Summary
I denne forskningen viser vi en etikett-fri nøytrofile skille metode fra klinisk airway sekreter bruker lukket drift av spiral treghet microfluidics. Den foreslåtte metoden ville utvide klinisk i vitro analyser for ulike luftveissykdommer.
Abstract
Airway sekreter inneholder et stort antall immun-relaterte celler, f.eks, nøytrofile, makrofager og lymfocytter, som kan brukes som en stor ressurs for å vurdere en rekke lungesykdommer, både for forskning og klinisk. Men på grunn av heterogene og tyktflytende natur pasienten Slim finnes det for øyeblikket ingen pålitelig dissosiasjon metode som ikke skade verten immunceller i pasienten airway utskillelsen. I denne forskningen introduserer vi en prøve forberedelse metode som bruker treghet microfluidics pasientens immun vurdering. Uansett heterogene fluidic egenskaper av klinisk prøvene, gjenoppretter den foreslåtte metoden mer enn 95% av nøytrofile fra airway sekresjon prøver som er utvannet 1000 ganger med ml ren saltoppløsning. Ved resirkulering konsentrert output stream til første eksempel reservoaret, tilbys det en høy konsentrasjon, gjenoppretting og renhet av immunceller; resirkulering er ansett som en avveining for enkelt kjøre sprøyte-baserte driften av treghet microfluidics. Lukket driften av spiral microfluidics gir leukocytter uten fysisk eller kjemiske forstyrrelser, som demonstrert av phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-indusert elastase utgivelsen av sorterte nøytrofile.
Introduction
Siden celler er innkapslet i store mengder Slim i airway sekreter, har funksjonelle vurdering av leukocytter av i vitro analysen blitt hindret. Dithiothreitol (DTT) er den vanligste lyseringsbuffer distansere og homogenize sputum for fargemaskin analyse og deteksjon av meglere samtidig tålelig levedyktigheten til isolerte celler1,2. Imidlertid kan DTT forstyrre overflaten-bundet antigener i airway nøytrofile, som fører til avbrudd i nøytrofile funksjonen som elastase og myeloperoxidase (MPO) løslate2,3. Derfor har få studier av menneskelig airway nøytrofile funksjon blitt utført med perifert blod nøytrofile, som ikke kan avsløre fysiologiske kjennetegner lunge4. I mellomtiden har treghet microfluidics gjort fremskritt i isolere celler fra ulike pasienten biomatrices5,6. Likevekt mellom treghet heis styrker og Dean dra justerer partikkel/cellen avhengig av størrelse, hvilke innrømmer etikett-fri partikkel separasjon7. Vår gruppe tidligere introdusert en prøve forberedelse metode for sirkulerende tumor celler8,9, patogener i blod8, celler fra en suspensjon kultur10,11, 12, og polymorfonukleære leukocytter (PMNs) fra blodet13,14.
Her introduserer vi en protokoll for å forberede immunceller fra pasientens airway sekreter bruker lukket treghet microfluidics for en nedstrøms i vitro analysen, for eksempel nøytrofile elastase (NE) analysen. Denne metoden gir både høy konsentrasjon og utvinning, spesielt når det er en betydelig overlapping i laterale retning av cellen/partikkel som cellen/partikkel-av-begrave er fjernes, som er ofte observert i klinisk prøver. Ved resirkulering indre veggen (IW)-fokusert store partikler eller celler tilbake til input eksempel røret, partikkel eller cellen steder konsentrater i opprinnelige reservoaret, mens bakgrunn væsker med små mucin aggregat passere avfall reservoaret. Til tross for heterogene fluidic egenskaper av klinisk prøver, den foreslåtte metoden gjenoppretter konsekvent over 95% av nøytrofile fra airway sekresjon prøver som er utvannet 1000 ganger med en ren saltholdig løsning (~ 1 mL). Derimot presenterer metoden lysis et bredt utvalg av PMNs utvinningsgraden avhengig av prøven tilstand. Den foreslåtte protokollen fanger leukocytter på en etikett-fri måte med fysisk eller kjemiske avbrudd, som gir muligheten til å høste delikat celler fra klinisk utfordrende biometri med minimal invasiv prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksempel samlingen ble godkjent av University of Pittsburgh institusjonelle Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Alle eksperimenter utføres under en biosafety kabinett med riktig personlig verneutstyr.
