Summary
여기, 선물이 식-진 균 abscessus 상호 작용을 공부 하는 두 개의 프로토콜: 세균 세포내 결핍 및 RNA에서 세균 세포내 transcriptome 결정 transposon 돌연변이 라이브러리의 심사 시퀀싱. 두 방법 모두 게놈 장점과 transcriptomic 적응 세포내 박테리아 체력 향상에 대 한 통찰력을 제공 합니다.
Abstract
인간 대 식 세포에 의해 식 균 작용을 저항 하는 기능 및 이러한 셀 안에 번 식 능력은 다른 마저 mycobacteria에서 진 균 abscessus 차별화. 이러한 독성 특성 기본 구조 폐 질환, 낭 성 섬유 증, 기관지 확장 증, 결핵 등으로 취약 한 호스트에서 특히 병원 성 M. abscessus 를 렌더링합니다. 어떻게 환자 M. abscessus 감염 될 불분명 남아 있습니다. 많은 mycobacteria 달리 M. abscessus 환경에서 찾을 수 없습니다 하지만 amoebae, M. abscessus에 대 한 잠재적인 저수지를 나타내는 환경 식 세포 안에 있는 수 있습니다. 실제로, M. abscessus amoebal 식 균 작용에 저항 이며 내 아메바 인생 감염의 실험 모델에서 M. abscessus 독성을 증가 것으로 보인다. 그러나, 약간 그 자체에 M. abscessus 독성에 대 한 알려져 있다. M. abscessus 세포내 생활 이점이 부여 하는 유전자를 해독, M. abscessus transposon 돌연변이 라이브러리의 심사는 개발 되었다. 병렬로 amoebae 공동 문화 후 세포내 Mycobacteria에서 RNA 추출의 방법 개발 되었다. 이 메서드는 검증 되었고 전체 M. abscessus 의 시퀀싱을 허용 세포; 내부 transcriptomes 처음으로, 세포내 생활에 적응 하는 M. abscessus 에 글로벌 보기를 제공합니다. 두 방법 모두 인간의 기도 식민지로 M. abscessus 있도록 M. abscessus 독성 요인에 대 한 통찰력 주세요.
Introduction
속 진 균 종 무해 마저 유기 체에서 주요 인간 병원 체에 이르기까지 포함 되어 있습니다. 결핵균, 진 균 marinum 진 균 ulcerans 등 잘 알려진 병원 성 종 느린 성장의 하위 그룹에 속하는 mycobacteria (SGM). 반면, 급속 한 성장 비율 mycobacteria (RGM) 한 천 매체에 7 일 이내에 보이는 식민지를 형성 하는 그들의 기능에 의해 특징입니다. RGM 그룹 이상 180 종, 비 병원 성 마저 mycobacteria 주로 구성 되어 있습니다. RGM 그들의 호스트와 상호 작용에 대 한 연구는 주로 진 균 smegmatis 에 초점을 맞춘을 이러한 mycobacteria 대 식 세포의 살 균 작용에 의해 빠르게 제거 됩니다 설명.
진 균 abscessus 병원 성 인 간에 게는 드문 RGM 중 하나 이며 다양 한 피부 및 연 조직 감염에서 폐와 전파 감염에 이르기까지 감염에 대 한 책임입니다. M. abscessus 가 간주, 진 균 avium, 함께 낭 성 섬유 증 환자1주 mycobacterial 병원 체.
M. abscessus 에 수행 하는 다양 한 학문이 진이 균은 세포내 병원 체, 세포와 폐에 RGM에서 일반적으로 관찰 되지 않는 피부 섬유 아 세포의 살 균 응답 살아남을 수 있는 처럼 동작 표시 2 , 3 , 4. M. abscessus 게놈 분석 환경 미생물 토양 접촉에서 일반적으로 발견 하는 대사 경로 확인 했다, 식물 및 수 중 환경, 무료 amoebae는 종종 제시5. 그들은 또한 M. abscessus 수집 수 유전 교환에 유리한 틈새에서 수평 한 유전자 이동에 의하여 아마 인수 마저 및 비 병원 성 RGM에 없는 여러 가지 독성 유전자에 어우러진 시연 했다 다양 한 아메바 내성 박테리아입니다.
실험적으로, 첫 번째 눈에 띄는 결과 중 하나는 M. 결핵6에 관해서는 뿐만 아니라 세포에서 세포내 성장의 M. abscessus 관찰 했다. M. abscessus 또한 phagosome apoptosis, autophagy, 감염2에 세포질 저항의 세 가지 필수적인 메커니즘 산성화 저항. 그것은 심지어 M. abscessus 는 phagosome cytosol, 세균성 곱하기2를 선호 수 있습니다 더 많은 영양분이 풍부한 환경 간의 즉각적인 통신을 설정할 수가 표시 되었습니다. 아주 작은 게놈 장점 M. abscessus 소유 또는 세포내 환경에서 생존을 허용 하는 인수에 대 한 알려져 있다. 아메바 coculture 진 균 massiliense7,8로 많은 새로운 아메바 내성 세균의 분리를 허용 하는 효율적인 방법입니다. Amoebae 내에서 증식 하는 능력의 M. abscessus4증가 독성 부여 수 쥐에 M. abscessus 에의 aerosolization 모델에 관찰 되었다. 1 개의 가설은 이다 M. abscessus phagocytic 세포, 다른 비 병원 성 RGM 다른에서 살아남기 위해이 환경 내에서 발생 하는 유전 특성을 개발 했다. 이러한 인수 능력을 확산과 인간의 호스트의 독성 부탁 수 있습니다.
이 보고서에는 도구와 amoebae 환경에서 살아남으려면 M. abscessus 에 수 여 하는 게놈 장점 강조 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적에 대 한 M. abscessus transposon 돌연변이의 심사는 처음 설명, Acanthamoeba castellanii 유형 변형, 세포 성장에 대 한 돌연변이 결함 식별 수 있는에. 대 식 세포에서 두 번째 심사는이 결함 인간의 호스트에서 지속 되는지 확인 하, 또한 보고 됩니다. 둘째, 이해 하는 메커니즘은 M. abscessus phagocytic 생활 적응에 무력화 세포 및 동물의 호스트, 특별히 M. abscessus 에 대 한 적응 방법에에서 그것의 독성은 증가 개발, 공동 문화 후 amoebae 존재 하는 내부 amoebal 박테리아에서 총 RNA 추출 허용. 결과적으로, 세포내 생명에 필요한 M. abscessus 유전자의 포괄적인 보기 개발 되었다.
