Summary
Ici, nous démontrons la performance d’un modèle de blessures médullaires minime dans une souris adulte qui épargne la niche de canal central logement cellules souches neuronales endogènes (CNS). Nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour quantifier l’activation et la migration des CNS primitifs et définitifs après une blessure.
Abstract
Des cellules souches neurales (CNS) dans la moelle épinière chez les mammifères adulte sont une population relativement mitotiquement quiescente de leucomalacie cellules qui peuvent être étudiés in vitro à l’aide du test Neurosphère. Ce dosage formatrices est un outil puissant pour étudier la réaction des CNS à des facteurs exogènes dans un plat ; Toutefois, cela permet également d’étudier l’effet des manipulations de in vivo avec la bonne compréhension des points forts et les limites du dosage. Une manipulation de l’intérêt clinique est l’effet d’une lésion sur activation endogène de NSC. Les modèles actuels de la moelle épinière constituent un défi d’étudier ce que la gravité des modèles courants de contusion, compression et transection provoquent la destruction de la niche du NSC sur le site de la lésion, où résident les cellules souches. Nous décrivons ici un modèle de blessure minime qui provoque des dommages localisés à la surface superficielle dorso-latérale du niveau thoracique inférieur (T7/8) de la moelle épinière de souris adulte. Ce modèle de blessure du canal central au niveau de la blessure de pièces de rechange et permet l’analyse des CNS qui résident au niveau de la lésion à divers moments après une blessure. Ici, nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour étudier l’activation de ces deux populations distinctes, linéaire-connexes, des CNS qui résident dans la région de la moelle épinière périventriculaire - CNS primitifs et définitifs (pNSCs et dNSCs, respectivement). Nous démontrons comment isoler et de la culture de ces CNS de la région périventriculaire au niveau de la lésion et le site de lésion de la substance blanche. Nos dissections médullaire postopératoire montrent un nombre accru de pNSC et neurospheres dNSC provenant de la région périventriculaire de cordons lésés par rapport aux témoins, s’adressant à leur mise en route par l’intermédiaire de blessures. En outre, après blessure, neurospheres dNSC dérivés peuvent être isolés depuis le site de la lésion, démontrant la capacité du CNS pour migrer de leur niche périventriculaire aux sites de blessure.
Introduction
Le système nerveux central contient une sous-population de cellules souches autorenouvellement, multipotentes qui ont la capacité de donner lieu à toutes les cellules neurales adultes différents types1,2,3,4. Ces cellules souches neurales (CNS) résident dans des créneaux spécialisés dans le cerveau et la moelle épinière et peut être activées après une blessure pour proliférer, migrer et se différencier en cellules neuronales matures. CNS et leur progéniture ont démontré à migrer vers le site de la lésion dans les lésions corticales modèles5,6. Dans le cerveau, les CNS ont démontré pour migrer des ventricules latéraux à l’endroit de la blessure où ils se différencient en astrocytes qui contribuent à la formation de la cicatrice gliale7. Dans la moelle épinière, cependant, peu d’études a été menée pour demander si ces mêmes CNS endogènes peuvent être exploitées pour favoriser la récupération après une lésion de la moelle épinière. En effet, il y a actuellement un débat quant à savoir si l’activation de la piscine de cellules souches dans la moelle épinière requiert un dommage physique direct de la niche de leucomalacie bordant le canal central8 ou si les dommages à la moelle fil parenchyme (en laissant la tige niche de cellules intacte) est suffisante pour activer endogène CNS9.
Un certain nombre de modèles de lésion (SCI) de la moelle épinière ont été utilisé pour étudier la physiopathologie des lésions aiguës et chroniques. Ces modèles ont aussi été utilisés pour tester des traitements potentiels pour traiter les SCI par le biais de neuroprotection, immunomodulation et développement cell transplantation/remplacement stratégies10,11,13. Les modèles actuels incluent compression ou contusion, blessé, provoquant des déficits fonctionnels à grande échelle ainsi que de lésions étendues et de cavitation dans le cordon14,15. Les cicatrices gliales qui en résultent peuvent s’étendre sur plusieurs segments de la colonne vertébrale ainsi que la majorité de la largeur/circonférence de la moelle épinière16. Ainsi, alors que ces modèles sont cliniquement pertinents, ils permettre des défis importants pour étudier la réponse des CNS endogènes après une blessure. Il existe des modèles chimiques de blessure qui peut être adapté pour provoquer des formes bénignes de blessure qui peut épargner le canal central17. Toutefois, ces types de blessures se concentrent sur la démyélinisation associée SCI et ne sont pas des modèles cliniquement pertinents pour les dommages physiques et/ou mécaniques associés SCI traumatique.
