Summary
Здесь мы представляем протокол, чтобы точная количественная оценка митохондриальной ДНК (мтДНК) метилирование. В этом протоколе мы описываем ферментативного пищеварения ДНК с BamHI в сочетании с bioinformatic анализа трубопровода, который может использоваться для избежания переоценки мтДНК метилирования уровней, вызванные вторичную структуру мтДНК.
Abstract
Количественная оценка метилирование ДНК можно добиться, используя бисульфита последовательности, которая использует свойство бисульфит натрия для преобразования unmethylated цитозина в урацил, в контексте одноцепочечной ДНК. Гидросульфит последовательности могут быть направлены (с помощью ПЦР) или на весь геном и обеспечивает абсолютное количественная оценка метилирование цитозина в одной базой резолюцию. Учитывая особый характер ядерной - и митохондриальной ДНК, особенно в вторичной структуре, следует адаптации методов секвенирования бисульфита для расследования метилирование цитозина в митохондриальной ДНК. Вторичной и третичной структуры митохондриальной ДНК может действительно привести к бисульфита, секвенирование артефакты, ведущих к ложных срабатываний из-за неполной денатурации плохой доступ бисульфита одноцепочечной ДНК. Здесь мы описываем протокол, с помощью ферментативного пищеварения ДНК с BamHI в сочетании с конвейера bioinformatic анализ позволяет точную количественную оценку цитозина уровень метилирования в митохондриальной ДНК. Кроме того мы предоставляем руководства для проектирования бисульфита последовательности Праймеры для митохондриальной ДНК, во избежание ориентации нежелательных ядерной митохондриальной сегментов (NUMTs) вставляется в ядерный геном.
Introduction
Митохондриального генома — это циркулярный, двунитевая структура приблизительно 16,5 кило base (КБ) долго, составляющих из тяжелых и легких strand. Митохондриального генома присутствует в нескольких копий внутри каждой клетки, матерински унаследовал и кодирует важные компоненты дыхательной цепи комплексы1. Аналогичные, бактериальных геномов и в отличие от ядерного генома, митохондриального генома организована в многочисленных вторичной и третичной структуры, такие как спиральный и supercoiled структур2, который может затруднить доступ во время виртуализации 3эксперименты.
В ядре метилирование ДНК является широко изучены эпигеномные Марк, который играет роль в многочисленных процессах, особенно в регуляции экспрессии генов. В млекопитающих геномов метилирование ДНК происходит главным образом на положении 5 пиримидина кольцо deoxycytidines, главным образом на CG dinucleotides (или CpG). Метилирование цитозина находится на 70% всех ВПУ в геном соматических клеток и составляет ~ 1% от общего числа ДНК баз4. Methylations ДНК также был описан в не CpG контекстах, например, КПД, КПП и КПК и существуют в различных количествах в ядерной ДНК, значениями до 25% всех метилированные cytosines в эмбриональных стволовых клеток5,6,7.
Хотя широко признается, метилирование цитозина ядерного генома, существование митохондриальной ДНК (мтДНК) метилирование остается спорным. Первое исследование следственный мтДНК метилирования была исполнена в культивируемых клеток, где легко обнаружен мтДНК метилирования, хотя на более низких уровнях, по сравнению с ядерной ДНК8. В клетках человека и мышиных метилирование митохондриальной ДНК был также обнаружен при низких уровнях (2-5%). С помощью анализов, полагаясь на 5 обнаружен захвата таких метилированной ДНК иммунопреципитации (МЕДИП) следуют количественного PCR, метилирование митохондриальной ДНК был также обнаружен в различных человека и мыши и клеток линии9,10, 11,12. Использование антител против 5-метилцитозин анализа ELISA или масс-спектрометрии, значительный уровень метилирования дна были обнаружены из очищенного митохондриальной фракций13,14,15, 16. Однако большинство анализов в рамках вышеупомянутых исследований используются методы, которые не были предназначены для обеспечения абсолютной количественная оценка метилирование ДНК в одной базой резолюцию.
