Summary
Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.
Abstract
A fadiga é um comum e debilitante condição que afeta a maioria dos pacientes com câncer. Até à data, restos de fadiga mal caracterizados com nenhum diagnóstico teste para medir objetivamente a gravidade dessa condição. Aqui nós descrevemos um método otimizado para avaliar a função mitocondrial de PBMC coletadas de pacientes com câncer fatigados. Usando um sistema compacto fluxo extracelular e injeção sequencial de inibidores respiratórias, examinamos estado funcional mitocondrial de PBMC medindo basal respiração mitocondrial, capacidade respiratória e fenótipo de energia, que descreve a via preferencial de energia para responder ao estresse. PBMCs frescos estão prontamente disponíveis na prática clínica usando padrão flebotomia. O ensaio todo descrito neste protocolo pode ser concluído em menos de 4 horas sem o envolvimento de técnicas bioquímicas complexas. Além disso, descrevemos um método de normalização que é necessário para a obtenção de dados podem ser reproduzidos. Os métodos de procedimento e normalização simples apresentados permitem para coleta de amostra repetida do mesmo paciente e geração de dados reprodutíveis que podem ser comparados entre os pontos de tempo para avaliar os efeitos potenciais do tratamento.
Introduction
A fadiga é uma condição prevalente e angustiante que tem um impacto negativo sobre a qualidade de vida dos pacientes de câncer1. Até esta data, fadiga de câncer permanece mal definida e depende apenas de comunicação subjetiva pelos pacientes2. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar um teste de laboratório de diagnóstico facilmente adaptável para caracterizar objectivamente fadiga no ambiente clínico3,4.
Vários mecanismos subjacentes, incluindo disfunção da mitocôndria, têm sido propostos para causar fadiga5. As mitocôndrias são as organelas de potência, fornecendo a 95% das necessidades de energia celular através da fosforilação oxidativa e desempenham um papel importante na sinalização de cálcio, apoptose, sinalização imune e regulamento de outros de eventos de sinalização intracelular6 . Da mesma forma, prejudicada bioenergética mitocondrial e defeitos na produção de energia podem contribuir para fadiga. Apoiam esta hipótese, estudos anteriores observaram mutações no DNA mitocondrial em pacientes com síndrome de fadiga crônica7. Enquanto isso ainda não está claro se a origem fisiopatológico da fadiga encontra-se dentro do sistema nervoso central ou periféricos tecidos, como músculos esqueléticos8,9, não existe actualmente nenhum método directo para avaliar com precisão disfunção mitocondrial relacionada à fadiga em células vivas, desoxigenadas.
Usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) para estudar a função mitocondrial oferece várias vantagens. Primeiro, PBMCs estão prontamente disponíveis na prática clínica usando flebotomia padrão e podem ser isolados rapidamente utilizando técnicas básicas de laboratório. Em segundo lugar, coleta de sangue é menos invasiva do que a coleta de outros tecidos como uma biópsia muscular. Assim, amostras de sangue podem ser coletadas do paciente mesmo várias vezes ao longo do tempo, o que facilita a avaliação longitudinal dos efeitos do tratamento. Curiosamente, função mitocondrial em PBMCs aparenta ser bem correlacionados com status mitocondrial de rim em um modelo animal de10. Além disso, mitocôndrias de células imunes tem sido usadas como um proxy para detecção de alterações sistêmicas sob condições de diferentes doenças11,12. Mitocôndrias nas células do sistema imunológico de circulação são particularmente sensíveis a mudanças nas funções imunes e imune de sinalização moléculas tais como citocinas13,14,15. Por exemplo, tem sido observado que PBMC de pacientes com doenças inflamatórias reumáticas agudas apresentam alta de base de consumo de oxigênio14. Em contraste, o consumo de oxigênio foi reduzido em PBMCs isoladas de pacientes com condições inflamatórias sistémicas, incluindo sepse16. Sob condições inflamatórias, radicais livres produzidos por mitocôndrias disfuncionais pode contribuir mais elevado estresse oxidativo e inflamação prolongada17. O papel central da mitocôndria na produção de energia, bem como em estresse oxidativo sugere o potencial utilitário de usando a função mitocondrial como um proxy para o estudo de fadiga em pacientes de câncer 13.