1. enheten fabrikasjon og myke Litografi
Merk: Standard myk litografi teknikker15,16 ble brukt til å opprette polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel.
- Bland PDMS forløperen i 10:1 forholdet base og herding agent.
- Hell 30 g PDMS forløper blandingen på mikro-maskinert aluminium mold (se figur 1 for dimensjoner) og 20 g PDMS forløper blandingen på 100 mm Petriskål.
Merk: Petriskål brukes til å lage PDMS (~ 3 mm) tykk filmen for støtte laget. Støtte laget av PDMS gir enhetlig fysiske overflateegenskaper gjennom microfluidics. Alternativt kan en tynn PDMS film på glasset lysbildet brukes. Master mold med bestemt kanal dimensjoner ble designet og fabrikkert av mikro-fresing på aluminium ark. Spiral kanalen brukt i denne studien var en 8-loop spiral microchannel med en vik og to uttak, med radius øker fra 8 mm til 24 mm for effektiv størrelse-baserte separasjon. - Plassere mold og Petriskål i et vakuum desiccator å degas til noen bobler er synlige på overflaten, vanligvis 5-10 min. Bruk et hus-vakuum for desiccator.
- Slipp vakuum og plassere mold og Petriskål i 90 ° C ovn 1t.
Merk: En kokeplate eller andre varme verktøy kan brukes i stedet for en ovn. - Fjerne mold og Petriskål fra ovnen og la den avkjøles til romtemperatur for 10 min.
- Nøye klippe ut disposisjonen og hull væske tilgang på enheten bruker et 2 mm puncher.
Merk: Størrelsen på slag kan variere avhengig av rør eller væske guiden. - Følge en tape til kanal side av enheten og tykk film av PDMS, og nøye skrelle med pinsett fjerne støv.
- Behandle begge kanal siden av enheten og vanlig PDMS med luft plasma og bånd med forberedt støtte laget av ren PDMS (figur 1A).
- Plassere brikken på 50 x 70 mm glass lysbilde og plasserer den i en 70 ° C ovn for minst 30 min å styrke bånd styrke.
2. tracheal sekresjon samling fra mekanisk ventilasjon pasienter
Merk: Tracheal sekret kan fås fra mekanisk ventilasjon pasienter under normal rutine airway omsorg ved hjelp av en protokoll endret fra konvensjonelle metoder for standard, voksen ventilert pasienten. Prøvene var de identifisert og sendes umiddelbart for behandling.
- Hvis tracheal aspirasjon er angitt, kan du bruke et kateter trekke ut airway sekret.
- Fremme kateter nøye halvveis inn i endotracheal røret og innpode 5 mL 0,9% sterilt normal saline fra en pre-fylt 10 mL sprøyte.
- Når kateter er avansert fullt, eller motstand er oppfylt, Sug opp sekret og samle inn en bakteriefri sputum samling beholder.
- Samle 10 mL tracheal sekret i sterilt sputum beholder og plassere den på is. Sende prøver umiddelbart for behandling.
3. tracheal sekresjon eksempel forberedelse
Merk: Alle eksperimentene må utføres under en biosafety kabinett med riktig personlig verneutstyr.
- Spre 1 mL av luftveiene sekresjon prøver 9 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) bruker en plast 10 mL sprøyte (for en 10 x fortynning). Bruk en stump pipette til homogenize Slim prøven.
- Sil fortynningsmiddel med en 40 µm nylon celle sil for å fjerne store biter eller blodpropp, som kan blokkere microfluidics tilgang hullet eller kanalen. Plass prøven på isen etter behandling.
- Spre fortynningsmiddel av hvert utvalg bruker en 100 x mengde PBS buffer, som resulterer i en 1000 x utvannet suspensjon. Plass prøven på isen under hele dissosiasjon operasjonen.
4. eksperimentelle oppsett
Merk: Alle eksperimentene må utføres under en biosafety kabinett med riktig personlig verneutstyr.
- Montere PDMS chip med væske guide bruke jevn flyt på hver av de fire spiral microchannels (figur 1B).
