Summary
Un protocole afin de renforcer les signaux ion glucides en spectrométrie de masse MALDI par réformer des structures cristallines au cours du processus de préparation d’échantillon est démontré.
Abstract
Préparation de l’échantillon est un processus critique dans l’analyse de spectrométrie de masse (MS) des glucides. Bien que la désorption /-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) MS est la méthode de choix dans l’analyse de glucides, reproductibilité de signaux et de données poor ion d’échantillons d’hydrates de carbone continuent d’être graves problèmes. Pour une analyse quantitative des hydrates de carbone, un protocole d’analyse efficace offrant la qualité des données supérieure est nécessaire. Cette vidéo montre des protocoles de préparation d’échantillon pour améliorer l’intensité du signal et de minimiser les variations de données des hydrates de carbone en MALDI-MS. Après séchage et cristallisation des gouttelettes de l’échantillon, la morphologie des cristaux est réformée par le méthanol avant l’analyse par spectrométrie de masse. L’augmentation de signal de glucides est examinée avec la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI (IMS). Les résultats expérimentaux montrent que réforme de cristal ajuste les structures cristallines et redistribue les analytes d’hydrates de carbone. En comparaison avec la méthode de préparation sèche de gouttelette dans classiques MALDI-MS, réforme morphologies de cristal de glucides avec méthanol montre nettement meilleure intensité du signal, distribution d’imagerie ion et la stabilité des données. Étant donné que les protocoles démontrés ci-après n’impliquent pas de modifications dans la composition de l’échantillon, ils sont généralement applicables aux divers hydrates de carbone et les matrices.
Introduction
Analyse des glucides est un sujet important et difficile. Hydrates de carbone et leurs dérivés jouent un rôle important dans vivant organismes1,2,3. Ces molécules ont compliqué les structures et ont tendance à se décomposer. Beaucoup d'entre eux ne peuvent être qualifiés de manifestement en raison de difficultés dans la séparation et la détection. Bien que la spectrométrie de masse (MALDI) de désorption-ionisation laser assistée par matrice (MS) a été appliquée à l’analyse d’un large éventail de biomolécules, en raison de sa sensibilité et de résultats compréhensibles4, analysant les hydrates de carbone à l’aide de MALDI-MS continue pour être un défi majeur en raison de l’efficacité de l’ionisation faible de ces molécules5. Dérivatisation chimique est une méthode commune pour améliorer l’efficacité d’ionisation de glucides6,7, mais ces procédures sont temps et consommation d’échantillon. En outre, l’efficacité de l’ionisation des dérivés de glucides est toujours inférieure à celui des protéines. Ainsi, le développement de méthodes pour améliorer le signal de glucides en MALDI-MS sans procédures compliquées est nécessaire.
L’application de MALDI-MS à l’analyse quantitative est un autre sujet difficile. Un problème majeur de MALDI-MS est que sa sensibilité et données reproductibilité s’appuie critique sur les protocoles de préparation témoin et paramètres expérimentaux. Dans de nombreux cas, une analyse quantitative par MALDI-MS n’est pas fiable en raison des morphologies échantillon hétérogène et de la distribution de l’analyte. Un exemple bien connu est échantillons préparés avec une matrice MALDI (DHB) acide de 2, 5-dihydroxybenzoïque. Lorsque DHB est cristallisé lentement dans l’environnement ambiant, l’étendue de l’analyte incorporation dans les cristaux de la matrice est imprévisible, parce que les échantillons qui en résulte montrent morphologies irrégulières. Ces échantillons se composent normalement de gros cristaux aciculaires et fines. Lorsque DHB est préparée à l’aide d’un solvant volatil ou une plaque de prélèvement chauffée, un procédé de séchage rapide entraîne des cristaux bien plus homogènes et mieux les résultats quantitatifs8,9,10. Cette technique est appelée « recristallisation » des échantillons MALDI. L’amélioration est attribuée à la meilleure incorporation d’analytes en cristaux de matrice fine durant le processus de cristallisation rapide. Nous avons aussi démontré que l’environnement de préparation d’échantillon de réglage réduit l’hétérogénéité du signal de glucides et une amélioration des résultats quantitatifs11,12. Les conclusions de ces travaux suggèrent que la morphologie de l’échantillon est un facteur critique dans la détermination de la qualité du signal de glucides. Élaborer une stratégie générale pour l’analyse de tous les jours, il faut une exemple efficace de la méthode de la réforme fournissant des glucides améliorée sensibilité.
