y una herida con tratamiento de inhibidores que progresan hacia la cronicidad. El apósito transparente se ha dejado en su lugar en la herida crónica para que se pueda ver la biopelícula y la acumulación de líquido.

El inicio crónico de la herida tiene lugar en menos de 6 horas y el margen de la herida se altera visiblemente por el estrés oxidativo. La evidencia histológica de este margen de la herida revela que el tejido es necrótico y no participará en la cicatrización de heridas. Las bacterias formadoras de biopelículas en la herida pueden utilizar más tarde este tejido necrótico como fuente de nutrientes y componentes estructurales para producir biopelícula. Una herida crónica es una herida que permanece abierta, agrandada en comparación con la herida inicial, contiene biopelícula (EPS más bacterias patógenas que se encuentran en las heridas crónicas humanas) y tarda meses o años en sanar dependiendo de la cantidad y el contenido de la biopelícula que previene la herida de resolverse normalmente. En el modelo de herida crónica, la cronicidad completa se establece en > 20 días después de la cirugía porque las heridas no tratadas con los inhibidores se cerrarán en este momento(Figura 5). La curación suele tardar > 60 días y el tiempo depende de las bacterias patógenas primarias presentes en la herida. A veces, los ratones pueden sucumbir a la infección cuando predominan las bacterias más agresivas que forman biopelículas, como Pseudomonas. Por lo tanto, una herida crónica se define como una herida que no se cerrará dentro de 20 días, tarda más de 60 días en sanar, y tiene biopelícula presente en la herida.

Se han encontrado diferencias de sexo en varios modelos de diabetes, incluyendo el modelo de ratón db/db-/- 32,33. Si bien tales diferencias existen, hemos observado que el sexo no es un factor significativo en el desarrollo de heridas crónicas. Las heridas crónicas en ratones macho sin mujer se desarrollan en una medida similar, por lo que ambos sexos se pueden utilizar para estudiar heridas crónicas. Por lo tanto, la utilización de este modelo es ventajosa ya que las heridas crónicas humanas se pueden encontrar en pacientes diabéticos masculinos y femeninos.

Figure 1
Figura 1 . Proceso de afeitado y depilator. (A) El ratón antes de afeitarse. (B) La piel del ratón se asempide para eliminar la mayor parte del cabello en la espalda. (C) Una dollop de loción depilatoria en la punta de un dedo. Se utiliza más si el ratón es más grande. (D) La parte posterior del ratón está cubierta con loción depilatoria y se deja reaccionar. (E) Una espátula se utiliza para raspar parte de la loción para ver si se ha quitado el cabello. La piel rosa brillante sin presencia de pelo es indicativa que la depilación está completa. (F) La loción en la parte posterior se retira con agua corriente. La piel del ratón debe ser ligeramente rosada. Esta cifra ha sido modificada de Kim y Martins-Green31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Eliminación del vello de los parches más pequeños de la piel oscura. (A) El ratón ya ha sido tratado una vez y la piel se humedece de nuevo para evitar quemaduras. (B) Loción depilatoria sólo se aplica sobre el parche de la piel que es oscuro y tiene el pelo denso. (C) La loción se lava después de la reacción para revelar el parche oscuro de la piel sin pelo. Esta cifra ha sido modificada de Kim y Martins-Green31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Pre-cirugía configurada. (A) Los ratones que van a ser heridos se colocan en pequeños recipientes de plástico en la parte superior de una almohadilla de calefacción. (B) Se muestran algunos de los materiales utilizados en la cirugía. Las tijeras quirúrgicas deben ser afiladas para asegurar que la piel no se aplaste cuando se corta. El apósito transparente se corta por la mitad. Esta cifra ha sido modificada de Kim y Martins-Green31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Haciendo la herida de escisión. ( A ) Despuésdeque el ratón esté bajo anestesia, la parte posterior del ratón se limpia con 70% de etanol una vez. (B) El punzón de biopsia de piel se coloca en la parte posterior del ratón y presiona lo suficientemente fuerte como para dejar una impresión. El punzón de biopsia se puede girar para hacer una incisión superficial. (C) El centro de la zona esbozada se pellizca con pinzas y se utiliza una tijera quirúrgica afilada para hacer la incisión inicial. (D) Las tijeras quirúrgicas se maniobran para cortar a lo largo del contorno hecho por el punzón de biopsia. (E) Una región de la piel esbozada por la bomba de biopsia se extirpa con éxito. (F) El apósito transparente se coloca en la parte posterior del ratón y se fija. Esta cifra ha sido modificada de Kim y Martins-Green31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Fotos de heridas. (A) La herida en un ratón en momentos sucesivos después de la cirugía a medida que avanza a la crónica a partir del día de la cirugía. Biofilm puede ser visto tan pronto como el día 5 y detectado tan pronto como el día 3. La herida es completamente crónica con biofilm fuerte el día 20. (B) Ejemplos de heridas crónicas humanas, específicamente úlceras de pie diabético. Esta cifra ha sido modificada de Kim y Martins-Green31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Una vez que se crean heridas crónicas en ratones, el modelo se puede utilizar para estudiar los procesos de cicatrización de heridas deteriorados involucrados en el inicio de la cronicidad. El modelo también se puede utilizar para probar la eficacia de una amplia gama de productos químicos y medicamentos que pueden revertir el desarrollo de heridas crónicas y la cicatrización deteriorada y conducir al cierre y la cicatrización de la herida. Se pueden estudiar diferentes puntos de tiempo después de la aparición de la cronicidad: por ejemplo, los días 1-5 después de la herida para el inicio temprano de la cronicidad y los días 20 y más allá para heridas crónicas de plena fuerza.