Merk: Fire kanaler ble brukt til å øke gjennomstrømningen av parallelization, samt optimalisering av volum og celle tettheten av resulterende suspensjon. Flytende guiden er designet og laget med en stereolitografi type 3D skriver med klar harpiks. Innløp og utløp port av væske guide bruke Luer-hunnkontakter for enkel tilkobling og stabil tetning under operasjonen. - Koble en 1/16-tommers mannlige Luer kontakten innløp, indre veggen (IW) og ytre veggen (au) stikkontakt porten for flytende og koble en silikon rør til eksempel suspensjon.
- Sett inn sløv tips i hver ende av innløp og uttak å nå bunnen av prøven reservoaret.
- Koble peristaltiske pumpen med slangen innløpet.
- Sted på slutten av vik rør og IW stikkontakt rør i prøven reservoaret og sted på slutten av OW stikkontakt slangen i avfall reservoaret (figur 1 c, D).
- Plass 50 mL tube filtrerte PBS uten kalsium og magnesium ved eksempel reservoaret.
- Starte pumping på en lav flow rate (~ 1 mL/min) Prime enheten.
Merk: Når boblene er fanget i kanalen, presse toppen av kanalen med tweezer destabilisere og eliminere luftbobler. Når enheten er fullt fylt med buffer løsning, endre PBS røret for å forberede airway sekresjon eksempel røret. - Når prøven er plassert i prøven reservoaret, slå på peristaltiske pumpen og sett flow rate på 4 mL/min (figur 1 c, D).
- Når prøven volumet når det angitte volumet (~ 1 mL), stoppe operasjonen og koble silikon slangen.
Merk: Den foreslåtte metoden er mer effektiv på å redusere store mengder fortynner (> 50 mL) i en mikro-sentrifuge tube volum (~ 1 mL) (figur 2).
5. flyt cytometri analyse
Merk: For å sammenligne metodene dissosiasjon (microfluidics og lyse), flowcytometri med immunofluorescence ble brukt.
- Legge til fluorescein isothiocyanate (FITC) - konjugert musen anti-CD66b monoklonalt antistoff og allophycocyanin (APC) - konjugert musen anti-CD45 monoklonalt antistoff første suspensjon (trinn 3.3) og resulterende suspensjoner (trinn 4,9) (200 µL hver antistoff) i forholdet mellom 1:25 v/v.
- Inkuber prøvene på 4 ° C i mørket 30 min.
- Analysere både prøver på en flyt cytometer å kvantifisere PMNs.
Merk: Befolkningen som er FITC-APC dobbel positiv, CD66b positiv og CD45 positiv ble ansett å være nøytrofile. Gjenoppretting ble beregnet av forholdet mellom total-celle antall input og resulterende suspensjon.
6. NE utgivelsen analyse
Merk: Hvis du vil sammenligne funksjonaliteten til den isolerte nøytrofile av metoden microfluidics og lyseringsbufferen en NE analysen kit ble brukt.
- Legge til PMA (forutsatt i analysen kit) til hver resulterende suspensjon (innhentet for steg 4,9) til en siste konsentrasjon av 50 nM.
- Inkuber prøvene ved 37 ° C i 2 timer.
- Sentrifuge suspensjoner på 300 x g i 10 min.
- Overfør 10 µL av hver nedbryting til en 96-brønns plate (forutsatt i analysen kit).
Merk: En 96-brønnen microplate med flat bunn og svart polystyren kan brukes også. - Legge til 90 µL av utvannet analysebuffer (forutsatt i analysen kit) i hver brønn.
- Legge til 10 µL av elastase underlaget (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, gitt i analysen kit).
- Inkuber 1.5 h på 37 ° C.
- Lese 96-brønns platen med en fluorometer på en eksitasjon bølgelengden til 485 nm og et utslipp bølgelengden til 525 nm.