Nous avons examiné systématiquement la corrélation entre la sensibilité échantillon de morphologie et hydrates de carbone en MALDI-MS dans un récent rapport13. Les résultats obtenus à l’aide de plusieurs glucides importants et matrices spectacle que la meilleure mise en valeur de signal est remplie de recristalliser séché échantillons MALDI. La morphologie des échantillons préparés selon la méthode conventionnelle sèche de gouttelette (DD) est réformée par recristallisation rapide avec du méthanol (MeOH). Les protocoles de préparation d’échantillon détaillé sont illustrés ici. Le protocole se compose de trois étapes principales, y compris l’échantillon plaque préconditionnement, le dépôt de l’échantillon et recristallisation et analyse par spectrométrie de masse. Les hydrates de carbone utilisés incluent sialyl-lewis un (SLeA) et maltoheptaose (MH). DHB est utilisé comme une matrice de modèle. Les résultats montrent que l’intensité du signal de glucides et la distribution spatiale amélioraient nettement après recristallisation. Une telle méthode peut être appliquée à des échantillons avec autres matrices populaires, y compris 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) et α- cyano-4-hydroxycinnamique. Cette méthode est une approche générale qui peut être facilement intégrée dans la routine de laboratoire pour l’analyse des glucides.
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Protocol
1. échantillon plaque préconditionnement
-
Nettoyage de la plaque d’échantillon
- Porter des gants en nitrile pour éviter toute contamination de la plaque d’échantillon pendant le nettoyage.
- Lavez la plaque échantillon 100,0 ml d’une solution détergente (1,0 mg/mL).
- Lavez la plaque de l’échantillon avec de l’eau distillée-eau désionisée (DDW).
- Rincer la surface de la plaque échantillon avec 30,0 mL de MeOH.
- Mettre la plaque de l’échantillon dans un bécher de 600 mL et le remplir avec DDW jusqu'à ce que la plaque d’échantillon est complètement immergée dans l’eau.
- Placer le bécher dans un ultrasonique baignoire (voir Table des matières) et laisser agir la plaque échantillon pendant 15 min (200 W, 40 kHz).
- Sortez la plaque de l’échantillon et de souffler les gouttes d’eau à l’aide d’azote sous pression.
- Gisement de 0.2 µL de MeOH sur la plaque d’échantillon pour vérifier si MeOH se propage à d’autres endroits.
Remarque : Si MeOH fusionne avec d’autres taches, répétez les étapes 1.1.3-1.1.5 ; Si ce n’est pas le cas, passez à l’étape suivante.
-
Régulation de la température de la chambre de séchage
- Utiliser une chambre de séchage dans des conditions stables pour sécher les gouttelettes, comme décrit plus haut11,12,13. En particulier, utilisez la procédure détaillée décrite aux points 2.1 à 2.5 d’UO, Y.-M. et al. 12de 2016. Brièvement :
- Purger la chambre de séchage en azote de la température ambiante à un débit constant de maintenir un environnement de faible humidité relative.
- Garder l’échantillon plaque température constante à ordinaire - (25 ° C) ou des conditions de séchage rapide (50 ° C), régulée par un bloc de cuivre température contrôlée dans la chambre de séchage.
- Utiliser une chambre de séchage dans des conditions stables pour sécher les gouttelettes, comme décrit plus haut11,12,13. En particulier, utilisez la procédure détaillée décrite aux points 2.1 à 2.5 d’UO, Y.-M. et al. 12de 2016. Brièvement :
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Préparation des solutions de matrice et l’analyte
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Préparation des solutions de matrice
- Dissoudre le DHB dans 50 % d’acétonitrile (ACN) : 50 % DDW pour préparer une solution 0,1 M.
-
Préparation d’analytes de glucides
- Dissoudre le SLeA à DDW pour préparer une solution de M-4 10.
- Dissoudre la MH dans DDW pour préparer une solution de 10-4 M.
-
Préparation des solutions de matrice
2. dépôts et recristallisation de l’échantillon
Remarque : Les procédures optimisées pour l’analyse de petites quantités d’échantillons réguliers sont décrites ici. Veiller à ce que la température de la plaque d’échantillon est stabilisée à la température désirée avant de déposer les solutions. Si l’échantillon s’étend sur une grande surface pour couvrir les autres points de l’échantillon au cours de la recristallisation, préparer un nouvel échantillon ou répétez l’étape 1.1.
-
Pour l’analyse d’une petite quantité (0,1 µL) de l’échantillon
Remarque : les étapes suivantes ont été élaborées pour minimiser la consommation de l’échantillon et le temps. Elle est destinée à l’analyse quantitative des échantillons réels avec une quantité limitée ou IMS rapide pour l’analyse de la quantification.- Prémélanger 0,25 µL de solution DHB et 0,25 µL de SLeA ou solution MH dans un tube de microcentrifuge.