Pour pallier les lacunes des modèles actuels de blessures, nous avons adapté un aiguille piste SCI modèle minimal, développé à l’origine dans la rat9, pour l’application dans un modèle de souris adulte. Notre modèle adapté de blessure peut créer une lésion cohérente de la région dorso-latérale de la moelle épinière de souris et le canal central au ou les niveaux de la blessure de rechange. L’avantage de ce modèle est qu’il permet l’étude de la cinétique de NSC suite à des blessures et leur éventuelle migration radiale à l’endroit de la blessure. L’utilisation d’un modèle de souris permet aussi l’utilisation de souris transgéniques qui permettent le suivi de la lignée des CNS endogènes et leur progéniture après une blessure. Les propriétés des CNS plus loin peuvent être évaluées qu’en utilisant une forme modifiée de l’essai in vitro Neurosphère qui est introduit dans le présent protocole.
L’essai de Neurosphère est un essai in vitro formatrices avec qui permet l’isolement des CNS en présence de mitogènes. Aux densités de placage clonale, CNS individuels se multiplient pour donner naissance à des colonies sphériques flottants de cellules qui sont constitués d’une petite sous-population des CNS et une grande majorité des progéniteurs18,19. Dans notre protocole, nous démontrons l’isolement des deux CNS distinctes liées à l’horloge, de la région périventriculaire de la moelle épinière — en conditions basales et en suivant notre modèle SCI minimal. Définitif neural tige nestin express (dNSCs) des cellules et la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) et sont cultivées en présence de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance fibroblastique (FGF) et l’héparine (ensemble dénommée EFH)20. Ces dNSCs sont rares dans la moelle épinière naïf, donnant lieu à très peu neurospheres in vitro. Cependant, nous montrons que les dNSCs sont activés après SCI minime, élargissant le nombre des neurospheres isolées de la région de leucomalacie21. Primitive des cellules souches neurales (pNSCs) sont en amont de dNSCs dans la lignée de cellules souches neurales. pNSCs sont extrêmement rares, expresses de faibles niveaux de la pluripotence marqueur Oct4 et leucémie facteur inhibiteur (LiF) réactif22. pNSCs ne font pas neurospheres quand isolées de la moelle épinière de souris adultes en raison de la présence de la protéine basique de la myéline (PBM) dans des cultures primaires ; Cependant, neurospheres pNSC peuvent être isolés des souris déficientes en MBP et leur nombre est élargie après une blessure — similaire à dNSCs21. Enfin, nous montrons que neurospheres dNSC dérivés peuvent être isolés de l’endroit de la blessure à tôt fois suite SCI minimes. Ces résultats démontrent que notre modèle de blessures et les dosages peuvent évaluer les caractéristiques de l’activation de leucomalacie CNS comme leur capacité à proliférer et migrent en réponse à une lésion.
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Protocol
Ce protocole a été approuvé par le Comité de protection de l’Animal à l’Université de Toronto et est conforme à la « Guide pour le soin et utilisation des animaux d’expérimentation » (2ème édition, Conseil canadien de protection des animaux, 2017).
1. un minimum la moelle épinière lésions chirurgie
NOTE : Avant l’opération, s’assurer que tous les instruments chirurgicaux et les matériaux sont stérilisés selon des méthodes appropriées (Figure 1 a).
- Construire une arche d’appui thoracique enroulement 4 – 5 places de gaze et ruban adhésif ensemble au milieu pour obtenir un rouleau fixe de gaze.
- Placez votre souris dans la chambre de l’induction et d’amorcer l’anesthésie à l’isoflurane 5 %. Confirmer l’absence d’un réflexe de pincée d’orteil avant de procéder, ainsi que tout au long de la procédure. Que la chirurgie peut prendre plus de 30 min pour compléter, optimiser l’exposition minimale isoflurane (5 min à 5 %) et le temps restant à 2 – 3 %.
- Transférer la souris à un cône de nez attaché à la machine d’anesthésie à la dose d’entretien de 2 – 3 % isoflurane. Tondeuses à cheveux permet de retirer la fourrure de la face dorsale de l’animal du milieu du dos jusqu'à les nuque/oreilles à exposer une zone large rectangulaire de peau pour la chirurgie.