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Protocol
1. 라이브러리 심사
- 테네시 돌연변이 도서관의 건설
- Transposon 라이브러리를 가져옵니다.
참고:이 실험을 위해 transposon 돌연변이 라이브러리 E.J. 루빈, 하버드 대학 공중 보건의, 보스톤, 미국에서 얻은 했다. 도서관은 phagemid M. abscessus 단일 Tn의 임의 삽입 허용에 도입 된는 M. abscessus 복잡 한 (M. abscessus subsp. massiliense)의 부드러운 임상 스트레인 (43S)에서 건설 되었다 따 디뉴클레오티드 (91,240 M. abscessus 게놈 시퀀스 TA)에. 대 한 자세한 내용은 참조의 루빈 외. 9 및 Laencina 외. 10.
- Transposon 라이브러리를 가져옵니다.
- 라이브러리 및 격판덮개에 M. abscessusTn 돌연변이의 보존의 적정
참고:이 1 주일 걸립니다.- 라이브러리는 얼음에 녹여 물 (10-1 10-15) 1 mL에 직렬 희석을 수행 하 여 세균 농도 결정 합니다. 각 희석 250 mg/mL 대와 7 H 11 한 천 매체를 포함 하는 배양 접시에 한 방울 접시 3-4 일 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
참고: 여기, 1011 박테리아/mL의 적정 발견 했다. - 라이브러리의 농도 결정 한 후 라이브러리의 25% 글리세롤-물 10 mL에 3000 박테리아/mL의 최종 농도를 희석. 약 수 각 관에서 도서관의 1 mL와 10 cryotubes에서 라이브러리. -80 ° c.에 aliquots 저장
- 때 사용 하 고, 얼음에 희석된 라이브러리의 한 약 수를 해 동 하 고 37 ° c.에 외피의 3-4 일 후 200 ~ 300 개별 식민지를 복구 하는 도서관의 100 µ L 10 평방 뮬러-힌 튼 (MH) 한 천 배지 (크기 12cm)를 추가 준비
- 살 균 이쑤시개, 전송 7 H의 200 µ L 9 매체와 0.2% 글리세롤, 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보완 가득 96 잘 접시에 개별 식민지 (60 x 96 잘 접시에 약 6000 식민지)와 떨고 없이 5 일 동안 37 ° C에서 품 어.
- 7 H 9의 100 µ L를 포함 하는 96 잘 접시를 문화 (1.2.4 단계) 100 µ L를 전송 40% 글리세롤과 중간. -80 ° c.에 정렬된 라이브러리를 저장
- 1.2.3 단계를 반복 합니다. 1.2.5 하. 10000 개별 클론까지 라이브러리의 나머지와 함께 (약 100 x 96 잘 접시와 30 수소 접시) 복구 됩니다.
- 라이브러리는 얼음에 녹여 물 (10-1 10-15) 1 mL에 직렬 희석을 수행 하 여 세균 농도 결정 합니다. 각 희석 250 mg/mL 대와 7 H 11 한 천 매체를 포함 하는 배양 접시에 한 방울 접시 3-4 일 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- Amoebae의 준비
- 실내 온도 (RT) 셀 라인11의 확대를 위한 PYG 매체 (표 1) 30 mL에 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 아메바 Acanthamoeba castellanii (AC) 문화.
참고: 수많은 소화 그들으로 큰 접착 세포에서 성숙한 trophozoites 현미경에 명확 하 게 볼 수 있습니다. 시간을 두 배로 셀 25 헤 셀 수 있었다 증폭 매 3 일 마다 1/3의 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 초기 문화를 확산 하 여 추정 된다. - 25 mL 피 펫을 PYG 매체를 제거 합니다. AC 버퍼 (표 2), 모든 탄소 또는 질소 소스12를 포함 하지 않는의 10 mL로 세포 세척. 두 번 더 세척을 반복 합니다.
참고: 없습니다 탄소 또는 질소 소스를 포함 하는 AC 버퍼 mycobacteria의 extracellular 성장을 방지 합니다. 이 최소 매체 amoebae의 encystment에 지도 한다. 이 제한, 열 비활성화 대장균 amoebae를 기판 (1.4 단계)으로 추가 했다 고 문화를 매우 짧은 시간 (48 h 돌연변이 검사에 대 한) 및 RNAseq 실험 4 h 또는 16 h 문화 승진 했다. 또는, 하지만 농축이 매체를 사용 하 여 PYG 매체 (보통 10%). - 조직 배양 플라스 크의 단일 활발 한 악수 술병의 바닥에서 아메바를 분리 합니다.
- 수 셀 셀 농도 5 × 105 amoebae/mL를 조정 하려면 hemocytometer AC 버퍼에 희석.
- 실내 온도 (RT) 셀 라인11의 확대를 위한 PYG 매체 (표 1) 30 mL에 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 아메바 Acanthamoeba castellanii (AC) 문화.
- 준비의 열 활동 되지 않 ㄴ 대장균 박테리아 감염 후 아메바를 피드
- 37 ° c.에 하룻밤 100 ml Luria 국물 (파운드)의 글리세롤 재고에서 대장균 임상 격리 스트레인 성장
- 50 mL 튜브에 10 분 동안 1,835 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 수확. 폐기는 상쾌한. 10% 글리세롤-물 10 mL와 펠 릿 resuspend 두 번 더 세척을 반복 합니다.
- 10% 글리세롤-물 5 mL와 펠 릿 resuspend 1.5 mL 튜브에 aliquot 0.5 mL입니다. 수행 하는 직렬 희석 파운드 한 천 배지에서 희석을 추가 하 여 박테리아/mL의 금액을 결정 합니다. -80 ° c.에 aliquots 저장
- 아메바 감염 전에 하루 한 약 수 얼음에 녹여 고 열 살인 튜브 60 분 동안 70 ° C에서 배양 하 여 계속 합니다.