Estudos anteriores, examinando a função mitocondrial utilizaram técnicas bioquímicas, medição do potencial de membrana mitocondrial ou isolamento de populações de células específicas que não podem ser facilmente adaptável ao ambiente clínico5, 14,18. Nos últimos anos, o desenvolvimento de ensaios de fluxo extracelular permitiu aos pesquisadores facilmente e com precisão, examinar as mudanças na taxa de consumo de oxigênio (OCR) em resposta às injeções automatizadas de inibidores respiratória19,20 , 21 , 22. no entanto, a maioria desses estudos é projetada para tipos específicos de células e o grande formato de alto rendimento pode não ser aplicável em um ambiente clínico. Este manuscrito, descrevemos um protocolo otimizado para examinar a função mitocondrial para uso clínico.
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Protocol
O estudo atual (NCT00852111) foi aprovado por institucional Review Board (IRB) do National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Os participantes inscritos no presente estudo foram homens euthymic, 18 anos de idade ou mais velhos, que foram diagnosticados com câncer de próstata não-metastático, com ou sem prévia prostatectomia e estava programado para receber a terapia de radiação de feixe externo (RT). Potenciais participantes foram excluídos se eles tinham uma doença progressiva que pode causar fadiga significativa, doença psiquiátrica dentro dos últimos cinco anos, tive hipotireoidismo não corrigido ou anemia, ou tinha uma segunda malignidade. Indivíduos que usavam sedativos, esteroides ou agentes anti-inflamatórios não-esteroides também foram excluídos. Amostras de sangue de controle saudáveis foram obtidas na medicina NIH departamento de transfusão de doadores saudáveis sob um protocolo aprovado IRB (NCT00001846). Todos os participantes são recrutados no Magnuson Clinical Research Center no NIH. Escrito assinados informado consentimentos foram obtidos antes da participação do estudo.
1. preparação de medição de função mitocondrial (1º dia do experimento)
- Hidratar o cartucho do Sensor (ver Tabela de materiais; aproximada duração: 5 min).
- Retire o cartucho do Sensor da embalagem. Adicionar a solução de Calibrant 200 μL em cada poço da placa de utilidade e, em seguida, encha cada fosso com solução de Calibrant 400 μL.
- Placa de Sensor retorno para a placa de utilitário, que agora tem a solução de Calibrant nele. Hidrate o cartucho numa incubadora não-CO2 37 ° C durante a noite.
Nota: O Sensor cartucho precisa ser hidratado por um mínimo de 4 h e máximo de 72 h.
2. preparação da amostra clínico (2º dia do experimento)
- Fadiga de medida usando o item de 13 funcional avaliação de doença terapêutica crónica - fadiga (FACIT-F)2,23,24 na linha de base (antes da iniciação de RT), ponto médio e conclusão de RT e 1 ano pós-RT.
- Use um 0 - 4 escala para cada resposta a um item, onde 0 representa "nada" e um 4 indica que o entrevistado refere-se à instrução correspondente "muito obrigado". Escores totais devem variar de 16-53, com menor pontuação refletindo fadiga de alta intensidade.
- Defina fadiga como uma contagem de FACIT-F inferior a 43, com uma pontuação de FACIT-F de ≥43, indicando ausência de ou de fadiga não clinicamente significativo2.
