Summary
Nous présentons ici un protocole pour tester la virulence de la plante avec le phytopathogène Magnaporthe grisea. Ce rapport contribuera au dépistage à grande échelle des pathotypes d’isolats de champignons et servir de point de départ idéal pour la compréhension des mécanismes résistants des plantes au cours de la sélection moléculaire.
Abstract
Les plantes possèdent un système puissant pour se défendre contre d’éventuelles menaces de champignons pathogènes. Pour les plantes agricoles importantes, cependant, les mesures actuelles pour lutter contre ces agents pathogènes ont prouvé trop conservateurs et, ainsi, pas suffisamment efficace et ils peuvent potentiellement poser des risques environnementaux. Par conséquent, il est extrêmement nécessaire identifier les facteurs de résistance de l’hôte pour aider au contrôle des maladies des plantes naturellement par le biais de l’identification du matériel génétique résistant, l’isolement et caractérisation des gènes de résistance et la sélection moléculaire des cultivars résistants. À cet égard, il y a besoin d’établir une méthode d’inoculation précise, rapide et à grande échelle pour se reproduire et de développer des gènes de résistance des plantes. Le riz souffle champignon pathogène Magnaporthe grisea causes symptômes sévères de la maladie et les pertes de rendement. Récemment, M. grisea est devenu un organisme modèle pour étudier les mécanismes des interactions plante-pathogène. Par conséquent, nous présentons l’élaboration d’une méthode de test de virulence de plante qui est spécifique pour m.grisea. Cette méthode fournit pour l’inoculation de pulvérisation avec une suspension de conidies et blessant l’inoculation avec cubes de mycélium ou gouttelettes de suspension de conidies. L’étape clé de la méthode d’inoculation blessant pour les feuilles de riz détaché est de faire des plaies sur les feuilles de la plante, qui évite toute interférence causée par la résistance à la pénétration hôte. Ce spray/blessant protocole contribue au dépistage rapid, précis et à grande échelle des pathotypes de m.grisea isolats. Cette intégrée et méthode d’infection systématique des plantes servira de point de départ idéal pour gagner une large perspective de questions en phytopathologie.
Introduction
Pyriculariose, causée par M. grisea, est l’une des maladies plus graves pour les variétés de riz dans le monde1,2. Le processus par lequel M. grisea infecte les plantes hôtes comprend une production de conidies et l’attachement de surface, une germination des conidies et la formation de l’appressorium, une formation de l’hyphe de pénétration et de différenciation de l’hyphe infectieux, et la propagation d’une maladie 3. toutes ces étapes sont communs dans de nombreux autres champignons phytopathogènes, et, en effet, un blocus de n’importe quelle étape unique empêche l’infection des plantes hôtes. En raison de son importance économique et de la traçabilité génétique, m.grisea est devenu un organisme modèle pour étudier les mécanismes de la plante-champignon pathogène des interactions1,4. Par conséquent, étudier la base moléculaire de ces stades de développement de m.grisea aidera à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénicité fongique et l’identification des gènes de cible de candidats pour le dépistage et le roman de conception 5de fongicides.
Les rapports récents concernant M. grisea infection ont mis l’accent sur les mécanismes moléculaires des stades avant la pénétration, surtout la conidiation, la formation de l’appressorium, les hyphes de pénétration et la croissance infectieuses3, 6. par conséquent, il est essentiel d’élaborer un protocole détaillé pour tester l’infection de M. grisea . Ici, nous présentons une méthode détaillée pour un test de l’infection qui utilise des tests d’infection véhiculée par pulvérisation avec une suspension de conidies et l’inoculation des plaies avec des bouchons mycéliennes de m.grisea. Dans ce rapport, le protocole met l’accent sur la culture des souches, la préparation de la solution de la conidiation pour la pulvérisation et l’inoculation mycélienne d’induite par la prise de plantes avec M. grisea. Ces étapes sont décrites en détail ci-dessous et une vue schématique montrant l’intégralité du workflow de la méthode et une lésion typique sont présentés aux Figures 1 et 2, respectivement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vaporiser l’Inoculation avec une Suspension de conidies de M. grisea
-
Culture fongique pour M.grisea
- Préparer le milieu de culture de gruau tomate agar (OTA) pour des souches fongiques.
- Peser de 30 à 50 g de flocons d’avoine, ajouter ceci à 800 mL d’eau distillée (ddH2O) et faites bouillir le mélange pendant 30 min dans la marmite électrique.
- Filtrer le jus d’avoine bouillis dans le bécher dans un morceau de gaze.
- Ajouter 150 mL de jus de tomate et 20 g d’agar au filtrat dans le bécher et ajouter ddH2O à 1 000 mL.
-
Préparation de matériel expérimental
- Faire tremper environ 50 graines du cultivar de riz (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) FD2O 3 d ou tremper environ 50 graines d’orge (Hordeum vulgare cv Golden Promise) FD2O pour environ 1 d.