Анализ метилирования ДНК количественные и резолютивной может быть достигнуто путем метод под названием «Гидросульфит виртуализации», которая использует свойство бисульфит натрия для преобразования unmethylated цитозина в урацила в одноцепочечной ДНК контекст17 . С помощью последовательности бисульфита, созвездие исследований было обнаружено присутствие метилирование цитозина на различных уровнях. Метилирование мтДНК в регионе D-петля, 12С или регионе 16S легко был обнаружен в человека18,19,20,21,,2223 и мыши24 тканей и клеток, однако, с интригующим изменчивости, 1-20% от общего cytosines различных исследований.
По сравнению с эти многочисленные исследования только несколько исследований, в том числе из нашей группы, оспаривает наличие мтДНК метилирования3,25,,2627 или сомнение биологической значимости очень низкий уровень мтДНК уровней (ниже 2%)28. Недавно мы сообщили наблюдения потенциальным бисульфит последовательности артефакт в целом митохондриальной бисульфита последовательность3. Мы предоставили доказательства того, что вторичная структура митохондриальной ДНК может привести к ложных срабатываний в бисульфит последовательности, тем самым переоценивать уровень метилирования. Здесь мы предоставляем протокол для предотвращения артефакт бисульфит-преобразования митохондриальной ДНК. Этот протокол использует простой ферментативного пищеварения ДНК нарушить мтДНК вторичных структур и разрешить полный доступ к бисульфита после бисульфита последовательность протокола. Кроме того мы предоставляем сопутствующие bioinformatic трубопровода для анализа бисульфита последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. энзима ограничения лечение
- Линеаризации митохондриальной ДНК, рассматривая всего ДНК человека с энзима ограничения BamHI, что сокращения в позиции 14258 митохондриальной ДНК человека.
Примечание: Для мыши ДНК, используйте ограничения фермента BglII в одинаковых условиях, как показано ниже. - Для каждого образца, где мтДНК метилирования должен оцениваться, готовить один 0.2 мл реакции и добавить следующую смесь: 3 мкг геномной ДНК (количественно флюометрия), 15 мкл буфера 3, 3 мкл BamHI и воды до 150 мкл
- Место труб в тепловой cycler для 4 ч при 37 ° C.
2. бисульфита преобразования
- Преобразование BamHI обработал дна с помощью бисульфит натрия, как описано в других разделах29.
- Для каждой конверсии реакции в общем объеме 20 мкл используйте 200-500 нг BamHI обработал дна. Восстановление ДНК является 50-70%.
- Элюировать ДНК бисульфит преобразованы в 10 мкл Элюирующий буфер.
- Количественно одноцепочечной ДНК в флюометрия.
- Дополнительно: Хранить бисульфит преобразованы ДНК при-20 ° C прежде чем остальная часть протокола. Для длительного хранения магазин бисульфит преобразованы ДНК-80 ° c
3. дизайн бисульфита, секвенирование грунтовки
- Дизайн праймеров для секвенирования бисульфита, используя онлайн инструменты Methprimer30 и31,BiSearch32.
Примечание: Methprimer и BiSearch позволяют для поиска последовательностей праймера привязки геномных последовательностей где cytosines преобразуются в thymines, аналогично бисульфита после лечения. - Для оптимального и беспристрастной амплификации избежать dinucleotides CpG в грунты и дизайна ампликон размер между bp 100-300.
- Убедитесь, что разработанные грунтовки являются специфическими для митохондриальной ДНК, с помощью функции BiSearch в Грунт Поиск. Вставить уже разработан бисульфита преобразованы грунты, галочку, бисульфит и включают ссылку генома и параметры ПЦР.
Примечание: Будет отображаться список возможных продуктов PCR. - Скопируйте верхней последовательностей праймера 1-5 и вставьте их в форму заказа для синтеза олигонуклеотида.
