Summary
Her viser vi hvordan du bruker en nærhet Ligation analysen (PLA) for å visualisere MST1/MST2 heterodimerization i fast celler med høy følsomhet.
Abstract
Regulert protein-protein interaksjoner er en retningsgivende for mange signalnettverk arrangementer, og oppdagelsen av slike hendelser er et viktig element i å forstå hvordan slike veier er organisert og hvordan de fungerer. Det finnes mange metoder å oppdage protein-protein interaksjoner i celler, men relativt få kan brukes til å oppdage interaksjoner mellom endogene proteiner. En slik metode, nærhet ligation analysen (PLA), har flere fordeler å anbefale bruk. Sammenlignet med andre vanlige metoder for protein-protein samhandling analyse, PLA har relativt høy sensitivitet og spesifisitet, kan utføres med minimal celle manipulasjon, og, i protokollen beskrevet her, krever bare to mål-spesifikke antistoffer avledet fra ulike arter (f.eks., fra mus og kaninen) og en spesialisert reagens: et sett med sekundær antistoffer som covalently knyttet til bestemte oligonucleotides at når brakt i nærheten av hverandre, opprette en amplifiable plattform for i situ PCR eller rullende sirkel forsterkning. I denne presentasjonen viser vi hvordan du bruker PLA teknikken for å se endringer i MST1 og MST2 nærhet i fast celler. Teknikken er beskrevet i dette manuskriptet er særlig aktuelt for analyse av celle signalisering studier.
Introduction
Avbrudd MST1/Hippo signalnettverk er koblet til utviklingsforstyrrelser og kreft1. I pattedyr, aktivere kinaser MST1 og MST2 (phosphorylate) MOB1 og LATS1/2, som deretter phosphorylates og deaktiverer transcriptional co aktivatoren Ja-assosiert protein (YAP)2. I sin aktive (unphosphorylated) form har YAP kreftfremkallende aktivitet, styrke transkripsjon av celle spredning gener; motsatt, når YAP er inaktivert av Hippo veien, celle spredning er undertrykt og apoptose forfremmet3. I vev, MST1 og MST2 finnes hovedsakelig som aktiv homodimerer, men kreftfremkallende stimuli kan øke nivåene av MST1/MST2 heterodimerer, og slike heterodimerer er inaktiv4. Hvordan MST1/MST2 heterodimerization er regulert imidlertid dårlig forstått. Både homo- og heterodimerer er formidlet via interaksjoner mellom C-terminalen kveilet-coil regionene MST1 og MST2 kjent som SARAH domener5. Bruke en i situ vist PLA i denne artikkelen viser vi tilstedeværelsen av MST1/MST2 heterodimerer i menneskelig Schwann celler (HSC) og menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293). PLA har en fordel over andre protein/protein samhandling gjenkjenningsmetoder fordi gjør påvisning av endogene protein-protein interaksjoner, som kan identifiseres og kvantifisert uten behovet av transgene uttrykk eller bruk av epitope tags 6.
Signalnettverk signaltransduksjon trasé er i stor grad kontrollert av betinget association komponent proteiner. For eksempel fører stimulering av de fleste receptor tyrosine kinaser til homo - eller hetero-dimerization og påfølgende tilknytning ekstra intracellulær signalnettverk proteiner, som selv skjemaet ytterligere komplekser. Formålet med metoden PLA er å visualisere nærhet mellom proteiner i celler, forutsatt at proteiner er mindre enn 30-40-nm fra hverandre. Protein nærhet oppdages vanligvis av første rugende cellene med passende primære antistoffer i ulike arter (f.eks., kanin og mus) mot hver samspill protein, deretter legge artsspesifikke sekundære antistoffer, pre kombinert til korte DNA sonder. Hvis DNA sonder i nærheten, kan en bestemt kobling DNA oligonucleotide samtidig binde begge disse sonder, danner en plattform for forsterkning ved i situ PCR eller rullende sirkel mekanisme. Fluorescerende kodene til forsterkning reaksjonen kan visualisering av samspill proteiner, som vises som fluorescerende prikker som lett kan kvantifisert og lokalisert til bestemte regioner i cellen7,8, 9 , 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av løsninger
- Forberede etappe, den stabiliserende løsning: 4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS. 10 mL, ta 2,5 mL av 16% PFA og legge 7,5 mL 1 x PBS.