El modelo de herida crónica es también un modelo poderoso para estudiar varios aspectos de la cicatrización de heridas y complicaciones como la biocarga y la caquexia. Biocarga es sólo una de las muchas facetas de las heridas crónicas que se pueden estudiar en este modelo, ya que también afecta a las heridas crónicas humanas. Nuestros procedimientos y el Protocolo de Uso Animal identifican claramente la sintomatología a monitorear, junto con un cronograma de monitoreo definido. Los animales identificados como morbosos, basados en criterios aprobados por la IACUC, son eutanasiados para evitar sufrimientos significativos. Además, se consulta al Médico Veterinario del Campus y al Técnico de Sanidad Animal cuando surgen ciertas sintologías y proporcionan orientación de apoyo en la evaluación de los criterios.

Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen la vivienda de los ratones db/db-/- en un vivario convencional, la eliminación del cabello con loción depilatoria y el calentamiento antes de la administración de isoflurano. El desarrollo de heridas crónicas en el modelo de heridacrónica se basa en condiciones y prácticas no estériles. Estos ratones no están libres de gérmenes y no crecen en vivarios muy limpios. La microflora que reside en la piel es crucial para el posterior inicio y desarrollo de heridas crónicas tras el tratamiento con inhibidores de las enzimas antioxidantes. Estos ratones db/db-/- deben estar expuestos a un entorno que contenga bacterias, tanto comensales como patógenas. Si la piel se limpia y se desinfecta con yodo u otros métodos antisépticos antes de la cirugía con el fin de "esterilizar" la piel, la herida puede no volverse crónica. Las bacterias en el microbioma de la piel son necesarias para la formación y desarrollo de biopelícula, y retrasar la cicatrización y el cierre de la herida. En la clínica, la presencia de biopelícula en una herida complica aún más los procesos de cicatrización de heridas y aumenta el riesgo de amputación en humanos si la infección en la herida no está controlada.