참고: 파운드 한 천 배지를 37 ° c.에 하룻밤 사이에 비활성된 박테리아의 100 µ L를 도금 하 여 비활성화 확인 아니 식민지 문화의 1 박 후 표시 됩니다. - 열 살해 박테리아 AC 버퍼의 50 µ L에 107 박테리아의 농도를 희석 하 고 더 이상 1 주일에 4 ° C에서 희석된 박테리아를 저장 합니다.
- Amoebae-M. abscessus 테네시 돌연변이의 공동 문화: 처음 화면
참고:이 6000 돌연변이의 심사에 대 한 3-4 개월 걸립니다.- 5 x 104 amoebae/잘 AC 버퍼의 100 µ L에서 96 잘 접시에 확산. 32 ° C에서 1 시간 흔들어 없이 품 어. 우물에 부동 아메바 trophozoïtes 시간을 허용 합니다.
- 잠복기, 하는 동안 1 시간에 대 한 얼음에 박테리아를 녹여.
- 전자 멀티 채널 피 펫과 해 동된 박테리아 문화 5 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시 테네시 돌연변이 주식에서에서 6000 개별된 클론 주위 1.5 헤 스크린에 대 한 감염.
참고:는 나는 알려진 프로토콜;의이 단계에서 그러나, 테네시 돌연변이 포함 하는 모든 96 잘 접시는 정확 하 게 같은 방식으로 재배 했다. 이 첫 번째 화면 inoculum 밀도 변화를 고려 하지 않고 세포내 결핍 돌연변이 신속 하 게 식별 하는 것을 목표로. - 감염의 1.5 h 후 96 잘 접시 살 균 gauzes 연기 후드 AC 매체를 제거 하는 소독된 금속 트레이에 배치에 반전. AC 매체의 200 µ L로 리필. 이 세척 두 번 더 반복 합니다.
- 나머지 extracellular mycobacteria 제거를 100 µ g/mL amikacin와 보충 하는 신선한 매체의 200 µ L를 추가 합니다.
- 3 추가 빨 래와 함께 진행 하기 전에 2 시간에 대 한 품 어 (단계 1.5.3에서에서와 같이). 세척, 후 AC 버퍼의 200 µ L에서 50 µ g/mL amikacin와 문화를 유지 합니다.
- 5 x 107 열 비활성화 (1.4 단계)에서 대장균 박테리아 감염과 amoebae의 encystment를 방지 하기 위해 모든 24 h의 끝에 추가 합니다.
- 공동 문화 48 h 후 10 µ L 10 %SDS (라우릴 황산 나트륨)의 각 음을 추가 하 여 세포를 lyse와 32 ° c.에 30 분 동안 품 어 직렬 희석 진행 합니다 고 컬럼비아 한 천 배지 포함 하는 것은 세포내 mycobacteria의 수 평가 5% 양 혈액 (COS 접시)에 추가 합니다. 접시는 parafilm으로 밀봉 하 고 37 ° c.에 품 어
- 때 식민지 3-4 일 후, 사진 접시 한 접시에 표시 하 고 세균성 식민지의 가장 낮은 번호와 함께 입금을 관찰 하 여 세포 성장을 위한 장애인 돌연변이 식별 합니다.
참고: 모양, 높이 또는 식민지 (그림 1A)의 밀도 대 한 상관 하지 않습니다. 136/6000 돌연변이 발견 됐다.
- 5 x 104 amoebae/잘 AC 버퍼의 100 µ L에서 96 잘 접시에 확산. 32 ° C에서 1 시간 흔들어 없이 품 어. 우물에 부동 아메바 trophozoïtes 시간을 허용 합니다.
- Amoebae-M. abscessusTn 돌연변이의 공동 문화: 첫 번째 화면 동안 확인 된 돌연변이의 두 번째 화면
참고:이 2 주 걸립니다. 두 번째 화면 136 감쇠 돌연변이 얻은 첫 번째 화면 후 주사 하는 박테리아의 수를 정확 하 게 및 세포내 생존 박테리아 2 일 감염 된 후 수 척도를 함께 수행 되어야 합니다.- 50 mL에 각 영향 을된 돌연변이의 1 식민지 성장 튜브 가득 7 H 20 mL 9 매체와 0.2% 글리세롤 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보충. 허용 지 수 단계에 도달 하는 박테리아 (0.6 < OD < 0.8).
- 원심 분리 (1,835 x g 10 분 동안) AC 매체에 의해 문화를 씻어. 폐기는 상쾌한. 반복이 씻어 두 번의 7 H 20 mL와 함께 더 많은 9 매체와 0.2% 글리세롤 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보충 합니다.
- AC 버퍼의 5 mL에 박테리아 resuspend
- 콜로 니 형성 단위 (CFU) 돌연변이의 농도 결정 합니다. 24-잘 접시에서 두 첫 번째 행에 물 1 mL를 추가 합니다. 첫 번째 잘을 100 µ L 세균성 정지를 추가 합니다. micropipette와 세 번 혼합 합니다. 그런 다음, 발음 100 µ L와 두 번째 입금 잘.
- 새로운 팁 잘 12까지 세 번째, 등 두 번째 우물에서 1.6.4 단계를 반복 합니다.
- 10-12 희석의 30 µ L 발음 하 고 COS 접시에 추가 합니다. 다른 희석에 대 한 반복 합니다.
- Parafilm으로 COS 플레이트를 포장 하 고 37 ° c.에 3-4 일 동안 품 어 식민지를 계산 하 여 농도 결정 합니다.
- AC 공동 문화 매체의 1 mL에 잘 당 5 x 104 아메바와 24-잘 접시에 3 중에서 위에서 설명한 대로 공동 문화 분석을 수행 합니다. 10의 감염 (MOI)의 다양성으로 예방.