Merk: Nivået av NE ble delt PMN count fra flyt cytometri analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi oppnådd gjennomsiktig immun-celle suspensjoner med både DTT mucolysis og microfluidics dissosiasjon (figur 3A). MicroFluidics dissosiasjon samlet 4,40 x 105 PMNs i gjennomsnitt (2,1 x 104 til 5.60 x 105 PMNs, n = 6) fra airway sekresjon prøver utvannet 1000 ganger (50 mL totalt volum) i 1 mL av ren suspensjon. Sammenlignet med den første fortynningsmiddel, 94.0% PMNs (CD66b+/CD45+) ble gjenopprettet i liten volum, konsekvent over 6 klinisk prøver. Men metoden DTT mucolysis viste en 53.5% gjenvinning i gjennomsnitt med betydelige prøve å sample variasjoner (30,8-96,0%) (Figur 3B).
Deretter ble utgivelsen av elastase undersøkt med en kommersiell NE analyse kit som en proof-of-concept. Uten ytre stimulering, utvalget utarbeidet av metoden mucolytic viste en høyere NE nivå enn prøven fra metoden microfluidics. PMA ble lagt til de resulterende suspensjoner fra både microfluidics og mucolytic dissosiasjon metoder for å utløse NE utgivelsen. Vi testet hver metode med airway sekresjon prøver fra 6 forskjellige pasienter. Immunceller atskilt microfluidics presentert intakt funksjonalitet, viser en økt mengde av NE utgivelsen av PMA stimulering. På den annen side, celler utarbeidet av metoden mucolytic dissosiasjon viste en inkonsekvent økning av NE release (Figur 3 c).
Figur 1: Spiral microfluidic enhet og eksperimentelle innstillinger. Bilde bilder av (A) spiral microfluidics og (B) enheten sammen med fluidic adapteren. (C) skjematisk diagram lukket separasjon med spiral treghet microfluidics. Ved resirkulering partikkel/mobiltelefon konsentrert strømmen (IW utløp) tilbake til det opprinnelige prøven reservoaret, immun-relaterte celler var konsentrert i et lite volum mens bakgrunn væsken som inneholder mucin-aggregater og mindre RBCs var kontinuerlig fjernet gjennom avfall røret koblet til OW uttaket. (D) eksperimentelle oppsett og fluorescerende bildet av en 10 µm partikkel, banen (grønn) og utløpet av spiral kanalen (øverst til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk diagram av airway sekresjon eksempel forberedelse på lukket treghet microfluidics. Klinisk indusert airway sekresjon spredt mekanisk i 1000 x antall buffer løsning. Fortynningsmiddel er konsentrert av microfluidics, som resulterer i ~ 1 mL av cellen suspensjon med klar bakgrunn. Tilpasset med tillatelse fra Ryu et al., Copyright (2017) American Chemical Society17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant sammenligninger av metoden DTT mucolytic for metoden microfluidic dissosiasjon. (A) Tracheal sekreter prøve (venstre) og mikroskopiske etter microfluidic dissosiasjon. (B) fotografi av original og resulterer suspensjoner. (C) sammenligning av PMN utvinningsgraden mellom metodene mucolytic og microfluidics. (D) sammenligning av NE utgivelsen av atskilt nøytrofile av microfluidics og DTT mucolytic metoder før og etter PMA stimulering. NE utgivelsen ble betydelig utløst av PMA på prøven fra microfluidic separasjon (p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I treghet microfluidics lokalisere partikkel og celler et bestemt lateral sted i en mikro-kanal basert på deres størrelse5,18,19,20. På grunn av den kombinerte effekten av dekan dra kraft og treghet heis kraften i buet microchannel, store partikler eller nøytrofile (> 10 µm) er plassert inne i kanalen og små partikler, Slim aggregater og avfall mindre enn 6 µm plasseres utenfor kanalen på visse flyten hastighet forhold10,11,13,14.
Men er det en avveining mellom konsentrasjonen og utvinning av separasjon når du bruker microfluidics, spesielt når separasjon størrelse utvalg av partikkel eller cellen rundt overlapper andre celler/partikler. For å oppnå en høy konsentrasjon av sorterte partikler og celler, separasjon området må være smale og krever en finjustering med mikroskopiske observasjon for hvert eksempel løp; Dette begrenser bruken av treghet microfluidics på heterogene biometrics, for eksempel luftveiene sekret.