Eliminar el cabello con loción depilatoria es un paso importante para eliminar el exceso de cabello y permitir una superficie lisa y limpia para que el apósito transparente se adhiera firmemente. La loción depilatoria utilizada en este protocolo es un depilatorio químico con aloe añadido para minimizar las quemaduras. Este producto es mínimo en alterar la morfología de la piel, así como en la preservación del microbioma de la piel. El producto enumerado en la Tabla de Materiales se recomienda sobre otros productos de eliminación del cabello, incluyendo depilatorios físicos y mecánicos (ceras y depiladores comerciales) que pueden quemar y remolcan aún más la piel y/o matar el microbioma de la piel. A pesar de que este depilatorio químico es físicamente suave, todavía puede irritar ligeramente la piel, un efecto que podría alterar los procesos de cicatrización de la herida. Por lo tanto, es más eficaz esperar 18-24 horas antes de la cirugía para permitir que la piel se recupere del procedimiento y asegurar que la piel y la herida no se vean afectadas por ella.

Estos ratones son extremadamente dóciles y no responden a los factores estresantes. Son muy fáciles de manejar sin anestesia. Son lo suficientemente tranquilos como para colocar en una palma o en la parte superior de un banco sin huir. Si la base de la cola del ratón está asegurada con el pulgar y el segundo dedo, el ratón no será capaz de huir o volver hacia atrás para morder debido a su gran tamaño de vientre. Es importante destacar que, en nuestra experiencia, estos ratones son extremadamente sensibles a la anestesia, especialmente en lo que se refiere a la pérdida de homeostasis. Por lo tanto, en consulta con nuestra IACUC, se determinó que la mejor opción es limitar la administración anestésica.

El propósito principal de este modelo es crear una gran herida no cicatrizada en su espalda, por lo que una vez que se hace una herida, sostener un ratón convencionalmente para hacer inyecciones IP de buprenex adicional u otros tratamientos químicos periódicamente es imposible. Sostener el ratón por la piel dorsal causa al ratón una gran cantidad de molestias y muy posiblemente dolor si el ratón se mantiene de una manera tan tradicional; por lo tanto, toda la inyección con el ratón del lado derecho hacia arriba mientras está de pie en los cuatro pies. Otros experimentos que utilizan la cepa db/db-/- utilizan estos ratones cuando son más jóvenes y no pesan tanto, por lo tanto, la forma tradicional de realizar una inyección IP puede utilizar. Dado que el modelo de herida crónica utiliza ratones de hasta 6 meses de edad y estos ratones pueden pesar hasta 80 g, el método convencional no es óptimo y potencialmente puede dañar al ratón. Hemos utilizado el método descrito anteriormente para un ratón tan obeso y no hemos observado ningún resultado adverso cuando se inyecta con este método con una aspiración exitosa.

Anteriormente, se utilizaba anestesia inyectable como la ketamina y la xilazina; sin embargo, resultaron difíciles de usar con ratones db/db-/-. Con un tiempo total de operación de menos de 5 minutos, el largo tiempo de inducción y recuperación no era necesario para los fines del experimento. Se determinó que el isoflurano era la mejor opción de anestesia para este procedimiento debido a una fácil administración y valoración, inicio y recuperación rápidas, y una profundidad anestésica adecuada. Además, el isoflurano causa una depresión cardíaca mínima y mantiene muy bien la presiónarterial 34. Por lo tanto, un cambio importante en el procedimiento para el modelo de herida crónica fue utilizar isoflurano como la anestesia preferida.

El calentamiento antes de la cirugía es importante para prevenir la mortalidad en los 2-3 días después de la cirugía. Estos ratones tienen una temperatura corporal del núcleo significativamente más baja35 y no son capaces de controlar su temperatura corporal central de manera efectiva debido a su manipulación genética, por lo que se proporciona una fuente de calentamiento externa antes de la cirugía para proteger contra la caída adicional en la temperatura corporal del núcleo inducida por la anestesia. Hemos evaluado la necesidad de una almohadilla de calentamiento antes, durante y después de la cirugía. Es importante tener en cuenta que los ratones db/db-/- tienen respuestas fisiológicas inusuales. Empíricamente, hemos encontrado que estos ratones están protegidos más eficazmente con soporte térmico pre y postquirúrgico. Al sustituir el isoflurano como anestésico, medimos y determinamos que la temperatura corporal central no disminuyó significativamente durante los menos de cinco minutos de cirugía. Si bien hemos encontrado que el soporte térmico pre y postquirúrgico es crítico para estos ratones, no hemos encontrado que el soporte térmico quirúrgico tenga un efecto. Cabe señalar que el Presidente de la UICUC proporcionó orientación y supervisó nuestras pruebas relacionadas con la temperatura y los efectos anestésicos. Al comunicar este método, nos parece importante indicar lo que es necesario para el éxito del procedimiento.