- 1.5.7 단계에서 설명한 대로 공동 문화 48 h 후 세포 세포의 용 해와 함께 진행 합니다. 직렬 희석 물 (10-1 10-6)에서 수행 하 고 COS 번호판 30 µ L를 추가 합니다. CFU 계산 진행 하기 전에 37 ° C에서 4 일 동안 격판덮개를 품 어.
참고:이 두 번째 화면 후 136 돌연변이의 60은 보존 됩니다. - 돌연변이 세포 안에 그들의 생존에 대 한 영향을 저장 합니다. 글리세롤 (마지막 20%)을 사용 하 여 또는 상용 솔루션 및 장기 보존을 선호 하 고 미래 접종 촉진-80 ° c.에 저장 microbeads cryotube 파운드 매체를 포함 하는 cryotube에 식민지를 추가
- 600에서 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 체 외에서 돌연변이 성장 평가 nm 매 2 일.
- 1 성장 50 mL 튜브에 영향 을된 각 돌연변이의 식민지 가득한 7 H 20 mL 9 매체와 0.2% 글리세롤 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보충. 허용 지 수 단계에 도달 하는 박테리아 (0.6 < OD < 0.8) 활동 시작을 0.01 OD를 조정 하기 전에.
- 생체 외에 성장 결함 결핍 돌연변이 세포의 집합에서 WT 스트레인과 비교할 때 돌연변이 제외 합니다.
- 세포-M. abscessus 테네시 돌연변이 내 아메바 인생에 대 한 결함의 공동 문화
참고:이 1 개월 걸립니다.- 풍부한 매체, DMEM 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)의 보충의 1 mL에 24-잘 접시의 당 5 x 104 J774.2 murine 세포 확산. 대 식 세포 접착 있도록 37 ° C, 5% CO2 에서 24 h에 대 한 번호판을 품 어. 3 복제를 제공 합니다.
- 감염을 수행 합니다. 10, 100 µ L의 볼륨의 10% fcs DMEM에 희석의 나와 테네시 돌연변이 예방
- 감염의 3 h 후 DMEM (진공 펌프를 사용할 수 있습니다.)의 1 mL와 함께 3 개의 빨 래를 수행 합니다. 다음 1 h 나머지 extracellular mycobacteria 제거를 위해 (10% fcs DMEM)에 250 µ g/mL amikacin와 대우.
- 3 추가 DMEM 1 mL로 세척, 후 extracellular mycobacterial 곱셈을 방지 하기 위해 1 mL의 최종 볼륨을 (10% fcs DMEM)에 250 µ g/mL amikacin에 문화를 유지 합니다.
- 공동 문화, 후 72 h 매체를 제거 하 고 냉 수의 1 mL을 추가 하 여 대 식 세포를 lyse. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 세포내 박테리아의 수를 평가 하는 COS 접시에 CFU 분석을 수행 합니다.
- 24-잘 접시에 두 개의 첫 번째 행에 물 1 mL를 추가 합니다. 첫 번째 우물을 공동 세포 lysate의 100 µ L를 추가 합니다. micropipette와 세 번 혼합 합니다. 100 µ L를 발음 하 고 두 번째에 그들을 잘 입금.
- 새로운 팁 잘 12까지 세 번째, 등 두 번째 우물에서 희석을 반복 합니다. 그리고 10-12 희석의 30 µ L 발음 COS 접시에 그것을 추가 합니다.
- 다른 희석에 대 한 반복 합니다. Parafilm으로 COS 플레이트를 포장 하 고 관찰 하 고 식민지를 카운트 3-4 일을 기다립니다.
- 식별 및 M. abscessus 돌연변이에 테네시 의 삽입의 사이트의 시퀀싱
참고:이 60 돌연변이 대 한 1.5 개월 걸립니다.- 식별의 게놈 추출 M. abscessus 돌연변이
- 7 H 9의 20 mL 50 mL 튜브에 돌연변이 성장 매체 보충 0.2% 글리세롤, 1% 포도 당과 대 지 수 단계 250 mg/mL (OD600= 0.8).
- 문화 (2,396 x g, 5 분) 10 mL를 수확. 폐기는 상쾌한. 솔루션의 500 µ L에서 박테리아를 일시 중단 (25% 자당, 50 mM Tris pH 8, 10mg/mL lysozyme, 40mm thiourea). 나사 모자 2 mL 튜브에 솔루션을 전송 및 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- 솔루션 II (25% 자당, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA)의 500 µ L를 추가 합니다. Pipetting 후 고 아래 5-10 배, 튜브에 500 µ L의 볼륨까지 지르코늄 구슬 추가.
- 세포 세포의 용 해는 균질 화기로 진행 (3 x 6000 rpm, 45 s) 각 라운드 사이 얼음에 1 분 부 화와.
- 5 µ L 20 mg/mL 가수분해 K의 (최종 100 µ g/mL)을 추가 하 고 55 ° c.에 하룻밤 샘플을 품 어
- 증기 두건에서 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1)의 추위의 1 mL를 추가 합니다. RT 및 16500 x g 30 분 동안 원심 분리를 진행 하기 전에 vortexing에 의해 샘플을 믹스.
- 원심, 후 수성 단계를 복구 하 고 후드 아래 찬 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 솔루션의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 16500 x g 30 분 수성 단계 다시 복구에서 샘플 원심
- 증기 두건에서 복구 된 수성 단계로 RT 소 프로 파 놀의 0.7 볼륨을 추가 합니다. DNA 강수량 및 실시간 5 분을 품 어 튜브를 천천히 반전 다음 16500 x g 및 실시간에서 10 분 원심 분리기
- 상쾌한을 제거 하 고 후드 아래 70% 에탄올 500 µ L와 펠 릿을 세척. 에탄올을 제거 하기 전에 RT에 16500 x g 에서 10 분 동안 튜브를 원심. 나머지 알코올 증발 수 있도록 10 분 동안 품 어.
- 마지막으로, DNase/RNase 무료 물 100 µ L에서 DNA 펠 릿을 일시 중단 합니다. 분 광 광도 계와 DNA 수율 및 순도 DNA를 확인 합니다.