Nota: O placar de 43 melhores FACIT-F divide escores de fadiga de pacientes com câncer e a população em geral2. - Incluem os seguintes 13 itens da escala de fadiga FACIT: 1) sinto-me cansado; 2) Sinto-me fraco tudo acabado; 3) eu me sinto apático ("desbotada"); 4) Sinto-me cansado; 5) eu tenho dificuldade para iniciar as coisas, porque estou cansada; 6) eu tenho dificuldade para terminar as coisas, porque estou cansada; 7) tenho energia; 8) eu sou capaz de fazer minhas atividades habituais; 9) preciso dormir durante o dia; 10) eu estou cansado demais para comer; 11) preciso de ajuda para fazer minhas atividades habituais; 12) estou frustrado por estar muito cansado para fazer as coisas que quero fazer; e 13) tenho que limitar minha atividade social, porque estou cansado.
- Isolar o PBMC de amostras de sangue coletadas recentemente (aproximado de duração: 1h).
- Coletar 8 mL de sangue em um tubo de preparação de células mononucleares (ver Tabela de materiais).
Nota: Amostras de sangue devem ser processadas até 2 horas após a coleta. A qualidade de PBMC pode ser comprometida se as amostras de sangue são processadas mais de 2h após a coleta da amostra. - Centrifugar a 1.750 x g, durante 30 min à temperatura ambiente (18-25 ° C). Transferi a camada nublada para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar até 15 mL de PBS e inverter 5 vezes.
- Centrifugar a 300 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Retire cuidadosamente e desprezar o sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com a adição de 10 mL de PBS e inverter 5 vezes.
- Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o líquido sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS. Transferi os PBMCs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Centrifugar a 610 x g durante 10 minutos. Cuidadosamente Retire o sobrenadante e ressuspender em RPMI-1640 completo (RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 10mm penicilina/estreptomicina).
- Coletar 8 mL de sangue em um tubo de preparação de células mononucleares (ver Tabela de materiais).
- Revestimento de placas de célula para células não-aderente (aproximado de duração: 30 min).
- Preparar a solução adesiva de células e tecidos (ver Tabela de materiais) diluindo a solução estoque em bicarbonato de sódio de 0,1 M pH 8,0. A solução deve ser em 3,5 μg/cm2 de área de superfície.
Nota: Esta solução contém proteínas de polifenólicos extraídas do marinho mexilhão, Mytilus edulis. Estas proteínas são componentes-chave da colagem secretada pelo mexilhão para ancorar-se às superfícies. Achamos que a célula-Tak funciona melhor com PBMC. - Adicionar 100 μL de solução diluída adesiva a cada poço e incubar durante pelo menos 20 min em temperatura ambiente. Lavar três vezes com água Desionizada e ar seco.
- Preparar a solução adesiva de células e tecidos (ver Tabela de materiais) diluindo a solução estoque em bicarbonato de sódio de 0,1 M pH 8,0. A solução deve ser em 3,5 μg/cm2 de área de superfície.
3. mitocondrial função medição
- Preparação de meios de ensaio (aproximado de duração: 10 min).
Nota: Mídia de ensaio deve ser preparadas no dia do experimento.- Adicione L-glutamina, piruvato e glicose à base de mídia (mesmos componentes como modificado águia de Dulbecco médio (DMEM), mas sem bicarbonato de sódio, glicose, glutamina ou piruvato de sódio) para fazer o ensaio de mídia. Aquecer a mídia a 37 ° C, então ajuste o pH para 7,4.
Nota: As concentrações de glicose, piruvato e L-glutamina são geralmente as mesmas concentrações em meios de crescimento normal, mas podem ser ajustadas baseadas no ensaio.
- Adicione L-glutamina, piruvato e glicose à base de mídia (mesmos componentes como modificado águia de Dulbecco médio (DMEM), mas sem bicarbonato de sódio, glicose, glutamina ou piruvato de sódio) para fazer o ensaio de mídia. Aquecer a mídia a 37 ° C, então ajuste o pH para 7,4.
- Prepare-se para o teste de estresse de Mito PBMCs (aproximado de duração: 2h).
- Placa suficiente PBMCs do passo 2 para cada poço para alcançar a confluência de 80-90%. Em nossa experiência, de 1,5 x 105 células/poço produziu os resultados mais consistentes.