- Transférer la souris à un instrument stéréotaxique en plaçant son nez dans le cône de nez ci-joint et en stabilisant le crâne avec des barres d’oreilles. Maintenir l’isoflurane à 5 % pendant le positionnement des barres oreille et inférieure à 2 – 3 % une fois que la souris est attachée dans l’appareil stéréotaxique.
- Administrer les analgésiques préopératoires par voie intrapéritonéale — Meloxicam (2,0 mg/kg). Généreusement appliquer lubrification des yeux dans les yeux de souris ouvert pour empêcher la dessiccation cornée quand sous anesthésie.
- Placer l’arc appui thoracique sous l’abdomen de la souris tout en redressant sur le corps de la souris et la colonne vertébrale en tirant légèrement sur la base de la queue. Laboratoire marquage ruban permet de fixer la queue et toutes les branches étendues dans une position semblable à une étoile. Une fois c’est sûr, pousser rostralement, l’arc de soutien thoracique de l’abdomen de la souris vers la partie supérieure du thorax, afin d’étayer vers le haut de la colonne thoracique (Figure 1 b).
- Préparer un champ opératoire stérile de désinfection de la surface de la peau fourrure-découpé préparée à l’étape 1.3 avec l’éthanol à 70 %, suivie de povidone-iode. Répéter deux fois. Appliquer un drapé chirurgical stérile pour maintenir un champ stérile large.
- À l’aide d’une lame de bistouri #10, pratiquer une incision verticale parallèle à l’axe longitudinal de l’animal à partir du milieu des deux omoplates à la courbure de la colonne thoracique. Rétraction de la peau pour exposer les tissus mous et le contour de la colonne vertébrale (Figure 1).
- Identifier la bordure inférieure de la garniture préscapulaire (cela délimite le niveau vertébral T4/5). Avec la même lame #10, soigneusement, mais avec force, couper le long des deux côtés de l’OS vertébral T5 et T8/9 pour détacher les tendons musculaires dos de la colonne.
- Insérez les dents des rétracteurs dans les sites de l’incision de chaque côté de la colonne vertébrale. Ajuster l’exposition en élargissant les rétracteurs pour élever suffisamment la colonne vertébrale sans mettre trop de souche sur les couches de muscles rétractés (Figure 1).
- Sous le microscope chirurgical, nettoyez soigneusement le muscle résiduel et autres tissus mous recouvrant la colonne vertébrale pour exposer l’OS vertébral (Figure 1E). Identifier les vertèbres qui seront supprimés par l’étreinte de l’apophyse épineuse de la vertèbre avec une pince crantée et en le déplaçant légèrement jusqu'à et vers le bas.
Remarque : Cela devrait permettent l’identification des joints intervertébraux et exposer les petites ouvertures (foramen intervertébral) sous les vertèbres d’intérêt. - Insérez une tête des ciseaux émoussés incurvés de part et d’autre du foramen intervertébral exposé, caudal à la lame vertébrale d’être excisées et découper les joints intervertébraux raccordement bilatéralement.
- Soulevez la lame et couper la fixation supérieure du limbe d’isoler et d’enlever l’OS.
Remarque : Ceci exposera le sac dural intact contenant la moelle épinière (Figure 1F). Il y avait peut-être excessive saignement qui peut être contrôlé en plaçant prédécoupés gaze 1 cm x 1 cm sur les zones touchées et laver avec du PBS stérile. - Avec la veine médiane dorsale agissant comme un point de repère, insérer un axe courbé 45° d’une pointe d’aiguille 30 G (avec aiguille en biseau vers le haut) dans la surface dorso-latérale de la moelle épinière (environ 1 mm de profondeur) à environ latérale de 0,5 mm de part et d’autre de la ligne médiane.
- Déplacer l’aiguille ~ 2 mm de la caudale à rostrale (parallèle à la ligne médiane) afin que toute la longueur du biseau de l’aiguille est insérée dans le cordon. Retirer l’aiguille en retraçant le parcours d’entrée (Figure 1).
Remarque : Il ne devrait y avoir aucun saignement mais un gonflement du tissu spinal peut être vu à cette étape. - Pour refermer la plaie, retirez le rétracteur et suturer les muscles du dos de chaque côté de la lésion dans la ligne médiane à l’aide d’une suture résorbable 6-0. Utilisez une suture stérile de soie de 4-0 pour fermer par la suite la peau sus-jacente.