- Envelopper les graines de riz ou d’orge dans de la gaze humide et elles germent sur papier filtre humide dans environ 30 boîtes de Pétri avec un diamètre de 10 cm x 10 cm à 28 ° C. Le temps de germination de semences de riz est environ 2-3 jours, le temps de germination des semences orge est environ 2 d. L’humidité relative dans la serre est d’environ 70 %.
- Planter les semis du riz ou orge dans des pots à l’aide de terreau stérilisé et l’arrosage et puis recouvrir d’une couche de vermiculite.
- Placez les plantes dans une serre adaptée ou la croissance du cabinet à 25 ° C pour environ 1 ~ 2 semaines.
- Couper 3 couches de papier filtre en rond avec des ciseaux chirurgicaux stériles (chaque cercle devrait avoir un diamètre de 8 cm) et les placer sur des plaques en plastique stérile de 100 mm.
- Ajouter ddH2O à chaque plat à tremper le papier filtre.
- Assurez-vous que le papier filtre est complètement humide mais pas ajouter plus d’eau.
- Enlever tout excédent d’eau avec une pompe à vide.
- Placer 2 cure-dents stériles dans la boîte de Pétri pour soutenir le riz/orge des feuilles ; espace les cure-dents ~ 2-3 cm de distance.
- Recueillir les feuilles du riz 2 semaines après le semis des graines ou prendre les feuilles de l’orge 7D après le semis des graines.
- À l’aide de 4 à 6 feuilles plants de riz et d’orge, couper la partie inférieure de la tige à environ 5 cm du haut et de recueillir les feuilles.
-
Protocole de l’inoculation de pulvérisation
- Culture de la souche fongique sur plaques d’OTA dans une étuve thermostatique (25 ° C) pendant environ 4 jours.
- Ajouter environ 2 mL de ddH2O à l’aide d’une pipette de 5 mL pour chaque plaque âgés de 4 jours - de 0,5.
- Avec une boucle de l’inoculation, racler le mycélium de la souche sauvage de m.grisea et la souche mutante dans les débris de mycélium.
- Recueillir les débris de mycélium et la transférer à une nouvelle plaque d’OTA. Prendre les débris de mycélium et coup sec dans le banc propre.
- Couvrir la plaque avec 3 couches de gaze pour assurer l’humidité nécessaire à la croissance des conidies dans une serre à 25 ° C dans la journée (14 h) et 23 ° C dans la nuit (10 h) pendant 24 à 48 heures.
- Ajouter 2 mL de ddH2O à chaque plat et gratter les conidies doucement avec des tampons de coton stérile suivies d’une filtration par le biais de 2 couches de papier de la lentille. Veillez à ne pas rayer la surface du milieu de culture.
- Transférer la suspension de conidies dans un nouveau tube de 50 mL avec une pipette µL 100-1 000.
- Centrifuger pendant 5 min à un minimum de 5 000 x g à 25 ° C.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot pour donner 2 x 104 conidies / mL dans un 0.025 % (v/v) de Tween-20 solution. La solution de Tween-20 est généralement environ 10-20 mL.
- Versez la suspension de spores dans un pulvérisateur à main.
- Spay environ 10 mL de la suspension de conidies sur les feuilles de riz de plants de riz âgés de 2 semaines ou d’orge feuilles de plantules d’orge âgés de 7 jours et les incuber à 25 ° C dans une chambre sombre et humide pour ~ 24 h. Spray les plantes de contrôle avec le 0.025 % (v/v) de Tween-20 solution.
- Transférer les feuilles dans une autre chambre humide sous lumière fluorescente à 25 ° C pour une photopériode de 12 h.
- Enregistrer les symptômes de la maladie à 5 jours après l’inoculation. Examiner les lames de riz et d’orge malades de ~ 6 cm de longueur. L’évaluation standard selon le système de notation pour la résistance aux explosions de l’Institut International de recherche riz (IRRI). Les détails du système de notation pour résistance aux explosions figurent au tableau 1.
- Photographier les feuilles afin d’évaluer l’infection des souches testées. L’infection a été évaluée par le nombre de lésions par 3,6 cm2.
2. blessures Inoculation avec Cubes de mycélium ou gouttelettes de conidies Suspension de m.grisea
- À l’aide d’une aiguille anatomique, gratter les trois plaies de long de 2-3 cm dans les nervures principales des feuilles de riz et d’orge détaché ; prendre soin de ne pas pénétrer dans les feuilles.
- Mettre les feuilles grattées sur cure-dents et pulvériser un 0,02 % (v/v) de Tween-20 solution sur les feuilles pour former une couche de gouttelettes.
