Summary
本研究ではスパイラル慣性マイクロ流体システムの閉ループの操作を使用して臨床の気道分泌物からラベル無料好中球分離法を紹介します。提案手法は、様々 な呼吸器疾患の臨床の in vitroアッセイを拡大します。
Abstract
気道分泌物には、多数免疫関連細胞、例えば、好中球、マクロファージ、リンパ球は、さまざまな肺疾患、研究および臨床目的のための両方を評価する主要なリソースとして使用することができますにはが含まれています。しかし、患者の粘液の異種と粘性の性質のためありません現在メソッドがあります信頼性の高い解離患者気道分泌の宿主の免疫細胞に被害はありません。本研究では慣性マイクロ流体を使用して、患者さんの免疫の評価のためのサンプル調製法を紹介します。臨床サンプルの異種流体プロパティに関係なく、提案手法は 1,000 倍希釈、気道分泌物のサンプルから好中球の 95% 以上を回復する清潔な生理食塩水のミリリットルと。初期サンプル貯水池へ集中している出力ストリームを再循環によって高濃度、回復、および免疫細胞の純度は用意されています。再循環は、トレードオフが伴う慣性マイクロ流体の単一実行注射器ベースの操作と見なされます。スパイラル マイクロ流体システムの閉ループ操作ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) によって示されるように物理的または化学的にせずに、白血球を提供します-並べ替えられた好中球のエラスターゼ遊離。
Introduction
細胞は多量の気道分泌物で粘液にカプセル化されて、以来の in vitroアッセイによる白血球の機能評価を妨げられています。ジチオトレイトール (DTT) は最も一般的な換散バッファーを切り離して、細胞学的分析と単離細胞1,2の許容性を提供しながら調停の検出の喀痰を均質化します。ただし、DTT はエラスターゼおよびミエロペルオキシダーゼ (MPO) リリース2,3など好中球機能の中断の結果気道好中球表面結合抗原を妨げることができます。したがって、末梢血好中球肺4の生理学的特性を明らかにするかもしれないとひと気道好中球機能のいくつかの研究が行われています。一方、慣性マイクロは、様々 な患者のマトリックス5,6から細胞を分離することを進歩させてをきました。慣性の揚力とディーン ドラッグ間の平衡により、ラベル無料粒子分離7彼らの大きさに応じて粒子/セルに配置します。当社グループは以前循環腫瘍細胞8,9血8病原体、細胞懸濁液文化10、11,からの試料作製法を導入した12と多形核白血球 (PMNs) 血13,14から。
好中球エラスターゼ (NE) アッセイなど、下流の in vitroアッセイの閉ループ慣性マイクロを使用して患者さんの気道分泌物から免疫細胞を準備するためのプロトコルを紹介します。このメソッドは、セル/粒子の元、セル/粒子の金利が削除される臨床サンプルでよく観察される横方向に重要な重複がある場合は特に、高濃度と復旧の両方を提供します。内部壁 (IW) を再循環によって-廃棄物の貯留層を通過する小さな粘液骨材を用いた背景流体中大きな粒子またはセルへ入力サンプル チューブ、粒子や貯水池の元セルの関心集中を集中。臨床サンプルの異種流体特性、にもかかわらず提案手法を一貫して好中球 1,000 倍希釈、気道分泌物のサンプルからの 95% 以上回復 (〜 1 mL) きれいな食塩水で。対照的に、換散方法は Pmn の広い範囲のサンプル条件によって回収率を示します。提案プロトコルは、物理的あるいは化学的停止することなく、臨床的に低侵襲と生体に挑戦から繊細な細胞を収穫する可能性を提供するが無料のラベルに白血球をキャプチャします。
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Protocol
サンプル コレクションは、ピッツバーグ大学制度審査委員会 (IRB # PRO16060443, PRO10110387) によって承認されました。すべての実験は、バイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けの下で実行されます。
1. デバイス作製とソフト ・ リソグラフィー