Nota: Poços A e H são poços de fundo e devem conter apenas meios de ensaio com nenhuma célula. Em poços B a G, recomendamos chapeamento poços de pelo menos 3-6 por amostra do paciente para dar conta valores atípicos. - Gire os pratos para baixo a 200 x g por 2 min permitir que as células aderir ao fundo dos poços. Lave as células uma vez com mídia de ensaio. Nesta etapa remove soro e bicarbonato de sódio a mídia de crescimento.
Nota: Na nossa experiência, a etapa de lavagem remove tipicamente 20-30% das células. - Adicione mídia de ensaio 180 µ l em cada poço, incluindo poços de fundo A e H. Incubar em uma incubadora de 37 ° C não-CO2 por 45-60 min.
- Placa suficiente PBMCs do passo 2 para cada poço para alcançar a confluência de 80-90%. Em nossa experiência, de 1,5 x 105 células/poço produziu os resultados mais consistentes.
- Executando o teste de Stress do Mito
- Reconstitua drogas no Mito Stress Kit com mídia de ensaio da seguinte forma:
- Oligomicina: Adicione mídia de ensaio μL 252 dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.
- FCCP: Adicione 288 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.
- Antimycin A / rotenona: Adicionar 216 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 25 μM.
- Vórtice reconstituído drogas durante aproximadamente 1 minuto. Dilua em soluções de trabalho.
Nota: As concentrações das soluções de trabalho devem ser tituladas e pre-determinadas antes do experimento, dependendo do tipo de célula. Por PBMC, encontramos que 1 μM de oligomicina, 1 μM Compararia e 0,5 μM antimycin A / o melhor trabalho de rotenona. - Pipete as drogas para cada porta no cartucho sensor sequencialmente:
- R: Porto pipeta 20 μL de 10 μM oligomicina, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.
- Porta b: pipeta 22 μL de 10 μM Compararia, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.
- C Porto: Pipeta 25 μL de 5 μM antimycin A / rotenona para uma concentração final em cada poço de 0,5 μM.
- Reconstitua drogas no Mito Stress Kit com mídia de ensaio da seguinte forma:
- Selecione "teste de estresse do Mito" um instrumento de fluxo extracelular. Siga o prompt de instrumento e insira o cartucho de sensor. O aparelho executará automaticamente a calibração do sensor. Insira a placa de células após a calibração do sensor e o instrumento vão terminar o resto do ensaio. Dinâmica de oxigênio é medida a 530 nm (excitação) / 650nm (emissão), e a concentração de prótons é medida a 470 nm (excitação) / 530 nm (emissão).
4. normalização de dados função mitocondrial
- Preparar a solução de ensaio de proliferação de células (aproximado de duração: 5 min).
- Adicionar 48 mancha de ácido nucleico μL (500 x) e supressor de fundo 240 μL a 11,7 mL de PBS (2x). A mancha de ácido nucleico é um corante de ligação a DNA a célula-permeant, e o supressor de fundo é um corante de mascaramento que bloqueia as células mortas ou células com integridade comprometida da membrana celular de ser manchado. A combinação entre o corante de ligação a DNA e o supressor de fundo garante que as células só ao vivo estão manchadas.
- Adicione igual volume de solução de trabalho (180 μL) de 2x diretamente no meio de cada poço após o teste de estresse do Mito foi concluída.
- Incubar as células na presença de solução de ensaio de proliferação de célula em uma incubadora de 37 ° C por 45-60 min Quantify o número de células vivas (fluorescente) em um leitor de placa no 508 nm (excitação) / 527 nm (emissão) e normalizar dados OCR (aproximado de duração: 10 min) .
Nota: além da números células vivas, os usuários podem também optar normalizar seus dados com o número total de células, a quantidade de ácido nucleico, as concentrações de proteína, etc.