- Vortex solution mixte à l’aide d’un agitateur Vortex pour 3 s.
- Tournez en bas la solution mélangée dans une mini centrifugeuse pendant 2 s (2000 x g).
- Utiliser une pipette pour faire ressortir 0.1 µL de la solution prémélangée et de déposer immédiatement sur la plaque de l’échantillon.
Remarque : Lors du dépôt d’une petite quantité d’échantillon, Ne pas conserver la solution prémélangée dans l’embout de la pipette pour plus de 10 s. - Attendez que l’échantillon se dessécher. Les durées de séchage typiques sont énumérées au tableau 1.
- Utiliser une pipette pour déposer 0.2 µL de MeOH droite sur la place de l’échantillon séché. Obtenez l’échantillon humide et sécher immédiatement.
Remarque : S’assurer que la procédure de dépôt est terminée en 3 s pour éviter les pertes par évaporation importante de MeOH. - Examiner l’échantillon à l’aide d’un microscope. Si les morphologies de cristal ne sont pas comme prévu (voir Figure 1 , par exemple des résultats souhaités), répétez les étapes 2.1.1-2.1.6 de préparer un nouvel échantillon.
- Porter des gants en nitrile et retirer avec précaution la plaque d’échantillon de la chambre de séchage.
-
Pour l’analyse d’une quantité régulière (1 µL) de l’échantillon
Remarque : Les étapes suivantes sont mis au point pour maximiser l’homogénéité des échantillons de glucides avec quantité d’échantillon utilisée généralement MALDI. Le processus est destiné à la routine et des analyses quantitatives. Le processus de recristallisation redistribue les échantillons et matrices uniformément de grandes surfaces.- Prémélanger 2,5 µL de solution DHB et 2,5 µL SLeA ou solution MH dans un tube de microcentrifuge.
- Vortex la solution prémélangée avec un Vortex pendant 5 s.
- Tournez en bas la solution mélangée dans une mini centrifugeuse pendant 2 s (2000 x g).
- Utiliser une pipette pour faire ressortir 1,0 µL de la solution prémélangée et de déposer immédiatement sur la plaque de l’échantillon.
Remarque : ne sont pas utilisation restant prémélangée solution à nouveau après le dépôt des échantillons. - Attendez que l’échantillon se dessécher. Les durées de séchage typiques sont énumérées au tableau 1.
- Utiliser une pipette pour déposer 1,5 µL de MeOH droite sur la place de l’échantillon séché. Obtenez l’échantillon humide et sécher immédiatement.
Remarque : En cas de température de la plaque échantillon élevée (50 ° C), l’étape de recristallisation devrait être faite à moins de 5 s pour minimiser l’évaporation de MeOH dans la pointe de pipette. - Examiner l’échantillon à l’aide d’un microscope. Si les morphologies de cristal ne sont pas comme prévu (voir Figure 1 , par exemple des résultats souhaités), répétez les étapes 2.2.1-2.2.6 de préparer un nouvel échantillon.
- Porter des gants en nitrile et retirer avec précaution la plaque d’échantillon de la chambre de séchage.
3. données de spectrométrie de masse Acquisition et analyse
Remarque : L’analyse est réalisée à l’aide d’un spectromètre commercial de masse de temps de vol (Table des matières) équipé d’une source d’ions MALDI. L’appareil est utilisé par le logiciel de contrôle spécifique (Table des matières) avec extraction pré-optimisée retard et laser de l’énergie. Les spectres sont enregistrés en mode linéaire avec une gamme de masses de m/z = 0 – 1500. La plaque d’échantillon potentielle est ± 25 keV et chaque spectre est en moyenne 10 tirs lasers. Utilisateurs doivent effectuer l’optimisation de l’instrument et l’analyse de l’échantillon à l’aide de logiciels compatibles et suivez les instructions du fabricant de l’instrument.
- Ouvrez le logiciel de contrôle d’instrument (voir Table des matières).
- Insérer la plaque d’échantillon dans le spectromètre de masse.
- Sélectionnez la méthode d’acquisition de données pré-optimisée dans le logiciel.
- S’inscrire à la région de l’ensemble de l’échantillon d’IMS en utilisant le logiciel d’imagerie (voir Table des matières).
Remarque : Sautez cette étape si ce n’est faire IMS. - Commencer d’acquisition de données en mode batch du logiciel de contrôle.
- Tracer les images d’ion en utilisant le logiciel d’imagerie, après que l’acquisition de données est terminée.
- Analyser les spectres de masse à l’aide de logiciels d’analyse (voir Table des matières) si les données sont enregistrées sans une image d’ion.