注: 標準的なソフト ・ リソグラフィー技術15,16はポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ チャネルを作成する使用されました。
- ベースと硬化剤の比率 10:1 の PDMS 前駆体をミックスします。
- 微細加工によるアルミ金型の PDMS 前駆体混合物の 30 グラムを注ぐ (寸法は図 1を参照) および 100 mm のペトリ皿に PDMS 前駆体の混合物の 20 g。
注: ペトリ皿、支持層の PDMS (~ 3 mm) の厚いフィルムのために使用されます。PDMS の支持層は、マイクロ流体全体で均一な表面物性を提供します。また、スライド ガラス上の PDMS 薄膜を使用できます。特定のチャネル寸法マスター金型設計し、アルミのシートでの微粉砕により作製しました。本研究で使用されるスパイラル チャネルは、1 つの入口と半径 8 mm から 24 mm サイズ ベースの効率的な分離のために増加の 2 つのアウトレット 8 ループ スパイラル マイクロだった。 - ドガの画面で、通常 5-10 分、デシケータ用家真空気泡がなくなるまでに真空デシケータに金型とペトリ皿を配置します。
- 真空を解放し、1 時間 90 ° C のオーブンで、カビやペトリ皿を配置します。
注: ホット プレートまたは他の加熱ツールは、オーブンの代わりに使用できます。 - 金型とペトリ皿をオーブンから取り出し、10 分間室温で冷却するようにし、なさい。
- 慎重に輪郭をカット、2 mm パンチャーを使用してデバイスの流体アクセス穴をパンチします。
注: パンチのサイズ チューブまたは流体のガイドのサイズによって異なります。 - テープ デバイスのチャネル側と PDMS、厚膜を付着し、ほこりを削除する鉗子で慎重に皮をむきます。
- デバイスと空気プラズマ プレーン PDMS とプレーン PDMS (図 1 a) の準備のサポート層との絆のチャネル側の両方を扱います。
- スライド ガラス 50 mm × 70 mm のチップを置き、接着強度を高めるために、少なくとも 30 分の 70 ° C のオーブンで配置します。
2 機械的に換気された患者から気管分泌コレクション
注: 気管分泌物することによって機械的に換気された患者の通常ルーチン気道ケア中に標準的な大人の換気患者を収容する従来の方法から変更されたプロトコルを使用しています。サンプルは識別不能化されますされ、処理に直ちに送信されます。
- 気管吸引が示される場合は、気道の分泌物を抽出するカテーテルを使用します。
- 気管内チューブにカテーテルを慎重に半分の方法を進めるし、あらかじめ 10 mL のシリンジから 0.9% 滅菌生理食塩水入り 5 mL を植え付けます。
- カテーテルは完全に、高度なまたは抵抗が満たされると、分泌物を吸引し、滅菌喀痰コレクション コンテナーを収集します。
- 滅菌喀痰容器に気管分泌物の 10 mL を収集し、氷の上に置きます。すぐに処理するためのサンプルを送信します。
3. 気管分泌物サンプル準備
注: すべての実験はバイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けの下で実行する必要があります。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (10 倍希釈) のプラスチックの 10 mL の注射器を使用しての 9 mL の気道分泌のサンプルの 1 つの mL を分散させます。粘液サンプルを均質化するのに鈍ピペットを使用します。
- 希釈剤を大きな塊や血栓は、マイクロ アクセス穴またはチャネルをブロックすることができますを削除する 40 μ m ナイロン セル ストレーナー付けひずみ。処理後、氷の上、サンプルを配置します。
- PBS バッファー、希薄懸濁液 x 1,000 の結果の 100 倍量を使用して各サンプルの希釈剤を分散させます。氷の上全体の解離操作中にサンプルを配置します。
4. 実験のセットアップ
注: すべての実験はバイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けの下で実行する必要があります。
- 4 スパイラル マイクロ (図 1 b) のそれぞれに一様流を適用する流体のガイドと PDMS チップを組み立てます。