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Representative Results
O teste de estresse de Mito baseia-se em medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) após injeção sequencial de vários inibidores respiratórias para mapear um perfil mitocondrial completo. Medições de OCR após cada injecção de droga pode ser usada para calcular os seguintes parâmetros relacionados com a saúde mitocondrial: OCR Basal mede-se primeiro antes de qualquer injeção de drogas para avaliar o consumo de oxigênio necessário para atender a demanda de ATP nível de repouso. Respiração basal é calculada subtraindo-se a taxa de respiração mitocondrial-não da linha de base OCR antes da injeção de oligomicina. Em seguida, oligomicina é injetada para inibir o canal de protões da ATP sintase (complexo V). A subsequente queda no OCR após injeção de oligomicina representa o consumo de oxigênio relacionadas à produção de ATP. FCCP (cianeto de carbonila 4-[trifluorometoxi] phenylhydrazone), um ionóforo usado para interromper o gradiente de protões e o potencial de membrana mitocondrial, é usado para eliciar o consumo máximo de oxigênio. Respiração máxima é calculada subtraindo-se a respiração não-mitocondrial de OCR o máximo após injeção Compararia. Capacidade respiratória é a diferença entre respiração máxima e basal. Por último, o antimycin (um complexo inibidor de III) e a rotenona (complexo eu inibidor) são injetados ao mesmo tempo para cortar a cadeia de transporte electrónico. Por definição, respiração mitocondrial-não é independente da cadeia de transporte de elétrons (por exemplo, não-mitocondrial NADPH oxidase em macrófagos, etc.) e é representado como valores de OCR após antimycin A / injeção de rotenona. Eficiência de acoplamento descreve a fração do consumo basal de oxigênio mitocondrial usado para a síntese de ATP e é calculada como 100% x (OCR relacionadas à produção de ATP) /(basal respiration rate).
Densidade de célula para cada condição de cultivo deve ser otimizada antes de executar um teste de estresse de mito. Em nossa experiência, a confluência de 80-90% é conseguida chapeamento de 1,5 x 105 células/poço de PBMC recentemente isolada do sangue humano (Figura 1A). Esta densidade de chapeamento de contas para a etapa de lavagem descrita na etapa 3.2.3. Além de determinar a densidade ideal do chapeamento, titulação Compararia deve ser executada para determinar a concentração necessária para gerar a máxima OCR. A Compararia concentrações testadas - 0.125 μM, 0,25 μM, 0.5 μM, 1 μM e 2 μM - OCR aumentou com a concentração de Compararia atingir um platô em 1 μM, mas diminuiu a 2 μM (Figura 1B). Isto indica que 1 μM é a concentração de Compararia ideal que deve ser usada para examinar a função mitocondrial PBMC.
Testamos a função mitocondrial do mesmo lote de células da mesma amostra de sangue coletada de um doador saudável em vários pontos de tempo após o isolamento de PBMC. O consumo basal de oxigênio, bem como OCR máxima diminuiu tão cedo como 3h e continuou a diminuir em 5 e 8 h após isolamento PBMC(Figura 2). Depois de 3 h, respiração máxima provocada pela injeção FCCP (pontos de tempo 7-9) não exceder OCR basal, sugerindo que, mesmo em células vivas, mitocôndrias poupe capacidade respiratória diminui rapidamente ao longo do tempo. Taxa de acidificação do extracelular (ECAR) simultaneamente foi medida em um instrumento de fluxo extracelular. Desde oligomicina inibe mitochondrial ATP sintase, a glicólise é recrutado em poucos minutos para atender a demanda de energia e para compensar a falta de produção de ATP via fosforilação oxidativa, como demonstrado pelo aumento rápido da ECAR depois oligomicina injeção. Logo em 3 h após isolamento PBMC, houve uma diminuição na ECAR, bem como OCR (Figura 2B). Embora nós não observaram qualquer mudança notável na viabilidade celular em 1, 3, 5 e 8 h após isolamento PBMC, função mitocondrial diminuiu rapidamente, sugerindo que o momento é chave para capturar o perfil mitocondrial de PBMC desoxigenado, ao vivo.