Farer: PFA er kreftfremkallende ved lave doser. Røyk og hudkontakt er farlig. Butikken på 20 ° C. - Forberede permeabilization løsning: 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS. For 100 mL løsning, kan du legge 100 µL av Triton X-100 til 100 mL 1 x PBS. Lagre ved romtemperatur (RT).
- Forbered vaskebuffer: 1 x TBST. 1 L, ta 100 mL 10 x TBS, dH2O 890 mL og 10 mL mellom 20 (10%).
- Forberede blokkerer løsning som leveres av kit. Alternativt bruke 1 x PBS løsning som inneholder 2% BSA.
- Forberede den antistoff fortynningsmiddel som leveres av kit. Alternativt bruke 1 x PBS løsning som inneholder 1% BSA.
2. plating av celler
Merk: I denne studien brukte vi udødeliggjort menneskelige Schwann cellene (iHSC) og menneskelige embryonale nyre 293 (HEK 293); men kan denne metoden brukes for mange typer tilhenger celler.
- Kultur HEK 293 i DMEM med 10% FBS, 0,2% glukose, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin på vev kultur-behandlet plater på 37 ° C i 5% CO2. Opprettholde iHSC i 10% FBS/DMEM supplert med penn/Strep og 2 µM forskolin. Rutinemessig teste celler for mycoplasma. Ingen celle linje godkjenning ble utført.
- Coat et 16-vel kammer lysbilde med 50 µL av 10 µg/mL naturlig musen laminin eller 0,01% poly-L-lysine løsning og ruge i 30 min på 37 ° C i 5% CO2. Dele celler med 0,04% trypsin-EDTA.
- Plate iHSC og HEK-293 i 100 µL av medium på 80% samløpet (15,000-25,000 celler/vel).
- Inkuber celler for 12-24 timer på 37 ° C i en fuktet, 5% CO2 inkubator.
3. fiksering og Permeabilization
- Fjerne mediet fra brønnene og vaskes med 100 µL av 1 x PBS. Sug opp brønnene å minimere risikoen for fjerne prøven med.
- Fastsette celler ved å legge til 50 µL på 4% PFA per godt og ruge i 10 min på RT, uten agitering. Celler er følsomme for avdeling, så unngå pipettering løsningene direkte på cellene.
- Vask cellene med 0,05% TBST tre ganger i 5 minutter hver. Sug opp brønnene å minimere risikoen for fjerne prøven med.
- Behandle cellene med permeabilization løsning (0,1% Triton x-100 i 1 x PBS) for 10 min uten agitering på RT.
- Vask celler med TBST tre ganger i 5 min hver med agitering.
4. blokkerer
- Trykk av TBST (svært forsiktig med brønnene). Visualisere lysbildet i et mikroskop for å se hvis celler forblir tilkoblet.
- Legg en dråpe (50-60 µL) 1 x blokkerer løsning til hvert utvalg.
- Forvarm en fuktighet kammer (tom tips boks med vann) på 37 ° C og Inkuber lysbildene i det 1t på 37 ° C.
5. primære antistoffer
- Fortynne primære antistoffer (1: 100) i antistoff fortynningsmiddel (se Tabell for materiale). Forberede 40 µL antistoff løsning per brønn.
- Fjerne blokkering løsningen fra lysbilder ved å trykke av væske. Tillat ikke celler tørke.
- Vortex og legge 40 µL av antistoff løsninger i hver brønn.