注: 4 つのチャンネルは、結果の懸濁液の量と細胞密度の最適化と同様に並列処理によってスループットを増やすに使用されました。流体のガイドは、設計されて、透明樹脂の光造形タイプの 3 D プリンターで作られました。入口と流体のガイドの出口ポート接続と操作中に安定したシール性を女性のルアーロック コネクタを使用します。 - 1/16 インチ男性ルアー コネクタを入口と内部壁 (IW) アウトレット、流体のガイドの外側の壁 (OW) 出口ポートに接続し、サンプルの懸濁液にシリコン チューブを接続します。
- インレットとアウトレット サンプル貯水池の底に到達するための各終わりに鈍のヒントを挿入します。
- インレット チューブ蠕動性ポンプを接続します。
- サンプル タンクの入口配管と IW アウトレット チューブの端に配置し、(図 1d) 廃棄物貯蔵所の OW アウトレット チューブの端を置きます。
- サンプル保存容器にカルシウムとマグネシウムなしフィルター処理された PBS の 50 mL のチューブを置きます。
- デバイスを総理する低流量 (〜 1 mL/分) でポンピングを開始します。
注: チャネル内の泡をキャプチャすると、不安定にし、空気の気泡を除去するピンセットでチャンネルの上部をプッシュします。デバイスが完全に緩衝液でいっぱいになる、気道分泌のサンプル チューブを準備する PBS チューブを変更します。 - サンプル タンクのサンプルを配置すると、蠕動運動型ポンプのスイッチ、4 mL/分 (図 1d) で流量を設定します。
- サンプル ボリュームでは、指定されたボリューム (〜 1 mL) に達すると、操作を中止、シリコン チューブを外します。
メモ: 提案手法は大量の希釈液を減らすことでより効率的な (> 50 mL) をマイクロ遠心チューブ ボリューム (〜 1 mL) (図 2)。
5 フローサイトメトリー解析
注: 解離手法 (マイクロおよび換散) を比較するため, 蛍光抗体法とフローサイトメトリーが使用されました。
- かに (FITC) - 共役マウス抗 CD66b モノクローナル抗体とアロフィコシアニン (APC) - 共役マウス抗 CD45 抗体初期懸濁液 (ステップ 3.3) し、結果として得られる懸濁液 (ステップ 4.9) (200 μ L を追加します。各抗体) の 1:25 の比率で v/v。
- 4 ° c 30 分間暗闇の中でサンプルをインキュベートします。
- Pmn を定量化する流れの cytometer で両方のサンプルを分析します。
注: は CD45 陽性、CD66b 陽性 FITC APC 二重肯定的な人口が好中球としてと考えられた.回復は、入力と結果の懸濁液の総細胞数の比率で算出しました。
6. NE リリース解析
注: 分離されたの機能を比較するには、マイクロ流体システムと溶解法による好中球 NE アッセイ キットを使いました。
- 各結果サスペンション (4.9 のステップで取得) を 50 の最終濃度に PMA (アッセイ キットで提供されます) を追加 nM。
- 2 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
- 10 分間 300 x g で懸濁液を遠心します。
- それぞれの上清の 10 μ L を (アッセイ キットで提供されます) 96 ウェル プレートに転送します。
注: 平らな底と黒ポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートをも使用できます。 - (アッセイ キットで提供されます) 希釈アッセイバッファーの 90 μ L を各ウェルに追加します。
- エラスターゼ基板 (Z アラ アラ アラ アラ 2Rh110、アッセイ キットで提供される) の 10 μ L を追加します。
- 37 ° C で 1.5 時間インキュベートします。
- 485 の励起波長で、蛍光光度計を用いた 96 ウェル プレートを読む nm、発光波長 525 nm。
注: NE のレベルだった流れフローサイトメトリー解析から多核白血球数で割った値。