Coleções de amostra do paciente tendem a ocorrer em vários momentos em dias separados; assim, é crucial normalizar os dados para comparar diferentes amostras e pontos de tempo. Enquanto outros métodos de normalização, como a proteína do ensaio e quantificação de ácidos nucleicos pode ser usada, nós achamos que a coloração de células vivas com um corante de ligação a DNA e a quantificação de células fluorescentes verdes em cada poço é a normalização mais eficiente e confiável método. Dados representativos de PBMC coletado de dois doadores saudáveis diferentes em dois dias separados são mostrados na Figura 3. Inserir uma imagem representativa de uma placa de células bem mostrando células totais (contraste de fase) e células vivas manchada com o corante de ligação a DNA (verde fluorescente) após teste de estresse de mito. Taxa de consumo de oxigênio basal, bem como o consumo de oxigênio após cada injecção de droga normalizada para células vivas foram semelhantes nos dois diferentes saudáveis não fatigado doadores (Figura 3).
Dados de função mitocondrial representativa de um sujeito fatigado (Pontuação FACIT-F < 43) com câncer de próstata (vermelho) e um idade/sexo/raça-combinadas não fatigado saudável doador (azul) são mostrados na Figura 4. Embora nós não observaram diferença no OCR basal (Figura 4B), o assunto fatigado exibido diminuiu o consumo máximo de oxigênio, bem como a capacidade respiratória em relação ao controle (Figura 4C, D). Fadiga parecia estar relacionada com a redução na capacidade respiratória, porque não havia diferenças encontradas no consumo de oxigênio não-mitocondrial (Figura 4E), consumo de oxigênio de ATP-relacionados (FdaFigura 4), ou acoplamento de eficiência (Figura 4G). Dados da linha de base (antes de qualquer injeção de drogas) e respiração máxima após injeção Compararia pode ser visualizada usando uma trama de fenótipo de energia, que revela o caminho preferencial (OCR da fosforilação oxidativa e glicólise ECAR) na presença de aumento demanda de energia (Figura 4H). Quadrados vazios indicam fenótipo basal de energia e sólidos quadrados indicam o fenótipo de energia em resposta à demanda máxima de ATP. A distância entre o basal (casa vazia) e máximo (quadrado sólido) indica a capacidade não utilizada, considerando a inclinação indica a preferência de celular para a fosforilação oxidativa e glicólise. Como mostrado na Figura 4H, capacidade não utilizada no assunto fadiga diminuída em comparação com o controle saudável não fatigado. Além disso, o fenótipo de energia em resposta ao aumento da procura de ATP desviada para glicólise no assunto fatigado comparado ao controle (Figura 4H) saudável.
Figura 1 : PBMC chapeamento densidade e curva de dose-resposta FCCP. (A) recém isolado PBMCs foram banhados em 1.5 x 105 células/poço em miniplacas de cultura de células CellTak-revestido. Após a lavagem e muda de mídia, as células foram distribuídas uniformemente na confluência de 80-90%. Barra de escala = 100 μm. (B) aumentou de OCR com concentrações crescentes de Compararia em 0.125 μM, 0,25 μM, 0.5 μM, atingindo pico OCR em 1 μM. OCR caiu em 2 μM, indicando que 1 μM é a dose ideal para provocar respiração máxima em barras de PBMCs.Error indicam o desvio padrão de 3 medições sequenciais após a injeção de droga inicial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Respiração mitocondrial diminui ao longo do tempo em PBMC recentemente isolado. OCR (A) , bem como ECAR (B) diminuiu rapidamente ao longo do tempo após o isolamento de PBMC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Dados de respiração mitocondrial representativa com normalização. Teste de stress do mito foi realizado usando frescos PBMCs isoladas de dois voluntários saudáveis diferentes em dias diferentes e normalizada usando uma mancha fluorescente ácido nucleico quantificada em um leitor de