Una limitación de la utilización de este método para estudiar el desarrollo de biopelículas es el hecho de que las bacterias presentes en la herida y la producción de la biopelícula no están controladas. Si se va a estudiar una bacteria específica que forma biopelículas, este modelo puede ser útil si el microbioma nativo puede ser abolido antes de herir ya sea a través de yodo u otros métodos antisépticos. En respuesta a los niveles excesivos de estrés oxidativo, se estimulan bacterias patógenas clave en el microbioma de la piel para iniciar la formación de biopelículas. En nuestras heridas crónicas, las bacterias formadoras de biopelículas incluyen, pero no se limitan a, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38 , 39, y varios Staphylococcus40,41 y Corynebacterium especies 41,42,43,44, 45, todos los cuales se pueden encontrar en heridas crónicas humanas. Se han realizado varios estudios crónicos de microbioma de heridas en heridas crónicas humanas para las bacterias39,40,41,43,44,45 , y hongos46,47 comunidad, incluyendo encuestas longitudinales asociadas con mala curación48,49. Los estudios longitudinales de esta naturaleza también se pueden seguir a través del modelo de herida crónica.

Es importante reconocer que se pueden obtener resultados diferentes debido a diferencias en las condiciones de la vivariante, los suministros y el equipo, los proveedores y las colonias de origen para ratones db/db-/-. Para minimizar estas diferencias, proporcionada en el protocolo es la variedad exacta de ratones y la fuente que se utiliza para el experimento de herida crónica. Para la cría de estos ratones, las marcas exactas de ropa de cama y alimentos se han proporcionado en la Tabla de Materiales para limitar la variabilidad. En nuestros experimentos, encontramos que el alto estrés oxidativo es necesario y suficiente para crear heridas crónicas en estos ratones, siempre y cuando los ratones estén alojados en un vivario convencional y expuestos a bacterias. Las poblaciones y comunidades bacterianas pueden diferir con la vivaria; sin embargo, siempre y cuando una instalación libre de gérmenes no se utiliza para albergar a los ratones, deben tener suficientes bacterias, tanto comensales como patógenas, para residir en el cabello y la piel.

Este método de creación de heridas crónicas en este protocolo es significativo para estudiar heridas crónicas y cicatrización de heridas deterioradas porque sólo los niveles de estrés oxidativo se alteran significativamente experimentalmente. Se requiere estrés oxidativo para los procesos normales de cicatrización de heridas2. Es importante para la regulación oportuna y un componente crucial en la funcionalidad de las células necesarias para la cicatrización de heridas5. Sin embargo, cuando los niveles de estrés oxidativo no están controlados, las especies reactivas de oxígeno pueden dañar las células de endotelia, inhibir la funcionalidad del queratinocito y retrasar el cierre de la herida2,5. Las heridas crónicas humanas tienen altos niveles de estrés oxidativo50. El modelo de ratón tiene alta glucosa en sangre y ya mayores niveles de estrés oxidativo debido a su morbilidad. Estas características se comparten con los seres humanos que viven con la diabetes y proporcionan un microambiente propicio para la cronicidad después de sufrir una lesión50. Los seres humanos también albergan microbiota diversa y compleja en muchos lugares del cuerpo, incluyendo la piel, por lo que se permite que se desarrolle un microbioma complejo, pero natural, en la piel del ratón.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores no tienen reconocimientos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

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