- Pommade antibiotique à la partie supérieure de la peau superficielle suturée pour prévenir l’infection postopératoire avec la pointe d’un coton-tige. Administrer un analgésique postopératoire de 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée avec des fluides (1 mL de solution de Ringer amorcez).
- Éteignez le vaporisateur isoflurane et oxygène. Retirer la souris de l’appareil stéréotaxique et les place dans une cage propre avec aucune literie.
- Placez votre souris dans la cage d’environ 30 cm de distance une lampe pour la récupération de l’anesthésie et moniteur le comportement suivant se réveiller. La souris devrait se réveiller dans 5-10 min et ont la fonction de membre postérieur avec parésie possible et/ou de la faiblesse de la queue au réveil.
- Surveiller le comportement de la souris dans les prochains jours et de fournir des soins postopératoires appropriés et des analgésiques (c.-à-d., mash, lactate solution fluide sous-cutané, 0,1 mg/kg la buprénorphine de Ringer 2 x par jour par voie sous-cutanée pendant 2 à 3 jours et la surveillance du poids ) conformément aux règlements de l’animalerie locale et sur une base individuelle comme récupération peut varier.
2. Neurosphère Assay Dissection
Remarque : Suivez les méthodes de culture de tissu stérile adéquat tout au long de.
- Préparation de la Solution enzymatique
- Ajouter 32 mL de Earle Balanced Salt Solution (EBSS) dans la bouteille en verre contenant l’albumine ovomucoïde inhibiteur et doucement vortex jusqu'à dissolution.
- Ajouter 5 mL de EBSS dans un flacon en verre pré dosés papaïne et le placer dans un bain d’eau de 37 ° C pour dissoudre. La solution deviendra clair (Solution 1).
- Prenez 500 µL de EBSS et ajouter à la DNase pré dosée que je verre flacon pour obtenir une concentration de 1 mg/mL (Solution 2). Mélanger très doucement en inclinant le flacon en arrière et ajouter 250 µL de ce mélange à la Solution 1.
Remarque : Toutes les solutions faites (Solution 1 et 2) suffisent pour le traitement de deux morceaux de tissu. Si le traitement plus de morceaux de tissu, s’accommoder avec préparation de solution plus.
- Dissection et préparation du tissu
- Place une lingette laboratoire imbibé d’isoflurane dans la cage de la souris et laisser 2-3 min pour les vapeurs à anesthésier complètement la souris. Suivant knock-out, retirez la cage de la souris et confirmer l’absence d’un réflexe d’orteil-pincement.
- Effectuer une dislocation cervicale avec un objet contondant (c.-à-d., carte de cage métallique) pour euthanasier l’animal. Pulvérisez généreusement l’animal euthanasié à son cou au milieu dos avec l’éthanol à 70 %.
- À la base du crâne, utiliser des ciseaux pour couper la tête et le jeter dans un sac bio. Faire une incision médiane dans la peau sur toute la longueur du dos pour exposer les muscles et le contour de l’OS vertébral (Figure 2 a).
- Soulevez la face médiale de chaque omoplate (i.e., omoplate — identifié par recouvrant les coussinets adipeux) et utiliser des ciseaux pour découper les tissus mous (entre les omoplates et vertèbres). Séparé entièrement pour exposer la colonne vertébrale sous-jacente.
- Suite à la courbure de la colonne vertébrale, insérez la même paire de ciseaux dans l’ouverture thoracique supérieure et isoler la colonne vertébrale en coupant les nervures attachées, les muscles et les organes internes (Figure 2 b).
- Insérez le foramen/ouverture vertébrale caudale des ciseaux et découper les joints intervertébraux de chaque côté des limbes (face dorsale). Prendre un soin particulier à ne pas endommager le cordon d’intact. Continuez ce processus jusqu'à ce que le niveau désiré et/ou la longueur du cordon est exposée.
- Découpez soigneusement le spinal nerve(s) s’étendant latéralement de la corde avant de transférer les tissus de la moelle épinière dans une boîte de Pétri avec liquide céphalo-rachidien artificielle régulière. Conserver l’échantillon sur la glace (Figure 2).
- Sous le microscope à dissection, couper les tissus de la moelle épinière pour inclure ~ 2 mm rostrale et caudale pour le site de la lésion. Utiliser deux paires de pinces pour séparer délicatement le cordon en 2 moitiés longitudinalement le long des fissures dorsales et ventrales (Figure 2').
- Avec microciseaux, découper la matière de blanche dorsolatéral blessée. Placez la pièce dans un tube conique de 15 mL.