Примечание: Список человека и мыши грунтовка последовательности митохондриальной ДНК, которые были проверены в лабораторной среде отображается в таблице 1. - Испытание грунтовки с помощью бисульфита преобразован ПЦР после электрофореза геля агарозы, как описано в шаге 4. Тестировать и оптимизировать все пары праймера отдельно и убедитесь, что отображается правильный ампликон размер на геле агарозы.
Примечание: Если необходимо мультиплексирования грунты, добавьте несколько грунтовки в один единый реакции PCR и визуализировать продуктов ПЦР на электрофорезе геля агарозы или, более резолютивной метод как электрофорез геля полиакриламида, чтобы отличить продукцию аналогичных размер.
4. бисульфита преобразован ПЦР и извлечения геля
- Для того чтобы усилить в регионах, представляющих интерес, выполняют с помощью горячий старт Taq-полимеразы PCR. Вкратце, смесь 100 нг преобразованы ДНК, 500 мкм и анти чувство грунты, 1 мкл dNTP смесь (10 мкм каждого dNTP) и полимеразы на 7,5 U/реакции в общем объеме 50 мкл. Запустите ПЦР с соблюдением следующих условий: 5 мин при 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 циклов; 10 мин 72 ° C. Используйте грунтовки либо отдельно или мультиплексированием. - Дополнительно: При мультиплексирования грунты, использования 200 ng преобразованы ДНК и следующих условий Велоспорт: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 циклов; 10 мин 72 ° C.
Примечание: Температура может варьироваться в зависимости от температуры плавления праймеров. - Тема продукты PCR для гель-электрофореза на агарозе 2% на 100 вольт.
- Под нежным УФ-излучения извлечь продукты PCR с помощью скальпеля и добавить в пробирки. Не подвергайте продукты PCR чрезмерного УФ света во избежание повреждения ДНК. Избегайте время экспозиции более 30 s.
- Очищайте продукты PCR, используя очищение геля, как описано выше3.
- Количественно очищенная ДНК из шага 4.5 с помощью флюометрия. Перейдите к шагу 5 или хранилище образцов при-20 ° C.
35 циклов; 10 мин 72 ° C. Используйте грунтовки либо отдельно или мультиплексированием.5. бисульфита, секвенирование библиотеки подготовка
- Выполните подготовку библиотека бисульфит преобразованы продуктов ПЦР.
Дополнительно: мультиплексной ПЦР продукты на данном этапе. - Конец-ремонт с использованием до 100 нг ПЦР продукта. Добавьте 3 мкл конец приготовительный фермента и 6,5 мкл конце ремонта реакции буфера (10 x) 55.5 продукт PCR мкл в 0,2 мл трубку. Место и инкубировать трубки в тепловой cycler для 30 мин при 20 ° C, после чего 30 мин при температуре 65 ° C.
- Перевязать последовательности адаптеров, смешивая отремонтированы конец ДНК с 15 мкл Блант/TA лигаза микс, 2,5 мкл адаптер и 1 мкл лигирование усилитель. Если с помощью < 100 нг ПЦР продукта в качестве входных данных, разбавить адаптер 10 раз.
- Поместите смесь (шаг 5.3) тепловая велосипедист и инкубировать 15 мин при 20 ° C. Приостановить тепловая велосипедист и 3 мкл пользователя фермента к трубе. Смешать и поместить трубку обратно в тепловая велосипедист и инкубировать 15 мин при температуре 37 ° C.
- Размер выберите адаптер лигируют ДНК с помощью твердой фазы реверсивные иммобилизации (ОСПР) бисер с различной соотношения бисера ДНК в зависимости от размера продукта PCR.
- Добавьте 13,5 мкл H2O адаптер лигируют ДНК из шаг 5.4 и 55 мкл высокомобильна Спри бисера. Инкубации при комнатной температуре на 5 мин и место трубки на магнитную подставку. Когда решение ясно, передать супернатант новой трубки и отбросить тубы с бисером.