- Inkuber 1t på 37 ° C i en forvarmet fuktighet kammer.
6. nærhet Ligation analysen sonder
Merk: PLA sonder leveres som en del av en kit (se Tabell for materiale). Valg av sonder avhengig av arten av primære antistoffer brukes til å oppdage proteiner av interesse.
- Fortynne de to PLA sonder (anti-musen MINUS og anti-kanin PLUS) 1:5 i antistoff fortynner. For hver prøve, forberede 40 µL av PLA probe. Inkuber blandingen for 20 min på RT.
- Trykk av primære antistoff løsningen fra lysbildene. Vask lysbildene to ganger i 5 min hver med vaskebuffer på RT.
- Forsiktig tapper av vaskebuffer fra lysbilder og legge fortynningsmiddel PLA sonde løsningen brønner (40 µL/vel).
- Inkuber lysbildene i en forvarmet fuktighet kammer 1t på 37 ° C.
7. ligation
Merk: Den i situ oppdagelsen reagenser røde, Ligase og Ligation løsning leveres som en del av en kit (se Tabell for materiale).
- Bruke i situ oppdagelsen reagenser Red.
- Umiddelbart før bruk, vortex og fortynne de nødvendige mengder 5 x ligation lager 1:5 i høy renhetsgrad vann.
Merk: Ikke lagre utvannet reagenser. - Trykk på PLA sonde løsningen fra lysbildene. Vaske lysbildene i 1 x vaskebuffer to ganger i 5 min hver på RT.
- Umiddelbart før tillegg til utvalgene, vortex og legge til Ligase til Ligation løsning 1:40 fortynning og vortex igjen.
- Trykk av vaskebuffer fra lysbildene og legge Ligation/Ligase løsningen i hver brønn (40 µL/vel).
- Inkuber lysbildene i en forvarmet fuktighet kammer i 30 min på 37 ° C.
8. forsterkning
Merk: Forsterkning aksjen tilbys som en del av et kit (se Tabell for materiale). Reagenser er lysfølsom; dermed unngå å utsette lysbildene til lys.
- Vortex og fortynne de nødvendige mengder 5 x forsterkning lager 1:5 i høy renhetsgrad vann og bland.
- Trykk av hemorroider/Ligase løsningen fra lysbildene. Vaske lysbildene i 1 x vaskebuffer to ganger i 2 minutter hver på RT.
- Vortex og legge polymerase til forsterkning løsningen på 1:80 fortynning og vortex igjen.
- Tap av vaskebuffer fra lysbildene og legge forsterkning/Polymerase løsningen i hver brønn (40 µL/vel). Inkuber lysbildene i en forvarmet fuktighet kammer for 100 min på 37 ° C.
9. forberedelse for Imaging
Merk: Dette er lys følsom reagenser. Holde lysbildene beskyttet mot lyset.
- Trykk av forsterkning-Polymerase løsningen fra lysbildene og vaske to ganger for 10 min hver i 1 x vaskebuffer på RT.
- Fjern kamre og silikon rundt brønnene fra lysbildet helt. Skrap av de gjenværende bitene av silikon med en barberhøvel. Tegne et rutenett på lysbildet skille dem fra hverandre godt.
- Legge til ~ 40 µL av montering mediet med DAPI. Være forsiktig for å unngå overtrykk luftbobler under cover slip. Kantene av cover slip kan tettes med neglelakk.
- Vent minst 20 min før du utfører bildeanalyser med AC confocal mikroskop.