- 하위 Tn 삽입 사이트 복제 1 박 10 U ClaI 의 genomic DNA와 다이제스트의 1 µ g를 제거 합니다. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.
참고: Cla나 효소 M. abscessus 게놈 (2,173 제한 사이트)에서 가장 높은 대표 제한 효소 중 하나입니다. Cla나 제한 사이트 또한 테네시 돌연변이의 대 저항 카세트의 테네시 시퀀스 상류에서 발견 된다. 따라서, Cla나 중재 subcloning Tn 삽입 사이트를 식별할 수 있습니다.
- 하위 테네시를 포함 하는 게놈 DNA의 플라스 미드에 클로닝
참고: 이전 테네시와 진행- Cla추가 2,686 bp pUC19 암 피 실린 내성 플라스 미드, subcloning 나 플라스 미드의 다중 복제 사이트에 제한 사이트. 이 링크 https://www.addgene.org/50005/sequences/에 pUC19 플라스 미드의 시퀀스를 찾을 수 있습니다.- 따라 제조 업체의 프로토콜 소화 EcoR와 pUC19 플라스 미드 나와 뒷 다리III, 51의 조각 출시 혈압과 2635 bp.의 조각 정화는 51를 제거 하는 상업 PCR 정화 키트와 함께 이중 소화 벡터 혈압 단편을 발표 했다.
- 믹스 1 µ L (농도 25 pmol / µ L) 28의 두 개의 상호 보완적인 oligonucleotides (5 'AGCT 타 타 AGATCT 타 타 ATCGAT TATA3' 및 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT 문신 A3')의 혈압 각 Cla를 포함 하 나 제한 사이트와 끝 뒷 다리III에와 EcoR 난 제한 사이트. 10 분 동안 100 ° C에가 열 하 고 그들을 바인딩하기 냉각 하십시오.
- EcoR에 의해 쌍된 뇌관 소화 나 고 뒷 다리제조 업체의 프로토콜에 따라 III.
- 150 선 EcoR의 ng 나 /뒷 다리III 제한 pUC19 플라스 미드 20 µ L. 마지막 볼륨에서 1 U의 T4 DNA 리가와 RT에 1 h 짝된 뇌관 (50 pmol / µ L, 25 pmol / µ L, 2.5 pmol / µ L)의 다른 농도와 다른에 의해 복제 확인 효소 소화입니다.
- Cla와 수정 된 플라스 미드를 소화 2 h 37 ° c.에 대 한 나
- 50 선 Cla나 제한 된 pUC19의 ng플라스 미드 및 50 ng genomic DNA의 Cla에 의해 소화10 µ L에 1 U의 T4 DNA 리가와 RT에 1 시간을 위한 나.
- 결 찰 (2500 V, 200 ω, 25 µ F)의 5-10 µ L로 대장균 electrocompetent 박테리아 변환으로 이동 합니다. 50 µ g/mL 대와 테네시 시퀀스의 부분을 가진 플라스 미드 베어링 박테리아 선택 하 50 µ g/mL 암 피 실린 보충 파운드 한 천 배지에서 클론을 선택 합니다.
- 하룻밤 파운드 액체 매체와 적절 한 항생제 선택 (50 µ g/mL 대 및 50 µ g/mL 암 피 실린) 저항 클론 성장 합니다.
- 플라스 미드 DNA를 추출 합니다. 제한 효소에 의해 삽입의 존재를 확인 하 고 시퀀스 테네시 대의 마지막 17의 기본적인 쌍에 해당 하는 oligonucleotide (5' 3' TTGACGAGTTCTTCTGA) 방해 유전자를 식별 하는 테네시 의 3' 끝 저항 카세트입니다.
- 뉴클레오티드 폭발 (폭발-N)를 수행 하 여 M. abscessus 가 06 스트레인에 대 한 시퀀스를 맞춥니다.
- 식별의 게놈 추출 M. abscessus 돌연변이
2. Rnaseq 분석에 대 한 세포내 Mycobacteria의 RNA 추출
참고:이 4 개월 실험에 대 한 RNAseq 분석에 대 한 4 개월 걸립니다.
-
Amoebae-M. abscessus 일괄 처리로 공동 문화
참고: 다음 실험에 공동 문화 셀 연락처에 박테리아를 선호 하는 동요와 함께 50 mL 튜브에서 수행 됩니다.- 7 H 9에에서 M. abscessus 성장 매체 0.2% 글리세롤, 120 rpm 중반 지 수 단계에 1% 포도 당으로 보충.
- AC 버퍼의 10 mL로 두 번 박테리아를 씻으십시오.
- OD600nm 를 측정 하 여 박테리아 농도 추정 (1 OD600= 4 × 108 mycobacteria). 8.5 108 mycobacteria x 8.5 x 106 amoebae AC 매체의 10 ml에서를 추가 합니다.
- 부드러운 동요 (약 80 rpm)와 30 ° C에서 1 시간에 품 어.
- 253 x g 12 분 제거는 상쾌한에 centrifuging 여 세포를 수확 하 고 AC 버퍼의 10 mL에 셀 중단. 이 세척 두 번 더 반복 합니다.
- 포함 하는 extracellular 박테리아를 제거 하 고 부드러운 동요 (80 rpm)와 30 ° C에서 4 h에 대 한 품 어 50 µ g/mL amikacin AC 버퍼의 10 mL에 셀 resuspend 셀을 두 번 다시 세척.
-
세포내 M. abscessus 에서 총 RNA의 추출
참고: 독성 시 약의 사용으로 인해 연기 후드 아래 단계 2.2.1–2.2.3을 수행 합니다.- 마지막 빨 래 후 차가운 솔루션 III (표 3)의 4 mL에 감염된 amoebae β-mercaptoethanol amoebae 방해의 임기 280 µ L 함께 resuspend. 이것은 guanidinium 안산 (GTC) 단계 이다. 2,396 x g 30 분 및 4 ° C에 대 한 lysate 출시 세포내 박테리아를 펠 렛을 10 분 분리기는 셀에 대 한 얼음에 서 스 펜 션을 유지 합니다.