Her introduserer vi en klinisk airway sekreter eksempel forberedelse metode for i vitro analyser bruker lukket treghet microfluidics (figur 1B, C). Lukket operasjonen ved resirkulering av partikkel/cellen gjennom et fokus stikkontakt oppnådd både høy konsentrasjon faktorer og høye utvinningsgraden. OW uttaket munner avfall røret og IW uttaket mates kontinuerlig til opprinnelige prøven røret. Celler som er større enn 10 µm i diameter forblir i første eksempel røret, dermed øker celle tettheten av prøven, mens bakgrunn væsken er eliminert til avfall røret. Høy fortynning hastigheten kan klarering av bakgrunnen væsken, inkludert rusk og slim. Også uansett tilstanden til pasienten prøve, kan den foreslåtte metoden jevnt distansere og isolere immunceller.
DTT er en mye brukt mucin lyseringsbuffer som innstiftet disulfide obligasjoner i proteoglycan aggregering skille celleinnholdet mucilage1,21,22. Imidlertid forstyrrer DTT angivelig hvite blodlegemer overflaten antigener, noe som kan påvirke leukocytter funksjon2. I vår studie var mobilnettet innholdet av DTT dissosiasjon inkonsekvent i et datautvalg, på grunn av ikke-uniform mucolytic effektivitet og tilstopping av filteret. Dette blir mer kritisk for utarbeidelse av første prøver med små volumer og relativt tykk airway sekresjon eksempler. På den annen side, aktivert metoden bruker microfluidics konsekvent utvinning av celleinnhold i heterogene pasientprøvene (Figur 3 c). Som vist i figur 3B, kunne vi konsekvent isolere innholdet av luftveiene utskillelsen i en ren buffer uavhengig av den opprinnelige prøve tilstanden, dvs. blod, seig eller vannaktig. Sammenlignet med det tradisjonelle metoden, har den foreslåtte metoden mindre rusk i gjenopprettede utvalget, minimerer mulig forstyrrelser av rusk i nedstrøms biokjemiske analyser.
NE utgivelsen ble undersøkt for å vurdere funksjonelle integriteten til fanget nøytrofile av både berikelse metoder (figur 3D). Nøytrofile fjerne utenlandske organiske molekyler gjennom NE slippe23,24,25. PMA er vanlig å aktivere nøytrofile i vitro26. Celler isolert av microfluidics og mucolytic (DTT) metoder ble stimulert med 50 nM i PMA. Vi testet hver metode med menneskelige airway sekresjon prøver (merket som P173, P174, P176, P177, P181 og P182). Prøver konsentrert av microfluidics viste en økning i NE av PMA stimulering for alle 6 utvalgene. Derimot kan bare 3 DTT behandlet prøvene indusere økt NE aktivitet etter PMA stimulering. I tillegg nøytrofile isolert av metoden DTT mucolytic viste mye høyere planlagt aktivitet enn nøytrofile isolert av microfluidics. Disse resultatene viste mulig kjemisk forstyrrelse av NE maskiner, dvs. avbrudd av overflaten bundet antigen2,3, som antyder at metoden microfluidics er en bedre metode i bevare den nøytrofile funksjon enn DTT homogenisering. Metoden foreslått dissosiasjon opererer også i en automatisert og fullt inneholdt måte, minimere eksponering av pasientprøvene med potensielle farer av eksterne miljøet.
Den foreslåtte metoden krever imidlertid en høy flow rate og derfor en stabil fluidic tilkobling. Også på grunn av iboende svingninger i peristaltiske Sirkulasjonspumpen, IW stikkontakt dimensjonen må være større enn OW stikkontakt dimensjonen, ellers gjennomstrømming kan være kompromittert. Vi forventer at den foreslåtte metoden vil gi høyere gjennomstrømming hvis det er en sirkulasjonspumpe som kan gi en mer stabil flow rate.
Ved å gi en dissosiasjon protokoll for å fange nøytrofile fra klinisk airway sekreter, er metoden presentert i denne studien forventet å utvide omfanget av klinisk forskning på luftveissykdommer, som lungebetennelse, astma, cystisk fibrose, og kronisk obstruktiv lungesykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har arkivert en patent på teknologien beskrevet her.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIAID (R21AI119042) og NIH U24 eksempel sparsom analyse program (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D.
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