placa fluorescente. Baixo-relevo: uma imagem representativa de células vivas (verde) e o total de células (contraste de fase) em um poço. Barra de escala = 1.000 μm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise de representante de um sujeito fatigado, em comparação com um controle saudável. (A) representante Mito estresse teste OCR gráfico de um sujeito fatigado, comparado a um idade/sexo/raça-combinadas não fatigado saudável controle. Gráficos de barra de basal OCR (B), respiração máxima (C), sobra a capacidade respiratória (D), consumo de oxigênio não-mitocondrial (E), produção de ATP (F)e eficiência de acoplamento (G) são mostrados. A trama do fenótipo de energia do sujeito fatigado e controle saudável é mostrada (H). Quadrados vazios indicam fenótipo de energia de base, sólidos quadrados representam fenótipo estressado energia medido após a injeção de FCCP. Barras de erro indicam o desvio padrão de 3 poços diferentes para cada participante do estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Fadiga em pacientes com câncer é uma condição debilitante que não está bem definida ou caracterizada1. Diagnóstico da fadiga depende inteiramente subjetivo relatórios e não há nenhum padrão atual de diagnóstico ou tratamento para essa condição, em grande parte devido à falta de entendimento em sua Patobiológico2. Dos propostos mecanismos subjacentes fadiga em pacientes com câncer, deficiência na função mitocondrial é uma das vias mais terapeuticamente targetable. Portanto, nós desenvolvemos um método rápido e prático para medir a função mitocondrial em amostras clínicas que podem ser usados para identificar proativamente os pacientes em risco para o desenvolvimento de toxicidades relacionadas ao tratamento de câncer incluindo fadiga, tão tão cedo gestão pode ser interposto.
A tecnologia de fluxo extracelular em combinação com injeção sequencial de inibidores respiratórias permitem a avaliação do estado funcional mitocondrial e tem sido usado para ambos em vitro e em vivo modelos19, 20,21. Temos expandido o corpo existente de trabalho e desenvolveu um método otimizado para exame de disfunção mitocondrial em amostras clínicas. Uma vantagem do estudo é a utilização do analisador compacto fluxo extracelular. Como temos demonstrado, sincronismo do experimento é crucial após isolamento de PBMC fresca de sangue humano. Enquanto o maior formato (96 poços ou 24-bem) é a escolha ideal para uma experiência de alto rendimento, o sistema de fluxo extracelular compacto, que contém 8 poços, permite a avaliação individual de cada paciente amostra19. Este método é mais prático e econômico (tanto no que se refere ao instrumento em si e para os reagentes utilizados para realizar o ensaio), porque a coleta de amostra de pacientes diferentes tendem a ocorrer em várias vezes em dias diferentes.
A utilização de PBMC para avaliar a função mitocondrial em pacientes com câncer fatigados tem várias vantagens: 1) biópsia de tecidos como os músculos esqueléticos pode ser impraticável às vezes; 2) PBMCs estão prontamente disponíveis e podem ser facilmente isoladas utilizando tubos de preparação da célula, que oferece uma vantagem prática em um ambiente clínico; e 3) temos demonstrado que a função mitocondrial diminui depois de células recém isoladas na cultura há mais de 3 horas e isolando a tipos específicos de célula normalmente leva várias horas (mais de 3 horas). PBMC pode ser preparado na hora, garantindo assim a precisão da medição em tempo real função mitocondrial. Enquanto nós recomendamos usar PBMCs para a investigação clínica inicial em populações de pacientes previamente descaracterizadas, outros tipos de células como linfócitos T, plaquetas, neutrófilos e monócitos também podem ser usados com o atual protocolo depois da otimização do chapeamento densidade e inibidor respiratório concentrações15,25,26.