- 상쾌한을 제거 하 고 차가운 솔루션 III의 1 mL에 세균성 펠 릿을 일시 중단. 2396 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 박테리아 수확 추출 버퍼 및 지르코늄 구슬 (500 µ L 튜브의 그라데이션)까지 포함 된 2 mL 나사 튜브로 전송의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 적어도 24 h-80 ° c.에 대 한 튜브를 저장
참고: 스토리지 세포 시 약에서 RNases 및 셀 해산의 비활성화를 허용합니다. - 때 사용 하기 위해 준비 얼음 샘플을 녹여 고 25 6000 rpm에서 2 라운드를 수행 하 여 한 균질 화기와 그들을 lyse s, 20 6000 rpm에서 한 라운드 뒤 각 라운드 사이 얼음에 1 분 외피와 s.
- 샘플을, 10 분 동안 얼음에 그들을 품 어. 클로 프롬 isoamyl 알콜에 희석의 200 µ L를 추가 합니다. Vortexing 후 1 분 샘플 16500 x g 와 4 ° C에서 15 분 동안 원심
- 수성 단계에 찬 소 프로 파 놀의 0.8 mL을 추가 하 고 2-3 h 20 ° c.에 대 한 샘플을 품 어 35 분 16500 x g 와 4 ° c.에 대 한 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.
- 차가운 70% 에탄올 500 µ L을 추가 하 여 RNA 펠 릿을 세척 (혼합 하지 마십시오).
- 에탄올을 제거 하려면 10 분 16500 x g 에서 샘플 원심 솔루션을 발음과 원심 집중 장치에 건조 합니다.
- 일단 건조, DNase/RNase 무료 물 100 µ L에 산 탄을 resuspend.
참고: 샘플 DNases 제조업체의 권장 사항에 따라 DNA 오염 물질 제거와 두 번 처리 되어야 합니다. - Agarose 젤에 RNA 무결성을 평가 하 고 칩 기반 모 세관 전기 이동 법 방법으로 RNA 무결성 번호 (린)와 ribosomal 비율을 측정 하 여 확인 합니다.
참고:에 린 계정에 전체 전기 이동 추적을 걸립니다. 린 소프트웨어 알고리즘 총 RNA의 분류에 대 한 허용 가장 저하 프로필과 가장 그대로 되 고 10 되 고 1 10 1부터 번호 매기기 시스템을 기반으로 합니다. CDNA 라이브러리 준비를 진행 하는 신장은 이상적인 값 2, 유기 체 및 그것의 특이성에 따라 8 및 가능한 높은 ribosomal 비율 [28S/18] 이어야 합니다. - CDNA 라이브러리의 시퀀싱에 대 한 준비까지-80 ° C에서 RNA 샘플을 저장 합니다.
-
CDNA 라이브러리의 준비
- 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 상용 cDNA 합성 키트 (자료 테이블)를 사용 하 여 라이브러리 준비를 진행.
- 집중력과 DNA 칩에 품질에 대 한 라이브러리를 확인 하십시오.
참고: 더 정확 하 고 정확한 정량화 민감한 형광 기반 정량 분석 실험을 수행할 수 있습니다.
-
라이브러리 시퀀싱
- 2 샘플 정상화 nM 흐름 세포 조직에 따라 다중화에 진행.
- 샘플 1의 농도에서 변성 nM 실시간 5 분에 대 한 0.1 N NaOH를 사용 하 여
- 10 시 샘플을 희석. 10 시 흐름 셀에 각 샘플을 로드 합니다.
- 높은 처리량 시퀀싱 시스템입니다 대규모 게놈을 시퀀싱을 진행. 여기 실행 SRM 실행 했다 (SR: 단일 읽기, PE: 짝-엔드 읽기, m: 다중화 샘플) 읽기 7 인덱스 기지와 51 주기의.
- 외부 FastQC 프로그램13시퀀싱의 품질을 평가 합니다.
- 어댑터 시퀀스 트리밍 후 읽기 정렬 참조 게놈에 대 한 진행. 진 핵 세포 게놈을 샘플 오염 평가 하 고, 필요한 경우, 진행 비 세균성 읽기 트리밍에 대 한 정렬.
-
통계 분석
- 사용 하 여 여러 가지 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 온라인 차동 표현한 유전자의 세트 정의: R 소프트웨어, DESeq2 등 PF2tools 패키지 (버전 1.2.12) 플랫폼에서 개발 된 Bioconductor 패키지 "Transcriptome 외 Epigénome" (파스퇴르 연구소, 파리)입니다.
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Representative Results
M. abscessus 저항 하 고 대 식 세포와 같은 amoebae 환경 원생 동물의 살 균 응답을 탈출 하는 기능이 있다. M. abscessus 는 악성에 게 쥐4독성 요인을 amoebae, 접촉 성장 될 때 표현 한다. 이러한 방법의 첫 번째 목적은 M. abscessus 그것의 생존 및 곱셈 amoebae 내에 존재 하는 유전자를 확인 했다.
이 위해, M. abscessus subsp. massiliense, 테네시 배달9, 여의 돌연변이 라이브러리 amoebae이 감쇠 성장 돌연변이 식별 하기 위해 앞 공동 문화에 따라 상영 세포내 환경 (그림 1)입니다. 같은 돌연변이의 동작 또한이 성장 감쇠 마우스 대 식 세포에서 보존 되었다 여부를 분석 하는 세포와 공동 문화를 다음 평가 했다.
이 장 님 transposon 라이브러리 접근, 심사 확인 결함이 복제 형 50%의 생존 했다 6000 돌연변이의 47 amoebae 또는 대 식 세포에 비해 적은10제어 또는. 배제 감쇠 세포내 생존 곡선 선택한 모든 Tn 돌연변이의 성장 진 균의 본질적인 성장 결함으로 인해 수 있는 돌연변이 생체 외에서 액체 농축 배양 (1%에서에서 평가 했다 포도 당-7 H 9)입니다. 모든 돌연변이 체의 생체 외에 성장 문화의 세600 매 2 일에 따라 모니터링 했다. 생체 외에 성장 결함 비해 해당 야생-타입 스트레인에 표시 되는 다른 돌연변이 연구에서 제외 되었다.