- Tenant une moitié de la moelle épinière vers le bas avec une pince, taquiner et éliminer les matières en blanc à l’aide d’une autre paire de pinces fines le long de la mesure Rostro de la moelle épinière pour isoler la région périventriculaire désiré. Répétez pour l’autre moitié de la moelle épinière.
- Placez des morceaux de tissu périventriculaire dans des tubes distincts 15 mL conique. Utilisez microciseaux et mâcher doucement le tissu contre les parois des tubes coniques.
Remarque : Modifications de Dissociation de tissus proviennent de papaïne Dissociation système protocole23 et tissus décrites précédemment préparation procédures24. - Ajouter 2,5 mL de nouvelle Solution 1 (étape 2.1.3) à l’échantillon de tissu et le placer sur un rocker à 37 ° C pendant 30 min.
- Doucement, triturer le tissu dans une solution avec une pointe de pipette 1 000 µL. Centrifuger la suspension de cellules nuageuses à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer la Solution 3 2,7 ml d’Earle Solution saline équilibrée, 300 µL de solution d’inhibiteur d’ovomucoïde (point 2.1.1) et 150 µL de la DNase I solution (point 2.1.3).
- Jeter le surnageant de l’étape (étape 2.2.13) et resuspendre dans 1,5 mL de la Solution 3 de l’étape précédente (étape 2.2.14).
- Couche de cette nouvelle suspension de cellules (étape 2.2.15) sur le dessus de 5 mL de solution d’inhibiteur d’ovoimucoid (point 2.1.1) dans un nouveau tube conique 15 mL pour créer un gradient de densité discontinu. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL de neurobasal médias. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de neurobasal media. Filtrer la suspension à l’aide d’une passoire de cellule de 20 µm suivie de 4 mL de médias pour un volume total de 5 mL.
- Électrodéposition
- Préparer des milieux de culture pour Neurosphère croissance en complétant les médias neurobasal avec facteur de croissance épidermique (20 ng/mL) / facteur de croissance de fibroblaste (20 ng/mL) / héparine non fractionnée (2 µg/mL) [dans les CNS définitifs] ou facteur inhibiteur de la leukemina (10 ng/mL) [pour primitifs CNS]. Ajouter 10 mL de chaque média dans une fiole de vitroplants de 25 mL.
- Utilisez un hémocytomètre et le colorant bleu Trypan pour calculer le nombre de cellules en suspension (étape 2.2.18)25. Une fois calculée, ajouter des cellules à des flacons de culture de tissus préparés (étape 2.3.1) à une densité clonale de 10 cellules/µL et lieu vitroplants fiole avec cellules supplémentaires dans l’incubateur pendant 24 h (37 ° C, humidité de 95 %, 5 % de CO2).
Remarque : Un exemple de la technique de comptage est le suivant : prendre 10 µL de la suspension cellulaire et les mélanger avec 10 µL de colorant bleu Trypan. Ajouter 10 µL de ce mélange dans un hémocytomètre. Sous un 10 X microscope photonique, compter le nombre de cellules vivantes et la somme de toutes les cellules dénombrées dans 4 des 4 x 4 quadrants. Utiliser la formule suivante : 100 000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1 000] pour donner le volume de suspension cellulaire d’être plaqué dans chaque fiole de culture de tissus de 25 mL telle densité clonale (10 cellules/µL). - Après 24h, doucement agiter le ballon et versez le contenu dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules de 1 à 2 mL de médias neurobasal frais.
- Répétez l’étape 2.3.2 pour compter le nombre de cellules en cellules suspension et plaque à densité clonale dans une plaque de culture de tissus de 24 puits contenant 500 µL de chacun de leurs médias respectifs mitogène complété (EFH pour la croissance de NSC définitive) et FRV pendant la croissance NSC primitive.
Remarque : Utilisez la formule adaptée (5 000 / [X cellules/4) x 2 x 10 x 1 000) pour calculer le volume de la suspension cellulaire d’être plaqué dans chaque cupule contenant 500 µL de médias. - Placer les plaques contenant des cellules dans un incubateur (37 ° C, humidité de 95 %, 5 % CO2) à se développer pendant 7 jours.
- Comptage
- Après 7 jours de culture, enlever les plaques et Découvre sous un microscope optique. Quantifier les neurospheres par comptage des colonies sphériques qui sont > 80 µm de diamètre pour les cultures dNSCs et > 50 µm de diamètre pour les cultures de pNSCs.