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Representative Results
Images de SEM représentatives de SLeA mélangé à DHB préparé en utilisant DD et méthodes de recristallisation sont indiquées à la Figure 1. Une morphologie typique de DHB tel qu’établi par la méthode DD est gros cristaux aciculaires à la jante et les fines structures cristallines dans le Centre des taches de l’échantillon. Les longueurs typiques de ces cristaux aciculaires sont ~ 100 µm. Après recristallisation de MeOH, l’échantillon a une plus grande surface uniformément recouverte de fins cristaux comme. Les longueurs des cristaux « flake » sont à peu près 20 à 50 µm. les échantillons recristallisé offrent de grandes surfaces efficaces que celles produites par des échantillons DD classiques.
Les résultats de l’IMS indiquent que comme cristaux entraîne généralement une plus forte intensité de signal de glucides et une répartition plus homogène. Dans des échantillons de DD classiques, glucides ion signaux sont distribués principalement à la périphérie des taches de l’échantillon. La figure 2 montre les résultats d’IMS d’ElsA et MH avec et sans recristallisation MeOH. Après recristallisation, la distribution de SLeA et MH signaux match bien avec l’image de lumineux-zone d’échantillon taches. Tous les glucides recristallisés échantillons montrent aussi, des améliorations significatives intensité du signal sur les résultats obtenus à partir des échantillons DD. En raison de la plus grande intensité de signal et de l’homogénéité, recristallisation améliore nettement la qualité des données en analyse quantitative.
Renforcer intensité de signal de glucides par recristallisation est efficace pour les deux modes d’ions positifs et négatifs. Figure 3 compare l’intensité du signal de sodiated (mode d’ions positifs) et des glucides (mode d’ions négatifs) déprotoné de recristallisés échantillons par rapport à celle des échantillons DD. En moyenne, recristallisation de SLeA et échantillons de MH augmente sodiated signaux par un facteur de 3,9 et 3.3, respectivement. Pour déprotoné SLeA, signal ion est généralement renforcée par un facteur d’environ 4,7 après recristallisation.
Figure 1. Images de SEM de SLeA préparé avec matrice DHB. Les échantillons sont préparés avec les méthodes de gouttelettes et de recristallisation séchées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Des résultats représentatifs de spectrométrie de masse image de SLeA et MH préparé avec séché méthodes gouttelette et recristallisation. Ion images représentent des distributions d’analytes sodiated ou déprotonée. Toutes les images de champ lumineux et ion sont affichent dans la même échelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Intensité de signal de hydrate de carbone obtenus avec les méthodes de préparation d’échantillon différent. Noire : sodiated SLeA (m/z : 843) ; barres rouges : déprotoné SLeA (m/z : 819) ; barres de bleu : sodiated MH (m/z : 1175). Barres d’erreur représentent des écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Échantillon | Plaque d’échantillon température (° C) |
Quantité d’échantillon (ΜL) |
Échantillon de séchage heure (s) |
MeOH séchage heure (s) |
Zone de prélèvement adéquat expansion après recristallisation (%) |
| ElsA | 25 | 0,1 | 100-150 | < 5 | 0-200 |
| 1 | 300-350 | < 10 | |||
| MH | 0,1 | 100-150 | < 5 | ||
| 1 | 200-350 | < 10 | |||
| ElsA | 50 | 0,1 | < 5 | < 5 | |
| 1 | < 10 | < 10 | |||
| MH | 0,1 | < 5 | < 5 | ||
| 1 | < 10 | < 10 |
Table 1. Les paramètres expérimentaux et des conditions de séchage sous échantillon différent plaque temperatures.x
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Discussion
Hétérogénéité de l’échantillon est qu'un problème crucial en MALDI-Mme DD est le plus couramment utilisé de méthode de préparation d’échantillon, mais les cristaux qui en résultent sont très hétérogènes. Ces exemples montrent reproductibilité de mauvais signal de tir-à-coup et d’échantillon. Par conséquent, la recherche pour « sweet spots » dans les zones échantillonnées lors d’acquisition de données est une procédure commune dans les expériences de MALDI. Ces échantillons hétérogènes ne conviennent pas pour la quantification dans des analyses de routine.