이 블라인드 테스트를 매일 정확 하 게 동일한 프로토콜을 사용 하 여 복제에 대 한 극히 중요 했다. 이 기술은의 한계 첫 번째 비주얼 심사에서 사진 찍은 각 CFU의 참조에 대 한 정확한 이미지를 제공. 돌연변이의이 그룹에서 12 M. abscessus 돌연변이 (중복 포함된)는 transposon 유형 VII 분 비 시스템은 세포내의 중요성을 밑줄의 ESX 4 로커 스에 속하는 유전자에 삽입 된 확인 되었다 M. abscessus10의 성장.
지금까지, M. abscessus 독성의 분석은 본질적으로에 근거 M. chelonae, 동일한 그룹에 속하는 하지만 감염을 일으키는 진 균의 M. abscessus 의 게놈의 비교 분석 인 간에 있는 피부. 목표는 더 나은 이해는 적응 및 잠재적으로 독성 메커니즘 공동 문화 환경 전문가 존재 하는 동안 관련 된 다른 공동 문화 상태 표현 하는 유전자의 카탈로그를 식 세포입니다. M. abscessus의 총 시퀀싱 메신저 RNAs의 포괄적인 접근 방식을 통해이 증가 독성의 분석 탐지는 RNAs 유도 또는 아메바 공동 문화에서 복사할 RNAs에 비해 동안 억압 하기 위해 수행 되었다 생체 외에서 조건입니다. 이러한 RNAs의 차동 식 수 "인 간에 있는 위쪽 기도의 식민지를 설명 하는 향상 된"독성 M. abscessus 에 수 여 됩니다.
이러한 공동 문화 다시 실시 했다 최소 매체 (탄소 또는 질소 소스)에 M. abscessus 의 extracellular 성장을 방지 환경 조건 이들에 의해 직면의 대표 하 고, 위에서 설명한 대로 mycobacteria 및 공동 문화 세포내 mycobacteria 선택 기간 내내 항생제의 선택의 압력을 받고.
따라서, 세포내 mycobacteria에서 RNA를 분리 하는 기술 개발 되었다. Mycobacterial RNA의이 추출이 가진 주요 어려움은 amoebal RNA (진핵생물 타입)와 오염 피하는. 이 방지 하려면 아메바의 세포에서 서로 다른 시간 게시물 공동 문화, guanidinium 안산 (GTC);를 사용 하 여 수행한 때문에 세포내 mycobacteria은 저항 한다. 이 단계 후 mycobacterial RNAs의 기계적 추출 지르코늄 구슬 존재 셀 균질 화기를 사용 하 여 실행 되었다. 이 기술은 높은 품질, M. abscessus transcriptome의 완전 한 분석을 수행 하는 능력을 향상 시키기 위해 필수적인 린 번호와 좋은 품질의 mycobacterial RNA 메신저 RNA 시퀀싱 (mRNA)를 사용 하 여 얻을 수 있었습니다. 기술 (그림 2)입니다. 이 전에 해 본 적이 있다 고 우리에 게 유도 하거나 그들의 역할에 따라 그룹화 하 여 억압 유전자 가족의 기본 비전을 했다: M. abscessus 영양분과 미네랄, 산소는의 원본에 제한 하는 환경에 대 한 응답 또는 산 성 환경 그리고 M. abscessus 의 산화 저항 nitrosative 스트레스와 마지막으로 환경 아메바에 M. abscessus 독성의 표현.
그림 1 : M. abscessus 아메바에 테네시 돌연변이의 A. 첫 번째 시각적 화면. Amoebae에 테네시 돌연변이의 (A) 대형 화면 감쇠 돌연변이 신속 하 게 식별 하는 감염의 무작위 다양성 96 잘 접시에서 수행 됩니다. (B) 식별 감쇠 테네시 돌연변이의 유전자를 방해합니다. 테네시 돌연변이 게놈 DNA Cla와 조각화 Tn 삽입 사이트 복제 나. M. abscessus 게놈 항구 2500 Cla나 제한 사이트는 호의 짧은 DNA를 얻는 조각 하지만 Tn 삽입 사이트 (1/2500) 복제 확률을 낮 췄 다. 클론 대, 저항 베어는 transposon에 의해 함께 선택 됩니다. 방해 유전자 시퀀싱 테네시 대 저항 카세트 (검은색 화살표) 안에 뇌관에 의해 식별 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Mycobacterial RNA 적 출의 분석. (A) RNA 추출의 세포내 M. abscessus amoebae-M. abscessus 공동 문화 중. M. abscessus amoebae 공동 문화는 박테리아 연락처 셀에 부드러운 동요와 큰 볼륨 (즉, 100), 감염의 높은 다양성에서 수행 됩니다. 공동 문화, 후 셀 수확 되며 GTC와 ß-mercaptoethanol의 조합으로 lysed. 다시 이전 RNA 추출 박테리아 정비사 세포의 용 해를 촉진 하기 위하여 박테리아 세포 벽을 약하게 하는 GTC 세포 lysate 포함 된 박테리아 처리 됩니다. (B) RNA 품질 및 무결성 평가 bioanalyzer와 함께. 전기 이동 법 젤에 rRNA는 관찰 (23S, 16S 5S) 주어진 다. 린은 시퀀싱 및 rRNA 비율 (23S/16) 유기 체, 2는 이상적인 값에 따라 가능한 높은 도서관 준비를 진행 하는 8 이상 이어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
M. abscessus 동작은 RGM2에 속하는 다른 mycobacteria 보다 M. 결핵 등 병원 성 SGM의 행동에 훨씬 더 비슷합니다. SGM의 pathogenicity에 핵심 요소 생존 또는 심지어 대 식 세포와 같은 항 원 제시 세포와 수지상 세포 내에서 증식 하는 능력입니다.