Примечание: Супернатант содержит адаптер лигируют ДНК и большой нежелательные фрагменты привязываются к отбрасываются бусины. - Добавить 25 мкл высокомобильна Спри бусины в надосадке из шаге 5.6, смешать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Поместите трубку на магнитную подставку и отбросить супернатанта, когда раствор не станет прозрачным.
Примечание: Отбрасываются супернатант содержит нежелательные ДНК, в то время как адаптер лигируют ДНК привязан к бисеру. - Хотя трубки магнитного стенд, добавьте 200 мкл 80% этанола (свежеприготовленные) мыть бисер. Инкубируйте 30 s и удалить и удалить супернатант. Повторите этот шаг для в общей сложности 2 стирок.
- Воздух сухой Бусины для 5 минут пока трубку на магнитного стенд с открытой крышкой.
- Снять трубку от магнита, элюировать ДНК в 23 мкл Элюирующий буфер и перемешать. Инкубации при комнатной температуре на 2 мин.
- Поместите трубку на магнитную подставку и когда решение ясно, передача 2 мкл 96-луночных ПЦР пластины для pre ПЦР-амплификации (шаг 5.14).
- Остальные приблизительно 21 мкл передать новой 0,2 мл трубки для амплификации PCR (шаг 5.17).
Примечание: Обязательно не передавать любой бисер, бусины может подавлять ферментативные реакции следующие шаги. - Перейти к шагу 5.14 или хранилище образцов при-20 ° C.
- Выполните pre ПЦР-амплификации, RT-ПЦР для оценки числа циклов необходимо усилить лигируют адаптер ДНК. В реакции, добавьте следующее в 96-луночных ПЦР пластины содержащий 2 мкл ДНК (шаг 5.11): 0.4 мкл индекс грунт, 0.4 мкл универсальный PCR праймер, 7.2 мкл H2O, 10 мкл RT-ПЦР Мастер микс.
- Установите пластину в машину ПЦР в реальном времени и при условии пластины для следующих условий: 30 s на 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 циклов; 5 мин 65 ° C.
- Оцените количество усиления циклов, необходимых для каждой выборки путем вычитания одного Ct значение к значению Ct предварительного усиления RT-ПЦР соответствует концу Линейная фаза реакции PCR.
- Усилить лигируют адаптер ДНК из шага 5.12 путем смешивания: 21 мкл ДНК, 25 мкл ПЦР Мастер микс, 1 мкл индекс грунт, 1 мкл универсальный PCR праймер и 2 мкл H2O. В тепловая велосипедист, тема каждого образца для следующих условий: 30 s на 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [рассчитанных Ct от шага 5.16] циклов; 5 мин 65 ° C.
Примечание: Не забудьте использовать только один индекс грунт на сэмпл для мультиплексирования. Индекс вставляется во время ПЦР. - Очистить амплифицированного ДНК Спри бусины и элюировать в 22 мкл Элюирующий буфер.
- Контроль качества библиотека электрофореза или альтернативным методом гель. Посмотрите на правильную библиотеку пик размеров (размер продуктов ПЦР плюс адаптер).
- Оценить средний размер базы пара товар(ов) библиотека анализа мазка: В дополнительные глобальные параметры, дважды щелкните на «Таблица» под анализ мазка. Определите от 100-1000 bp региона и нажмите кнопку ОК. В Таблицу Regionопределенную область появляется и рассчитывается средний размер библиотеки (bp).
- Количественно библиотек по флюометрия. Перейдите к шагу 6 или хранилища библиотек при-20 ° C.
6. следующее поколение последовательности
- Рассчитайте концентрацию Нм библиотек с использованием формулы:
- Разбавить библиотек же Нм концентрации например 2 Нм (выбрать 4 Нм, 2 Нм, 1 Нм, или 0,5 Нм в зависимости от концентрации библиотека). Объединить все библиотеки для достижения пул 2 Нм библиотек.