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Representative Results
孟とマイクロ流体解離 (図 3 a) を DTT と両方で透明な免疫細胞懸濁液を達成しました。マイクロ解離収集 105 Pmn x 4.40 平均 (2.1 x 10 x 10 の5 Pmn 5.60 に4 n = 6) 気道分泌のサンプルから 1,000 倍希釈 (容量 50 mL) きれいな懸濁液の 1 mL に。初期希釈 94.0 %pmn と比較して (CD66b+/CD45+) 6 臨床サンプルにわたって一貫して、少量で回収されました。ただし、DTT 孟手法では, 53.5% 回復平均で重要なサンプルにサンプル変化 (30.8 96.0%) と(図 3 b)。
次に、エラスターゼのリリースは、概念実証として商業 NE アッセイ キットを用いて調べた。外部刺激せず粘液溶解法で作製したサンプルは高い NE のマイクロ メソッドからのサンプルよりもレベルを示した。PMA は、マイクロと NE の放出をトリガーする粘液溶解薬解離メソッドの両方から結果の懸濁液に追加されました。6 異なる患者から気道分泌のサンプルと各メソッドをテストしました。免疫細胞のマイクロで区切られた提示 NE 量の増加を示すそのままの機能 PMA 刺激によるリリースします。その一方で、粘液溶解薬解離法により作製した細胞は、NE の放出 (図 3) の一貫性のない増加を示した。
図 1: スパイラル マイクロ流体デバイスと実験設定します。(A) スパイラル マイクロ流体システムと (B) デバイスの写真画像は、流体のアダプターで組み立てください。(C) スパイラル慣性マイクロ流路を用いた閉ループ分離の模式図。元のサンプル貯蔵所に戻って集中粒子/セル ストリーム (IW コンセント) を再循環、免疫関連細胞ムチン集計を含む背景流体中の小さなボリュームに集中していたし、マイナーな赤血球が継続的にOW のコンセントに接続されている廃棄物の管を通して削除されます。(D) 実験のセットアップと 10 μ m 粒子軌道 (緑)、スパイラル チャネル (右上) のアウトレットの蛍光イメージ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 閉ループ慣性マイクロを使用して気道分泌のサンプル準備の模式図.臨床的に 1,000 x 緩衝液量で機械的に分散した気道分泌を誘発します。希釈剤は、マイクロフルイディクス, 明確な背景を持つ細胞を懸濁液の 〜 1 mL の結果によって集中されます。適応龍らの許可を得て、著作権 (2017 年) アメリカの化学社会17です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: マイクロ解離メソッドに DTT 粘液溶解法の代表的な比較します。(A) 気管分泌物サンプル (左) とマイクロ流体解離後顕微鏡画像。(B) 元および懸濁液の写真画像。(C) 粘液溶解とマイクロ流体法の PMN の回収率の比較。マイクロ流体システムと PMA 刺激前後の DTT 粘液溶解方法によって分離された好中球の NE の放出の (D) の比較。NE の放出がマイクロ流体分離からサンプルの PMA によって引き起こされた有意 (p < 0.0001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
慣性マイクロ粒子と細胞は、マイクロ流路のサイズ5,18,19,20に基づいて特定の水平位置にローカライズします。ディーンの複合効果による力と慣性の揚力曲線マイクロ、大きな粒子、好中球をドラッグ (> 10 μ m) 6 より小さいチャネルと小さな粒子、粘液の集計、および残骸の中にある μ m を配置以外の一定の流速でチャネル条件の10、11,13,14を実行します。
ただし、他のセル/粒子粒子の分離サイズの範囲または興味のセルに重なっている場合は特に、マイクロ流体を使用する場合、濃度と分離の回復の間のトレードオフがあります。並べ替えられた粒子と細胞の高い濃度を達成するために分離範囲狭くする必要があり、各サンプル実行のための顕微観察による微調整が必要です。これは気道分泌物などの異種生体認証に対する慣性マイクロ流体の使用量を制限します。