M. abscessus 진 핵 phagocytic 세포 내에서 살아남기 위해 그것의 게놈14 의 전체 순서에 의해 표시 된 대로 특정 게놈 장점을 인수 했다. M. abscessus 의 게놈 빠르게 진화 하 고 될 표시 되었습니다 그리고 많은 최근 매우 플라스틱 prophages 등 새로운 유전자15삽입 시퀀스를 소개 했다. M. abscessus M. 결핵에 비해 독성에 더 적은 데이터 요인 이지만, M. abscessus 증가 독성으로 신속 하 고 적극적으로 진화 할 수 있을 것으로 보인다. 지금까지, M. abscessus 독성의 분석은 기본적으로 기반으로 M. chelonae, 동일한 그룹에 속하는 하지만 감염을 일으키는 진 균의 M. abscessus 의 게놈의 비교 분석에 인 간에 있는 피부. 일부 유전자 M. chelonae 에 존재 하지만 phospholipase C, 같은 M. abscessus, 현재는 부분적으로 설명 되지 먹어서 후 M. abscessus 의 저항 환경 amoebae4.
환경 샘플으로 보완 하는 아메바 공동 문화 기술 개발은 명확 하 게 아메바 mycobacterial 상호 작용16,17시연 하고있다. 따라서, mycobacteria lysates의 존재는 물 처리 공장18, amoebae 공동 경작 으로부터 분리 될 수 및 M. massiliense 는 환자의 래에서 격리 후 amoebae, 공동 문화 문화 혼자 하지 않은 반면 이 mycobacteria8의 격리를 허용 합니다. Amoebae는 mycobacteria4 및 Acanthamoebasp인큐베이터로 점점 간주 됩니다. 많은 비 결핵 mycobacteria 위한 자연 환경 호스트 시스템은 점점 제안 되 고 간단 하 고 빠른 모델 특성으로 요소 mycobacteria19,20,21, 세포 성장에 관여 하는 아메바 플러스 mycobacteria 공동 문화 22,,2324.
환경에서 mycobacteria amoebae의 상호작용은 제대로 문서화 되어있다. Mycobacteria amoebae 필드에서 사이 연결의 증거를 설명 하는 첫 번째 기사는 2014 년에 나온 고 식 수 네트워크25의 분석에 초점을 맞춘이 연구.
우리의 지식을 하려면이 amoebae 공동 문화 동안 설명 하는 첫 번째 심사입니다. 이 연구는 인간을 영향을 미치는 기회 주의 병원 체의 독성의 인수에 환경 식 세포의 역할을 설명 하기 위해 있었습니다. M. abscessus의 세포내 생존에 필요한 그 유전자를 강조 하기 위해 전위에 의해 돌연변이 라이브러리의 스크린이 M. abscessus 복잡 한의 종 및 임상 변형 실시 됐다. 이 돌연변이 라이브러리 amoebae,이 마지막 것 입증 되었습니다 "훈련 장소로" 쥐4 M. abscessus 의 독성을 증가 함께 상영, M. avium26과 비슷한 관찰. 주요 결과 mycobacteria의 인코딩 유형 VII 분 비 시스템, 및 독성 및 M. 결핵의 세포내 생존을 위한 필수적인 것으로 간주 하는 ESX-1 로커 스의 조상 ESX 4 로커 스의 필수적인 역할에서 처음으로 발견 했다 진 균 microti M. marinum27,,2829,30,31.
두 번째 목표는 더 나은 적응 및 공동 문화 환경에 존재 하는 동안 관련 된 잠재적인 독성 메커니즘을 이해 하기 위해서는 다른 공동 문화 상태 표현 하는 유전자의 카탈로그를 전문 식 세포입니다. M. abscessus의 메신저 RNAs의 총 시퀀싱의 포괄적인 접근 방식을 통해이 증가 독성의 분석 탐지는 RNAs 유도 또는 아메바 공동 문화에서 복사할 RNAs에 비해 동안 억압 하기 위해 수행 되었다 생체 외에서 조건입니다. 이러한 RNAs의 차동 식 수 "인 간에 있는 위쪽 기도의 식민지를 설명 하는 향상 된"독성 M. abscessus 에 수 여 됩니다. RGM 종 가운데 M. abscessus M. chelonae함께 비 병원 성 표현 형에 대 한 예외입니다. 결핵 mycobacteria에 유사한 pathologies을 M. abscessus 에의 능력은 더욱 독특한 있습니다. 많은 연구 보고가 M. 결핵 세포32,33 내부 생활에의 세포내 적응 하지만 아무도 M. abscessus 적응에서 비보에에 집중 했다. Hypoxia M. abscessus 의 transcriptional 응답이 되었습니다 설명된34 , mycobactins 및 dosR regulon M. 결핵에 설명 된 대로 역할을 강조. M. abscessus transcriptome amoebae 및 대 식 세포의 분석 세포내 생활 당에 세균 적응에 대 한 통찰력을 제공합니다. 그 transcriptomes의 비교 M. abscessus 독성 인간 그리고 포유류 phagocytic 세포에 특정 적응의 해독을 트리거링에 amoebae의 역할의 평가 허용 합니다. 가정이 되었다 진화 적응 측면에서 M. abscessus 독성을 기술 하기 위하여 인간 세포를 이동이이 접근을 렌더링 하기 전에 amoebal 환경 M. abscessus 에 대 한 '훈련장'을 구성 수는 원래 .
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Acknowledgments
우리는 크게 돌연변이의 귀중 한 선물에 대 한 홍보 E.J. 루빈 (하버드의과 대학, 보스톤, 미국)를 인정 도서관과 원고의 교정에 대 한 닥터 벤 마샬 (의 학부, 사우스 햄튼 대학, 영국). 우리가 크게 그들의 재정 지원 (RF20150501377)에 대 한 낭 성 섬유 증 "Vaincre 라 Mucoviscidose" 및 "L'Association 그레고리 Lemarchal" 프랑스 환자 협회를 인정합니다. 우리 또한 감사 국립 기관 연구 (ANR 프로그램 DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), 그리고 지구의 Ile-de-France (도메인 d'Intérêt Majeur 외관 Infectieuses 동부 표준시 Emergentes) V.L m 박사 후 친목을 자금. L. L.는에서 박사 동료는 "Ministère de L'Enseignement Supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
References
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