- Денатурировать и разбавленных библиотеки после виртуализации инструмент руководства. Короче говоря: денатурировать 2 Нм бассейн путем добавления 0,2 N NaOH и инкубации при комнатной температуре на 5 мин развести денатурированного пул для окончательного растворения 10 вечера. Денатурировать и разбавленных библиотеки коммерчески доступных элементов управления для окончательного растворения 12: 5 вечера. Для новой трубки Смешайте 10 вечера бассейн с 20% 12: 5 вечера управления библиотекой.
Примечание: Преобразование бисульфита вводит очень низкой сложности. 20% управления Библиотека Спайк-приведет в лучшем качестве последовательности. - Запуск 150 bp в паре конец последовательности, с помощью инструмента глубокий последовательности.
7. Вычислительный анализ - Оценка метилирования уровни
- Создавать файлы .fastq (здесь под названием sample1_R1.fastq.gz и sample1_R2.fastq.gz), создать индекс bismark всего генома интереса (здесь в папку под названием bismarkIndex) и убедитесь, что геномные последовательности ЦПЧМ доступен в fasta формат (здесь в папку под названием ЦПЧМ).
- Предварительно обработать читает для удаления адаптеров и предвзятости, представленный грунты: используйте средство Trim_galore33. Удалите два нуклеотидов с 5' конца прямого и обратного чтения.
trim_galore--clip_R1 2 - clip_R2 2 -о. /--trim1--парных sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Выровнять предварительно обработанные читает весь геном с помощью Bismark34
Bismark - ласточкин хвост--bam -о. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
Примечание: Если используется другой каппу, убедитесь, что читает, которые не могут быть выровнены уникально отбрасываются. - Экстракт читает сопоставление хромосомы М, здесь с помощью Samtools35
SAMtools сортировка -l 0 - O -o sample1_sorted.bam БАМ
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
SAMtools индекс sample1_sorted.bam
SAMtools Просмотр -u sample1_sorted.bam ЦПЧМ | SAMtools сортировка - n - O -o sample1_chrM.bam БАМ - Извлечение информации метилирования дна
bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--всеобъемлющего--genome_folder. / ЦПЧМ./sample1_chrM.bam - Используйте .bedGraph, .cov или CX_report.txt файлы для дальнейшего анализа. Используйте файл sample1_chrM.CX_report.txt для визуализации и тестирования.
- Выполните дальнейшего отсечения на этапе предварительной обработки, если несколько регионов подвергаются допросам и грунтовка уклоном могут быть видны в M-смещения участков, созданных во время сопоставления. Обратитесь к документации Бисмарк для получения дополнительной информации.
8. Вычислительный анализ - тест различия
- Убедитесь, что файл CX_report.txt содержит 7 столбцов, хромосома (здесь ЦПЧМ), позиция, strand, метилированной гласит, количество unmethylated читает, C контекст и окружающие последовательности, для каждого C на хромосоме М.
- Как CX_report охватывает ЦПЧМ во всей его полноте, проверьте подмножество регион(ы), которая усиливается.
- Используйте непараметрические тесты для различия между образцами, например рыбаков точный тест для отдельных C или знак тест для всего региона.
Примечание: Часто количественная оценка будет близко к 0% метилирования, которая является причиной, почему при условии нормальной жизни не подходит. - Аналогичным образом для визуализации, визуализировать квантилей или расчета биномиальное доля доверительные интервалы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Два шага в настоящем Протоколе имеют решающее значение при расследовании мтДНК метилирования. 1) открытие вторичной структуры и 2) дизайн митохондриальной ДНК специфические праймеры.
Переваривание геномной ДНК человека с энзима ограничения BamHI (рис. 1), митохондриальной ДНК-структуры будут сокращены в нуклеотидной позиции 14,258 и вторичная структура будет открыт.