閉ループ慣性マイクロ (図 1 bC) を使用しての in vitroアッセイ用臨床気道分泌物サンプル調製法を紹介します。フォーカシング コンセントを介して粒子/セルの循環による閉ループ操作は、高濃度要因と高回収率を実現しました。OW コンセントが廃棄物管に流れるし、IW アウトレット継続的に元のサンプル チューブに供給されます。直径 10 μ m より大きいセルは、初期サンプル チューブ、したがって、廃棄物管背景流体を排除しながらサンプルの細胞密度の増加のままです。高い希釈率では、破片や粘液を含むバック グラウンド液体のクリアランスをことができます。また、患者検体の状態にかかわらず手法均一に分離でき、免疫細胞を分離します。
DTT は広く使われているムチンの換散バッファー粘液1,21,22からセルの内容を別に集約するプロテオグリカンのジスルフィド結合を切断します。ただし、白血球表面抗原は、白血球機能2に影響を与えることができる、伝えられる DTT を妨げます。私たちの研究では DTT 解離によって回復細胞内容ないを一貫されたサンプル、非一様粘液溶解効率とフィルターの目詰まりのため。これは少量で最初のサンプルと比較的太い気道分泌のサンプルの準備のためより重要になります。その一方で、マイクロ流路を用いた異種患者サンプル (図 3) でセルの内容の一貫性のあるリカバリが有効になります。図 3Bに示すとおり、一貫して気道分泌元サンプルの状態、すなわち、流血、粘り強い、または水に関係なくきれいなバッファー内のセルの内容を分離できれば。従来法と比較して、提案手法は、少ない破片回収のサンプルでは、下流の生化学分析における破片の可能な干渉を最小限に抑えます。
NE の放出は両方の濃縮方法 (図 3 D) によってキャプチャされた好中球の機能の整合性を評価検討した.好中球削除外国 NE による有機分子リリース23,24,25。PMA は、好中球の in vitro26をアクティブに使用されます。50 マイクロ流体および粘液溶解 (DTT) メソッドによって分離された細胞が刺激された PMA の nM。ひと気道分泌物サンプル (P173, P174、p 176、P177、p181 繊維長、P182 とラベル) で各メソッドをテストしました。マイクロ流体によって集中されるサンプルは、すべて 6 サンプルの PMA 刺激による NE の増加を示した。対照的に、扱われる DTT サンプルの唯一の 3 は、PMA 刺激後 NE 活性の増加を引き起こすことができます。また、DTT の粘液溶解法による分離した好中球は、マイクロ流体によって分離された好中球より多くのより高い基準の活動を示した。これらの結果は、すなわち表面の破壊バインド抗原2,3、マイクロ メソッドが保持の観点から法の改良であることを示唆している東北機械可能化学障害を示した、DTT の均質化よりも好中球の機能。提案された解離メソッドは、外部環境の潜在的な危険の患者サンプルの露出を最小限に抑え、自動かつ完全に含まれているにも動作します。
ただし、高流量と、したがって、安定した流体接続手法が必要です。また、蠕動循環ポンプの固有の変動により IW コンセント寸法は OW コンセント寸法より大きくなければなりません、以外の場合スループットが下がる場合があります。安定した流量を提供することができます循環ポンプがある場合, 提案手法が高いスループットを提供することを見込んでいます。
臨床の気道分泌物から好中球をキャプチャする解離プロトコルを提供し、この研究手法は肺炎、喘息、嚢胞性線維症などの呼吸器疾患の臨床研究の範囲を拡大し、慢性的です閉塞性肺疾患。
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Disclosures
著者は、ここでは説明された技術の特許出願を提出しました。
Acknowledgments
この作品は、NIH U24 サンプル温存法プログラム (U24 AI118656) だけでなく、NIH/NIAID (R21AI119042) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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