Remarque : Si vous le souhaitez, neurospheres peuvent être repiquées26 ou différenciées. Si les cellules ne sont plus nécessaires, disposer en ajoutant accélérée de peroxyde d’hydrogène dans les puits (environ 1 mL) pendant 20 min pour que la couleur du milieu se colore en jaune. Puis jeter.
- Après 7 jours de culture, enlever les plaques et Découvre sous un microscope optique. Quantifier les neurospheres par comptage des colonies sphériques qui sont > 80 µm de diamètre pour les cultures dNSCs et > 50 µm de diamètre pour les cultures de pNSCs.
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Representative Results
Après la chirurgie, les souris rencontrez minimales déficits moteurs, y comprennent la queue et la parésie membre postérieur possible jusqu'à 24 h. Passé ce délai, les souris ne rencontrez aucun membre postérieur paralysie et/ou de parésie et de changements minimes dans la démarche.
La figure 3 illustre les résultats représentatifs de l’essai Neurosphère 5 jours qui suivent la blessure minime de la moelle épinière. Le nombre absolu de neurospheres dérivés dNSC (cultivé dans EFH) est supérieur aux numéros des neurospheres pNSC dérivés (cultivé en FRV) après une blessure (figures 3 a et 3 b, respectivement). Des images de puissance supérieure d’un Neurosphère définitif (Figure 3) et un Neurosphère primitif (Figure 3D) révèlent des différences dans l’apparence de ces colonies distinctes avec neurospheres définitif étant plus gros diamètre (≥80 µm) et généralement ayant un grand centre foncé. Neurospheres primitifs sont plus petits en taille (≥ 50 µm) et les cellules sont plus serrés. Un nombre représentatif de neurospheres provenant de différentes régions de la moelle lésée est visibles dans la Figure 3E (timbres) et 3F (primitives). Montre figure 3E que SCI minime provoque une augmentation significative dans neurospheres issues du canal central au niveau de la lésion par rapport à une augmentation relativement modeste à la rostrale cordon non lésés.
Fait intéressant, neurospheres définitif peut être généré sur le site de la lésion, une région qui ne contient-elle pas les cellules formant Neurosphère laminectomie seule souris. 3F figure montre une augmentation similaire de pNSCs après l’accident à l’exception du pNSC neurospheres sur le site de la lésion. Par conséquent, seulement dNSCs sont capables de migrer vers l’endroit de la blessure dans ce temps cours après l’accident.
Figure 1 : intervention chirurgicale. (A) la mise en page de tout besoin, numérotées pour référence. (B) une photo de la souris dans un appareil stéréotaxique avec un corps redressé, colonne vertébrale et des membres étalés et scotché avec appui thoracique arch placée sous. (C) une photo de la souris avec une incision verticale peau exposant la couche musculaire et le contour de la colonne vertébrale. (D) une photo du corps de la souris après incisions musculaires et l’exposition et l’isolement de la colonne vertébrale avec rétracteurs. Notez les couches de muscles tendus à l’absence de déchirure. (E), une photo de la colonne vertébrale de souris isolé avec des couches musculaires retirés, montrant la surface osseuse de la vertèbre (3 segments). Cela montre aussi l’apophyse épineuse et éventuellement l’articulation intervertébrale et limbe de milieu vertèbre à supprimer. (F), une photo de la laminectomie postérieure visible la moelle épinière. Marquée est la veine médiane dorsale. (G), un photo de la souris avec des blessures par voie bilatérale aiguilles de chaque côté de la veine médiane dorsale. Il y a un insert gros plan de l’axe courbé 45° d’aiguille 30 G. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dissection de la moelle épinière. (A) A photo de souris décapitée avec l’incision cutanée de la ligne médiane pour exposer les muscles dorsaux et l’image (B), un contour d’OS vertébral de la colonne vertébrale isolée, montrant l’orientation rostrale et caudale. La deuxième photo montre l’isolement du cordon et le troisième représente la moelle épinière isolée dans une boîte de Pétri. (C), une représentation graphique de la dissection fine de la moelle épinière, où les différents segments (périventriculaire, zone de la blessure) sont enlevés et séparés pour la culture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : représentant résulte de dosage Neurosphère suite à un minimum de la moelle épinière. (A) le nombre de dérivés dNSC neurospheres (cultivé dans EFH) d’échantillons de la moelle épinière lésée est supérieur à (B) le nombre de dérivés pNSC neurospheres (cultivées dans le FRV) lorsque plaqué à densité égale. (C, D) Images de puissance plus élevée de neurospheres « typiques » dans les cultures de dNSC (C) et (D) pNSC. (E) aiguille Minimal des voies préjudice est le résultat des augmentations significatives du nombre de neurospheres dNSC dérivé de canal central au niveau des blessures ainsi que le canal central rostral à la blessure et du site de la lésion. (F) dérivés pNSC neurospheres ne peut pas être isolé du cordon pas blessé mais peut être isolé à la suite de blessures causées par le canal central (au niveau de la lésion et du canal central rostral). Barres d’erreur représentent erreur type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Au cours de l’intervention chirurgicale, il y a quelques étapes critiques où le chercheur devrait accorder une attention particulière aux afin d’obtenir des résultats optimaux et de réduire la variabilité entre les animaux. Il faut avec l’anesthésie par inhalation (isoflurane) au cours de la chirurgie comme l’anesthésie s’est avéré avoir des effets neuroprotecteurs avec exposition prolongée27. Par conséquent, lorsque l'on étudie la capacité de régénération de la moelle épinière après une blessure, faire un effort pour pratiquer cette opération aussi rapidement et efficacement que possible afin d’éviter des variables confusionnelles. Conservant le même temps d’exposition isoflurane par souris permettra de réduire la variabilité. Le rythme de la respiration de la souris doivent être surveillé tout au long de la chirurgie et ne devrait pas être trop lent (moins 1 souffle chaque 2-3 s) ou très laborieuse (c.-à-d., haletant). La dose d’entretien de l’anesthésie peut être abaissée de 2 à 3 % pour prévenir les décès dus à l’anesthésie prolongée avec la note de souris qui ont reçu la dose plus faible.
Au cours de la chirurgie, prendre des précautions supplémentaires lors de l’exécution des incisions musculaires de chaque côté de la colonne vertébrale. S’assurer que les coupes sont profondes, et que la lame est positionnée en dedans afin que le bord de la lame bute contre les vertèbres osseuses au cours de l’incision musculaire. Si la lame est inclinée vers l’extérieur, il y a la possibilité de saignements excessifs de compressions vasculaires. Le chercheur devrait également prêter une attention particulière lors de l’exécution de la laminectomie pour éviter la pêche profonde des ciseaux qui peuvent endommager la moelle épinière, provoquant des lésions tissulaires indésirables et des déficits fonctionnels. Le contrôle approprié de ces expériences est un groupe de « laminectomie uniquement » (sans blessure), qui permettra une comparaison de l’activation des CNS attribuée à la blessure de piste aiguille opposé à celui qui peut résulter de la laminectomie seulement. Nous avons montré que cette laminectomie seule peut entraîner une augmentation faible, quoique non significatif dans l’activation du NSC telle que révélée par l’augmentation du nombre de Neurosphère de la région périventriculaire au niveau de la lésion21. Laminectomie seule ne provoque pas des augmentations Neurosphère nombre de la région périventriculaire rostrale ou caudale à la laminectomie et aucun neurospheres ne se trouvent dans les cultures de matière blanche isolée au niveau de la laminectomie. En outre, lorsque vous effectuez la laminectomie, prendre soin d’enlever la lamina dorsale en un seul morceau pour permettre une exposition étendue du cordon. Ce (1) permettra un accès suffisant effectuer de la blessure de voie minimale de l’aiguille de la moelle épinière dorso-latérale et (2) empêcher les segments d’os de laissés pour compte et causant des dommages secondaires, suivant le mouvement de fermeture et après récupération de la souris. Si le limbe entier n’est pas pris comme une seule pièce, ou segments d’os pointus qui dépassent de chaque côté de la laminectomie sont observés, utilisez instruments (tels que les pinces crantées et ciseaux courbes) pour supprimer ces fragments avant suture.