Dans la présente étude, la morphologie échantillon MALDI est optimisée par recristallisation. L’amélioration de l’intensité du signal en glucides et à la stabilité des données par recristallisation est attribuée à la meilleure incorporation entre les glucides et les matrices. En raison des propriétés hydrophiles de la plupart des hydrates de carbone et des matrices, MeOH peut efficacement se désintègrent hydrates de carbone et cristaux MALDI. Observation montre que les dépôts et rapide évaporation de MeOH réformes gros cristaux aciculaires de DHB dans petites structures cristallines comme. Ce processus a également réduit au minimum la ségrégation de l’échantillon et augmente la superficie. Selon les données d’IMS, les cristaux réformées fournissent un micro-environnement mieux pour l’ionisation de l’hydrate de carbone. Notamment, l’utilisation de la chambre de séchage est de fournir un état de référence précisément les paramètres expérimentaux contrôlés. Pour l’analyse de routine, général MS utilisateurs peuvent suivre les protocoles sous un environnement ambiant à atteindre des résultats similaires de mise en valeur.
Amélioration du signal par recristallisation peut également être due à une augmentation de surface efficace, puisque la MALDI est dominée par des réactions chimiques surface14,15. La corrélation entre l’intensité du signal et de la surface apparente de cristaux MALDI a été étudiée par la préparation des échantillons sous échantillon différent plaque températures11,12. Par rapport à un grand changement dans la taille des cristaux à l’aide de la méthode de recristallisation, réglage de la taille des cristaux est possible en régulant la température de la plaque d’échantillon au cours de la goutte processus de séchage. Lorsque vous utilisez THAP comme une matrice, la taille moyenne des cristaux aciculaires de THAP réduit 10 fois quand la température de la plaque d’échantillon réduit de 40 ° C. Les observations montrent qu’intensité du signal en glucides augmente comme cristal taille diminue de13. Cependant, réduire la température de la plaque d’échantillon est impropre à l’analyse de routine parce qu’il ne peut pas changer la morphologie de DHB efficacement et requiere fois longue préparation.
Pour vous assurer le meilleur résultat de recristallisation, procédés de préparation doivent être effectuées avec soin. Tout d’abord, mélanges de l’échantillon frais fournissent le meilleur renforcement de signal à l’aide de la méthode de recristallisation. Une fois les solutions prémélangées affleurent dans le milieu ambiant, avant la cristallisation se produit dans la solution, qui change la taille des cristaux final et la morphologie. Un tel changement de morphologie est vraisemblablement due à un changement du rapport de matrice/analyte. Les observations montrent que recristallisation de ces échantillons ne peuvent pas fournir la meilleure mise en valeur de signal. Par conséquent, la procédure de pipetage doit fonctionner avec une grande efficacité pour protéger la goutte de l’échantillon de cristallisation préalable au sein de l’embout de la pipette. Deuxièmement, une quantité suffisante de MeOH appliquer aux échantillons de réforme complètement. Au cours du processus de recristallisation, MeOH devrait être déposée aussi rapidement que possible pour éviter la perte considérable par évaporation à la surface de l’échantillon. Cristaux MALDI échantillon ne se dissoudre pas complètement si le volume de MeOH déposé n’est pas assez. En revanche, un grand volume de MeOH sera étalé et réduire la densité des échantillons. Il est recommandé d’observer des morphologies d’échantillon au microscope pour s’assurer que les morphologies de cristal sont réformés correctement avant l’analyse SM. Si les morphologies de cristal ne sont pas totalement altérées (pour référence, voir Figure 1 et tableau 1 ), il est nécessaire de préparer un nouvel échantillon avec les mêmes procédures.
La meilleure approche de l’analyse quantitative en MALDI-MS analyse réformées échantillons avec IMS. Bien que la réforme réduit significativement hétérogénéité de l’échantillon, l’intensité du signal des analytes dans différents domaines peut-être varier encore (Figure 2). Par rapport à l’examen manuel des positions de l’échantillon, analyse des zones de la totalité de l’échantillon avec IMS en moyenne les incertitudes et les variation de données. Les observations montrent que recristallisation des échantillons préparés avec un habitué montant (1,0 µL de solution échantillon) fournit homogénéité échantillon des hydrates de carbone supérieur en analyse quantitative (étape 2.2). Cependant, l’analyse de ces échantillons IMS consomme plus analyse de temps que la méthode manuelle. Pour réaliser une analyse rapide IMS, préparation des échantillons à l’aide de solutions d’échantillon 0,1 µL (étape 2.1) peut produire des zones de petit échantillon et réduire le temps de l’analyse.
Recristallisation des échantillons MALDI prévoit la morphologie échantillon supérieure sensible et analyse quantitative en MALDI-MS. Le principe de base derrière cette méthode est clairement démontré. Les processus expérimentales développés dans cet ouvrage sont pratiques et efficaces pour générales conditions expérimentales. Ces processus expérimentales peuvent s’appliquer facilement à des analyses de routine sans supplément coût.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs n’ont aucun remerciements.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
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