Merk: Protokollen kan pauses her. - Etter avbildning, lagrer du lysbildene på 20 ° C i mørket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte PLA analysen teste samspillet mellom MST1 og MST2 i HEK-293 og iHSC. Cellene var fast, permeabilized og farget med ulike antistoffer, etterfulgt av i situ forsterkning i henhold til PLA protokollen (figur 1). For å dokumentere nivået på MST1/MST2 heterodimerization, var celler farget med MST1 og MST2 antistoffer (figur 1A, 1 C, og 1 G). Som en positiv, vi også brukt ERK og pERK antistoffer som forventes å være i nærheten i celler med aktivert ERK (figur 1B og 1F). Celler mangler MST1 og MST2 viser ingen PLA signal (figur 1 c). Celler med bare én av to antistoffer likeledes viser ingen PLA signal (figur 1G). Disse resultatene tyder på at HEK-293 celler og iHSC celler inneholder MST1/MST2 heterodimerer, samsvar med tidligere funn fra vårt laboratorium4. Som en ekstra negativ kontroll ruges vi celler med ERK og MST2 primære antistoffer vise spesifisitet av signaler (figur 1 d og 1 H).
For å bekrefte nivåer av MST1 og MST2 uttrykk, utdrag fra WT og MST1/MST2 knockout HEK-293 celler, henholdsvis, ble analysert av immunoblot med angitte antistoffer (figur 1I).
Figur 1 : Representant PLA data. (A-H) Cellene ble fast og farget med angitte antistoffer etterfulgt av PLA. Blå: DAPI, rød: PLA signal. Photomicrographs ble oppnådd med et Leica SP5 AC confocal mikroskop. (I) Immunoblot for MST1 og MST2. Skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi fant det nyttig å bruke glass kammer lysbilder for dette eksperimentet, som det er veldig praktisk å utføre eksperimenter med flere (14-16) linjer og det er ikke nødvendig å endre utvalget hver gang under mikroskopi analyse. Noen komplikasjoner kan oppstå, som økt risiko for kryssforurensning med antistoffer. Derfor foreslår vi vaske hver brønn individuelt istedet for benytter en Coplin krukke, til tross for økt varighet av eksperimentet. I tillegg, fjerning av silikon sette er en delikat affære og må gjøres med forsiktighet og tålmodighet. Selv med grundig teknikk er det noen ganger mulig å se små mengder silikon rester etter fjerning innsatsen. Derfor må man fjerne silikon sette omhyggelig, med et barberblad eventuelt som mye unremoved silikon kan endre AC confocal avstanden under mikroskopi. Det kan også være nyttig å trekke linjer som kantlinjer brønner etter fjerner silisium innsatsen for å finne celler under mikroskop.
Det er viktig å bruke ikke-cross reaktive primære antistoffer at hver gjenkjenner bare ett medlem av heterodimer (f.eks MST1 antistoffer bør ikke også gjenkjenner MST2 og omvendt). Også er det viktig å huske å bruke ulike tips for å unngå kryss-kontaminering av primære antistoffer og PLA sonder, å unngå å berøre bunnen av brønnen og unngå pipettering direkte over prøver. Vi fant at for iHSC, er det bedre å belegge kammer lysbilder med 0,01% poly-L-lysine løsning, og HEK-293 er det bedre å frakk med musen 10 µg/mL laminin.
Som med noen prosedyre, finnes det noen begrensninger av denne metoden. PLA analysen, er mens en kraftig metode for alle grunnene ovenfor, begrenset av spesifisitet og følsomhet av antistoffer. Videre skal antistoff konsentrasjoner og celle kultur betingelsene være finstemt før laboratorieforsøk er konfigurert til å redusere kostnadene ved analyser. I den forbindelse er et alternativ til å redusere kostnadene for analyser bruke ubestrøket 35 mm glass-bottom rett i stedet for kammer lysbilder.
En fordel med analysen er at intensiteten og antall fluorescerende prikker kan kvantifiseres bruker ulike datamaskinen programmer som Blob-finder programvaren, Duolink Image verktøyet og th Olink Bioscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker hele Chernoff laboratorium for bidra til optimalisering og validering av denne protokollen, særlig Maria Radu og Galina Semenova. Vi takker også Andrey Efimov av cellen Imaging anlegget ved Fox Chase Cancer Center. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (R01 CA148805) å JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