Le chercheur devrait être extrêmement prudent lorsque vous appliquez des sutures de la couche musculaire lors de la fermeture chirurgicale. Une suture (double-noué) doit être placée caudale au niveau de la laminectomie/blessures afin que la suture se trouve sur le dessus de l’OS vertébral intact. Ceci permet d’éviter tout dommage secondaire pouvant résulter de la suture musculaire étant en contact avec le cordon exposé lorsque la souris se déplace après récupération. En outre, la suture musculaire caudale à la laminectomie/blessure agit comme un point de repère pour où la SCI a été effectué lors de l’isolement de la moelle épinière pour l’analyse. Il faut en disséquant la zone de la moelle épinière lésée pour ne pas compromettre la structure de la région lésée afin qu’il peut rester reconnaissable au cours de la dissection fine sous le microscope à dissection. En ce qui concerne le dosage Neurosphère, il est important d’effectuer la trituration mécanique de cellule pellets doucement pour éviter la production de bulles d’air qui peuvent augmenter la mort cellulaire. neurospheres pNSC dérivés sont encore plus sensibles aux conditions de croissance forte, de débris — trituration excessive et une exposition prolongée à des solutions enzymatiques — par rapport aux cultures dNSC. pNSC dérivé sphères sont plus compact et plus petit que dNSCs. Compte tenu de la rareté des pNSCs, nous vous recommandons d’isoler au moins 240 000 cellules par exemple.
Le modèle SCI minimal est idéal pour étudier les événements cellulaires après une blessure (par exemple, l’activation des CNS endogènes), mais elle ne permet pas l’étude des déficiences fonctionnelles. Tel que noté précédemment, souris qui récupérer de la blessure de piste aiguille n’expérience aucun déficits comportementaux notables qui persistent et à ce titre, les souris ne peuvent être évaluées pour l’efficacité des interventions thérapeutiques visant à améliorer les résultats fonctionnels. Un aspect important de la médecine régénérative est qu’un traitement ne devrait pas seulement promouvoir la réparation des tissus (qui peut être évaluée à l’aide de ce modèle, en association avec le dosage Neurosphère, suivi de lignée et d’immunohistochimie/immunofluorescence) mais devrait aussi démontrer pertinente amélioration fonctionnelle à l’aide de paradigmes comportements, le cas échéant. Un certain nombre de tâches comportementales utilisées pour tester les résultats fonctionnels dans les modèles thoraciques de blessures telles que le critère de la faute de pied et la Basso, Beattie, Breshnan (BBB) Open Field Scale locomotrice28, n’est pas assez sensible pour détecter des déficits mesurables dans nos minimes Modèle SCI. Pour pallier cet inconvénient, on peut faire usage de systèmes notation numériques plus sensibles (p. ex., passerelle) qui mesure plusieurs paramètres des paramètres brut et fine patte locomotion, y compris des analyses de marche, qui peuvent détecter les minimes déficits résultant de la blessure minime du modèle29.
Cette méthode pourrait également être adaptée pour étudier l’activation endogène de NSC comme une thérapie potentielle dans les modèles de lésion de la moelle épinière cervicale. SCI du col utérin est le modèle plus cliniquement pertinent et nous proposons qu’adapter ce modèle de blessures aux segments vertébraux supérieurs serait donnent un aperçu si il y a des variations régionales dans la réponse du CNS et de leur progéniture (cinétique, migration, différenciation) et si la lésion se traduirait par des déficits fonctionnels plus profondes et plus mesurables. Les modèles de lésion cervicale murin actuellement utilisé (par exemple la transection, compression de clip ou contusion) nécessitent des soins post-opératoire intensif, y compris la nécessité d’exprimer manuellement les vessies et de constamment surveiller la respiration de la souris. Adaptation du modèle de blessure minime à la moelle épinière cervicale peut réduire la mortalité, de morbidité et de soins postopératoires associés avec d’autres modèles SCI cervicales ainsi que permettre d’examiner l’efficacité des molécules de médicaments/petite et/ou de réadaptation résultats sur le recouvrement des neurones. Notre modèle de blessures peut être adaptée pour créer une blessure minime dans différentes parties du cordon (c'est-à-dire, les colonnes dorsales ou latérales) et/ou des lésions plus grandes avec une pénétration plus profonde et/ou de l’utilisation des aiguilles de tailles plus grandes (plus petit calibre). Cela permet au chercheur de contrôle/manipuler le type et la taille de la lésion et ainsi évaluer récupération cellulaire et fonctionnelles/comportement en conséquence.
Le modèle de blessure minime chez la souris permet l’utilisation de modèles animaux transgéniques. Les modèles de souris permettent de marquage des cellules souches endogènes et/ou progéniteurs avant l’accident. Cela peut permettre au chercheur de suivre le sort de ces cellules préalablement marquées après une blessure et évaluer la prolifération des cellules précurseurs neurales, migration et différenciation suite blessure — potentiellement contribuer à la réparation neuronale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est financé par la Fondation Krembil (subvention de fonctionnement CMM). WX a été le récipiendaire de la bourse d’études de Carlton Marguerite Smith. NL a reçu une bourse d’études supérieures de l’Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
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