- Une plaque d’OTA, coupez une fiche mycélienne de 0,5 cm x 0,5 cm pour chaque souche de M. grisea (souches de type sauvage, mutant, complément, ou d’autres souches de test).
- Mettre les bouchons de mycéliums ou 25 gouttes µL de suspension de conidies sur les blessés laisse et incuber les feuilles à 25 ° C dans une chambre humide pendant 3 à 8 jours.
- Examiner les lésions à après l’inoculation de 5-7 d. La méthode d’examen est le même que c’était pour la méthode de l’inoculation de pulvérisation (voir étape 1.3.13).
- Examiner les lames de riz et d’orge malades de ~ 6 cm de longueur et photographier afin d’évaluer l’infection des souches testées. L’infection a été évaluée par le nombre de lésions par 3,6 cm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L’intégralité du workflow pour la technique est illustré à la Figure 1. Les dosages d’infection de plantes ont été effectuées sur des semis de riz sensibles âgés de 14 jours (o. sativa cv CO-39) ou laisse vulnérable âgés de 7 jours l’orge (H. vulgare cv Golden Promise)7,8,9. Pour tester une infection sur les feuilles de riz, une suspension de conidies (1,0 x 105 spores/mL) de la souche sauvage de m.grisea P131 et la souche mutante de Com1 suppression ont été préparés et ensuite pulvérisé sur les gaines foliaires de la 14-jour-vieux sensible Semis de CO-39, qui étaient alors conservés dans une chambre humide pour 5D10. Le CO-39 inoculées P131 laisse affiché les lésions robustes typiques de la pyriculariose, mais les feuilles inoculées Com1 a montré les défauts évidents de l’infection et pourraient ne pas produire une infection complet (Figure 2A). La souche sauvage P131 est une variété obtenue par vous-Liang Peng en 198818. Le mutant nul MoKMT2H (ΔMoKMT2H) a été obtenu par Cao et coll. dans notre laboratoire à l’aide d’une cible gène remplacement stratégie11. Le mutant Com1 a été isolé par Yang et al. , de vous-Liang Peng lab10.
Pour vérifier si le ΔMoKMT2H de M. grisea pourrait infecter les cellules de l’hôte par le biais de plaies, abrasé feuilles de riz sauvage plants ont été inoculés avec bouchons mycéliennes de ΔMoKMT2H via la méthode de pulvérisation ou blessant méthode11. Les feuilles qui ont été ensemencées à pulvérisation avec ΔMoKMT2H a révélé aucune anomalie évidente dans l’infection ΔMoKMT2H par rapport à la souche P131/sauvage ; Cependant, les défauts évidents ont été observées pour feuilles inoculées criblé de ΔMoKMT2H via (Figure 2A). Pour vérifier l’infection des plantes avec feuilles d’orge, en bonne santé ou feuilles blessés (cv Golden Promise) ont été inoculés avec gouttelettes de conidies ou bouchons de mycéliums, respectivement, de Com1, ΔMoKMT2Hou P131. À post-inoculation 5D, lésions de souffle de riz typique avaient entièrement développé sur les feuilles inoculées avec le ΔMoKMT2H ou la souche P131, tandis que les plus petites et lésions trouvées sur les feuilles inoculées avec le mutant Com1 (Figure 2 B).
Figure 1 : Un schéma illustrant l’infection des plantes. Graines de plantes ont germé en terre dans des pots en plastique (50 mm2 x 50 mm de profondeur, avec un trou de drainage), deux graines par pot, et les jeunes plants ont été cultivés en serre. La culture et l’inoculation du champignon explosion m.grisea ont été cultivées sur des plaques de l’OTA. Pour les conidies méthode d’inoculation de pulvérisation, la suspension de conidies a été suspendue dans un 0,02 % (v/v) de Tween-20 solution et pulvérisée sur les plantes de riz et d’orge. Pour la méthode d’inoculation rayé, les feuilles de la plante raclée riz/orge ont été mis sur des plaques en plastique et ensuite inoculés par une fiche de mycélium ou la suspension de conidies. Et puis, toutes les feuilles de végétaux traités ont été cultivées en obscurité pendant 24 h et lumière-cultivées pendant 12 h. Enfin, le nombre de colonies au sein des unités de 3,6 cm2 a été enregistré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Com1 et MoKMT2H sont requis pour une formation de conidies et pathogénicité sur les feuilles de riz. (A) ce panneau montre l’inoculation de riz feuilles par pulvérisation de conidies (à gauche) ou fiche mycélienne (à droite) avec des conidies de la m.grisea sauvage P131, mutant Com1ou ΔMoKMT2H. Feuilles typiques ont été observées 7D après l’inoculation mycélienne induite par le bouchon, qui a été menée sur les feuilles de riz abrasée. Les lésions typiques ont été observées 5D après l’inoculation mycélienne induite par le bouchon. Orge (B) les feuilles ont été inoculés par les conidies spray (à gauche) ou la fiche mycélienne (à droite). Comme un contrôle de traitement fictif, le même volume d’un 0.025 % (v/v) de Tween-20 solution a été pulvérisé. Pour l’inoculation de la plaie, la figure de P131 a été modifiée par Cao et al. 11. la MoKMT2H chez les champignons ascomycètes est un homologue fonctionnel de Ash1, qui est impliquée dans de méthylation H3K4 et H3K3611. La barre = 1 cm. Les mutants de Δcom1 ont été significativement réduits dans la virulence sur le riz et l’orge semis10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Échelle | Description |