Возможного обесценения преобразование бисульфита с нетронутыми мтДНК вторичная структура весьма вероятно переоценить уровень unconversion мтДНК. Путем sequencing бисульфита, ставка unconversion митохондриальной ДНК было проведено расследование, в непереваренной и переваривается всего дна от клеток человеческой скелетной мускулатуры, в 5 различных регионах митохондриального генома: перемещение петли (D-Луп), tRNA фенилаланина и 12S рибосомы (тРНК - F + 12С), рибосома 16S (16S), НАДН дегидрогеназа 5 (ND5) и цитохром b (CYTB) кодирования мРНК гена (рис. 2). Unconversion ставки, варьировались от 0 - 15,1% во всех исследованных регионах для непереваренных мтДНК. Однако когда ДНК была усваивается до преобразование бисульфита, unconversion скорость упала до максимум 1% во всех регионах (рис. 3). Таким образом иллюстрирующих важность BamHI пищеварения до преобразование бисульфита избежать завышения мтДНК метилирования уровней.
Загрязнение ядерной ДНК является неизбежным, когда изоляция митохондриального генома и поскольку почти весь митохондриального генома реплицирована в ядерный геном, она породила ядерной вставки митохондриального генома называется ядерного 36митохондриальной сегментов (NUMTs). Чтобы гарантировать, что исследуемый уровень метилирования ДНК соответствуют митохондриальной ДНК и не NUMTs, она имеет крайнюю важность для разработки грунты, которые являются специфическими для митохондриального генома. На рисунке 4 показано, как проверить грунтовка специфичность и Таблица 1 показывает человека и мыши последовательности митохондриальной ДНК грунт.
| Имя | Последовательность | Позиция | Ампликон размер | Отжига температура | Стрэнд | ||
| Человека | |||||||
| D-петля | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisense | |||
| D-петля | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisense | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisense | |||
| 260 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Чувство | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091 15243 | 152 | 55° C | Чувство | |||
| Мышь | |||||||
| 220 | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisense | |||
| 260 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisense | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisense | |||
| 260 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Чувство | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659 12910 | 251 | 55° C | Чувство | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242 14504 | 262 | 55° C | Чувство | |||
Таблица 1: грунтовка последовательности для человека и мыши мтДНК. Обратите внимание, что отжига температура PCR праймеры варьироваться из-за разницы в температуры плавления праймеров.
Рисунок 1 : Электрофорез ДНК, BamHI переваривается, или непереваренных геля. Геномной ДНК человека скелетных мышц не лечить или лечить с BamHI за 4 ч при 37° C и электрофорез геля был запущен на 1,5% агарозном геле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Карта митохондриального генома человека. Регионах митохондриального генома, расследованных бисульфита последовательности и BamHI энзима ограничения сайта отображаются. Митохондриальная ДНК содержит 13 мРНК, 2 рибосомной РНК и 22 передачи РНК. Сокращения: PH1: тяжелые стренги промоутер 1; PH2: тяжелые стренги содействовать 2; PL: свет стренги промоутер; OH: Происхождение репликации от тяжелых нить; OL: происхождение репликации от света strand. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : BamHI пищеварение до преобразование бисульфита снижает уровень unconversion митохондриальной ДНК в клетках человека скелетных мышц. Путем sequencing бисульфита, непереваренных и переваривается митохондриальной ДНК unconversion процент были допрошены в пяти различных регионов митохондриального генома в клетках человека скелетных мышц (N= 3). Полная площадь представляет сайты CpG, а открытые площади не CpG сайтов. Результаты представлены с интервалом в мин Макс и знак тест был использован для тестирования для unconversion значительные различия. D-петля (6-298) P= 1.83E-42; D-петля (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12С: P= 8.38E-16; 16S: P= 5.91E-06; Nd5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-петля (6-298) включает в себя происхождение репликации и тРНК - F + 12С тяжелые стренги промоутер 2. Эти данные были опубликованы в другом месте 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Использование Bisearch для проверки грунтовка специфичность к митохондриального генома. A) бисульфит преобразованы грунтовка последовательностей добавляются к BiSearch функции Поиск грунт (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). Галочкой поле бисульфита, и выбирается ссылка генома. B) пример потенциальных продуктов ПЦР на смысл и antisense цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем бисульфит последовательность протокола, который специально предназначен для допросить мтДНК метилирования. Различия с бисульфит последовательность протоколов, используемых для геномной ДНК лежит в использования предварительного энзима ограничения шаг пищеварение и анализа bioinformatic правящей из ложных положительных вытекающих из NUMT последовательности.