Antes do teste de função mitocondrial em um novo sistema, é preciso primeiro determinar a densidade de célula ideal e a concentrações Compararia. Em nossa experiência, chapeamento de 1,5 x 105 células por poço garante que a densidade celular após chapeamento e o confluente de 80-90% de restos de passo lavar. Além disso, é crucial determinar as concentrações de FCCP ideais para cada tipo de célula. Concentrações uma gama de FCCP devem ser testados e a concentração de FCCP que produz máxima OCR sem comprometer a saúde de uma célula deve ser usada. Nas concentrações testadas, 1 μM de Compararia resultou na respiração máxima em PBMC. Outro passo crítico é o momento do experimento, como gotas de respiração mitocondrial precipitadamente 3 horas após o isolamento de PBMC. Isto significa que o teste de estresse do mito deve ser realizado dentro de 3 horas após a coleta de amostra para capturar com precisão a função mitocondrial em uma amostra clínica. Vale salientar que muitos pesquisadores só têm acesso a amostras congeladas. Nós testamos anteriormente PBMCs após congelamento e descongelamento, e as funções mitocondriais dessas células são bastante comprometidas. Portanto, recomendamos que usando recentemente isolados PBMC em estudos clínicos, quando é viável.
Outro aspecto importante de geração de dados reprodutíveis é o método de normalização de dados. Enquanto alguns laboratórios tiveram sucesso usando quantificação de proteína BCA para normalizar dados de respiração mitocondrial, achamos que nem sempre é viável, especialmente em uma densidade celular baixa. O método de normalização descrito neste protocolo baseia-se a correlação linear entre o número de células e a emissão de fluorescência dos complexos ácidos nucleico tintura e com precisão pode quantificar células de 10 a 50.00027. Além disso, usando uma combinação de mancha fluorescente do ácido nucleico e um leitor de placa fluorescente de normalização permite rápida quantificação de células vivas após a conclusão do experimento. Além disso, este método não requer tripsinização de células aderentes ou com uma espátula de célula.
Uma ressalva do protocolo é que nós não separamos PBMCs em tipos específicos de células antes de realizar a análise funcional mitocondrial. Como temos demonstrado, respiração mitocondrial diminui rapidamente ao longo do tempo após o isolamento de PBMC. Isto sugere que as diferenças entre os pacientes podem ser imprecisas se o experimento foi realizado após isolar populações de células diferentes, que geralmente leva algumas horas. Mesmo que estudar as populações mistas como PBMC não revela informações específicas do tipo de célula importante, informações obtidas de experimentos usando PBMCs podem ajudar guia futuro mecanicista as investigações sobre tipos específicos de célula. PBMC serve como um proxy para a disfunção mitocondrial sistêmica, que é relevante para distúrbios sistêmicos como câncer fadiga10,28. O protocolo descrito no manuscrito atual apenas fornece uma medida bruta da disfunção mitocondrial sem identificar a causa da observação. Portanto, descobertas usando esta tecnologia e o procedimento devem ser interpretadas com cautela e deve-se considerar a natureza multifatorial da fadiga, tais como sua co-ocorrência com outros comportamentos (por exemplo, depressão, sono, comprometimento cognitivo) e condições (por exemplo, a cardiopulmonares status, Polifarmácia). Estudos futuros devem examinar alterações nas funções mitocondriais em tipos de células específicas (por exemplo, a células assassinas naturais, linfócitos T e monócitos) e em várias populações clínicas (por exemplo, pacientes com câncer fatigado/não-fatigado e controles saudáveis). Enquanto isso está além do escopo do manuscrito atual, determinaremos as associações entre a severidade de fadiga de câncer e disfunção mitocondrial, bem como a correlação entre as medições da função mitocondrial e testes físicos de fadiga como um teste de caminhada de 6 minutos, no futuro as investigações. Além disso, estudos futuros também examinará a disfunção mitocondrial em outros tipos de câncer a fim de determinar se a fadiga através de vários tipos de câncer é associada com disfunção mitocondrial. Em conclusão, temos desenvolvido um protocolo otimizado para uma avaliação rápida de gerais disfunções mitocondriais, usando amostras clínicas. Mais investigações mecanicistas podem ser realizadas para identificar o envolvimento dos percursos específicos nesta condição debilitante.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo é totalmente suportado pela divisão de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de enfermagem pesquisas de NIH, Bethesda, Maryland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
References
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