| 1 | Petites taches marron de taille pin-point |
| 2 | Petites taches grises arrondies à légèrement allongé, nécrotiques, environ 1 à 2 mm de diamètre, avec une marge brune distincte. Les lésions sont surtout présents sur les feuilles supérieures |
| 3 | Type de lésion est le même qu’en 2, mais un nombre significatif de lésion sont sur des feuilles de supérieur |
| 4 | Lésions typiques sensibles blast, 3 mm ou plus, infectant inférieur à 4 % de la superficie de la theleaf |
| 5 | Les lésions typiques sensibles blast, 3 mm ou plu, infectant moins de 4 à 10 % de la surface foliaire |
| 6 | Les lésions typiques sensibles blast, 3 mm ou plu, infectant moins de 11 à 25 % de la surface foliaire |
| 7 | Les lésions typiques sensibles blast, 3 mm ou moins long, infectant de 26 à 50 % de la surface foliaire |
| 8 | Des lésions typiques sensibles blast, 3 mm ou plu, infectant moins de 51 à 75 % de la surface foliaire, de feuilles morts |
| 9 | Lésions typiques sensibles blast, 3 mm ou plus, qui infecte plus de 75 % de la surface foliaire |
Tableau 1 : un système de notation pour la résistance aux explosions. Le tableau est cité de l’Institut International de recherche riz (IRRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plante, gènes de résistance jouent un rôle essentiel dans la prévention des infections par des agents pathogènes, y compris les champignons pathogènes1,12. Pyriculariose a été utilisé comme modèle pour comprendre la nature de la structure des populations pathogènes et d’identifier la plante de gènes résistance4. Par conséquent, il est nécessaire d’examiner le génotype de résistance aux maladies et génotypes d’avirulence des principales variétés de plantes agricoles à grande échelle afin d’identifier les plantes résistantes aux maladies qui peuvent être cultivés en permanence. En outre, les avantages des génotypes d’avirulence de pathogènes champ nécessitent la répartition rationnelle des différents génotypes résistants d’hôte variétés12,13. Cependant, les méthodes actuelles de l’inoculation communément gênent le dépistage de la résistance et pathogène identification14,15,16,17.
Nous présentons ici une méthode rapide et précise pour tester l’infection des plantes. Cette méthode d’inoculation est adaptée pour l’identification des plantes résistantes au cours des essais de reproduction et du phénotype d’une population de descendance pendant le clonage des gènes de résistance. Ici, nous avons créé une méthode pour inoculer la plante blessée laisse avec M. grisea. Parce que la résistance de l’hôte joue un rôle majeur dans la prévention de la propagation d’un agent pathogène, cette méthode in vitro , qui produit des plaies sur le riz testé laisse et inoculé la pyriculariose sur la plaie, est commode pour la création d’une infection directement dans les feuilles sans avoir à pénétrer dans l’épiderme de la feuille et la paroi des cellules épidermiques. En outre, cette méthode d’inoculation est adaptée aux feuilles de différents âges. Les résultats de l’inoculation sont stables et précis. La méthode de piètres inoculation peut être utilisée pour l’inoculation avec le mycélium pour identifier la pathogénicité des souches fongiques qui produisent seulement de faibles quantités de conidies.
Ce protocole contribuera davantage à notre compréhension des mécanismes pathogènes qui sont conservées dans les champignons, ainsi que les facteurs spécifiques qui permettent à un champignon de résister et de supprimer l’immunité innée de son hôte13. Toutefois, l’inoculation de la plaie n’est pas applicable lorsque vous essayez de déterminer le taux d’une invasion de conidies et l’expansion de mycélium. Mais à l’état naturel, la méthode d’inoculation de pulvérisation peut mieux refléter la pathogénicité d’un agent pathogène. La méthode d’inoculation de pulvérisation est facile à utiliser et permet d’améliorer l’efficacité du travail. Pris ensemble, ces résultats indiquent une méthode d’inoculation précises et stables sont nécessaires pour le dépistage plant des gènes de résistance et de détermination de pathogénicité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet spécial de la recherche scientifique de l’Université de l’Agriculture de Pékin (YQ201603) et le projet scientifique du Comité éducatif de Pékin (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