Мы предоставляем протокол избежать артефактов бисульфит последовательности при расследовании мтДНК метилирования. Гидросульфит последовательности артефакты, ведущих к ложных срабатываний были сообщалось ранее37. Недостаточная удаления ДНК аксессуар белков, протеиназы K был описан37. Денатурации неполные или частичные reannealing может привести к тянется неполной конверсии, возможно путем снижения доступа бисульфита одноцепочечной ДНК37. Позднее артефакт может быть в игре в митохондриальной ДНК где вторичная структура ограничит доступ к cytosines. В меру наших знаний Добавление шага пищеварения энзима ограничения до преобразование бисульфита в контексте оценки мтДНК метилирования впервые сообщалось в 20163,28. В наших руках, предварительного пищеварение с энзима ограничения сингл резак резко снизили обнаружения необращенный cytosines3,28.
Здесь мы предоставляем bioinformatic трубопровода для анализа результатов секвенирования бисульфит и обнаружить бисульфита последовательности артефакты в контексте всей митохондриального генома Гидросульфит. Этот метод исходит от нашего наблюдения что мтДНК-показатель обратно коррелирует с последовательности глубины3,28. Это наблюдение предполагает, что среднего и даже третичной структуры мтДНК ухудшает фрагментации мтДНК в конкретных регионах во время строительства последовательности библиотек и может также ухудшить полный доступ бисульфит натрия в митохондриальной ДНК. Так как пищеварение с одной резак фермента выпускает вторичной и третичной структуры, наши результаты показывают, что мтДНК структура является источником бисульфита артефакт и проверки методов, описанных в данном документе для количественной оценки метилирование цитозина в митохондриальной ДНК.
Неизбежное загрязнение ядерной ДНК митохондриальной подготовке представляет собой проблему. Это приводит к загрязнению в NUMT последовательности в последовательности чтений, которые могут исказить оценки метилирование цитозина в митохондриальной ДНК, даже при выполнении целевых и не весь митохондриального генома Гидросульфит. Чтобы избежать таких предубеждений, Дизайн праймеров последовательности уникальных бисульфита позволяет исключить загрязнение с метилирование по NUMTs. NUMTs охватывают некоторые регионы человека и мыши митохондриального генома с 100% тождественность, и это, таким образом, невозможно разработать уникальный грунтовки в некоторых регионах мтДНК. При выполнении всей митохондриального генома бисульфита, секвенирования долго читает может облегчить дискриминации между митохондриальной ДНК и NUMTs. Выравнивание читает весь геном и использовать только читает, однозначно сопоставляются митохондриального генома может дополнительно обеспечить обнаружение мтДНК метилирования.
Наконец, этот протокол может использоваться за пределами митохондриальных геномов, например, в других случаях бисульфита последовательности, где вторичная структура ДНК представляет собой потенциальный источник артефакта. Связь между уровнями метилирования и последовательности глубины могут расследоваться оценить необходимость для пищеварения с энзима ограничения до бисульфита последовательность сложных последовательностей ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не конкурирующих финансовых интересов объявить.
Acknowledgments
Основные метаболические научно-исследовательский центр Фонда Ново Нордиск является независимый исследовательский центр в университете Копенгагена, частично финансируется неограниченного пожертвование от Фонда Ново Нордиск.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
