Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att tillåta korrekt kvantifiering av mitokondriellt DNA (mtDNA)-metylering. I detta protokoll beskriver vi en enzymatisk nedbrytning av DNA med BamHI tillsammans med en bioinformatisk analys pipeline som kan användas för att undvika överskattning av mtDNA metylering nivåer orsakas av det sekundära strukturerar av mtDNA.
Abstract
Kvantifiering av DNA metylering kan uppnås med bisulfite sekvensering, som tar fördel av egenskapen för natrium bisulfite konvertera unmethylated cytosin till uracil, i ett enkelsträngat DNA sammanhang. Bisulfite sekvensering kan vara riktade (med PCR) eller utförs på hela genomet och ger absolut kvantifiering av cytosin metylering med enda base-upplösning. Tanke distinkta kärn- och mitokondrie DNA, särskilt i det sekundära strukturerar, bör anpassningar av bisulfite sekvenseringsmetoder för att undersöka cytosin metylering i mtDNA göras. Sekundär och tertiär struktur av mtDNA kan faktiskt leda till bisulfite sekvensering artefakter som leder till falskt positiva resultat på grund av ofullständig denaturering dålig tillgång av bisulfite till enkelsträngat DNA. Här beskriver vi ett protokoll med en enzymatisk nedbrytning av DNA med BamHI tillsammans med bioinformatisk analys pipeline för att tillåta exakt kvantifiering av cytosin metylering nivåer i mtDNA. Dessutom, vi tillhandahåller riktlinjer för utformning av bisulfite sekvensering primers specifika för mtDNA, för att undvika inriktning oönskade nukleära mitokondriell segment (NUMTs) infogas i det nukleära genomet.
Introduction
Det mitokondriella genomet är en cirkulär, dubbelsträngat struktur för cirka 16,5 kilo base (kb) långa, som utgör en tung och en ljus strand. Det mitokondriella genomet finns i flera kopior i varje cell, maternellt-ärvt, och kodar väsentliga komponenter av respiratoriska kedja komplex1. Liknar bakteriella genomer och till skillnad från kärnvapen genomet, mitokondriella genomet är organiserad i många sekundära och tertiära strukturer, såsom i ihoprullat och supercoiled strukturer2, som kan återge tillgång svårt under sekvensering experiment3.
I kärnan är metylering av DNA en flitigt studerade epigenetiska mark som spelar en roll i många processer, särskilt i reglering av genuttryck. I däggdjur arvsmassan uppstår DNA-metylering främst på 5-position pyrimidin ringen av deoxycytidines, mestadels på CG dinucleotides (eller CpG). Cytosin metylering är hittade på 70% av alla CpG i genomet av somatiska celler och står för ~ 1% av totala DNA baser4. DNA methylations har också beskrivits i icke-CpG sammanhang, såsom CpA, CpT och CpC och finns i olika mängder i nuclear DNA, med värden upp till 25% av alla metylerade cytosin i embryonala stamceller5,6,7.
Medan cytosin metylering av nukleära genomet är allmänt accepterat, är förekomsten av mitokondriellt DNA (mtDNA)-metylering fortfarande kontroversiell. Den första studien utredande mtDNA metyleringen utfördes i odlade celler där upptäcktes lätt mtDNA metylering, även på lägre nivåer jämfört med nuclear DNA8. I både mänskliga och murina celler upptäcktes mtDNA metylering också på låga nivåer (2-5%). Med hjälp av analyser som förlitar sig på 5 metylcytosin capture såsom metylerade DNA immunoprecipitation (MeDIP) följt av kvantitativa PCR, mtDNA metylering upptäcktes också i olika mus och människa och celler linjerna9,10, 11,12. Med hjälp av antikroppar mot 5-metylcytosin i en ELISA-testet eller masspektrometri, upptäcktes betydande nivåer av DNA metylering från renat mitokondriell fraktioner13,14,15, 16. men de flesta av analyserna i de ovannämnda studierna använde tekniker som inte var utformad för att ge absolut kvantifiering av DNA metylering med enda base-upplösning.
Kvantitativa och hävningsklausulerna DNA metylering analys kan uppnås genom en teknik som heter ”bisulfite sekvensering”, som tar fördel av egenskapen för natrium bisulfite konvertera unmethylated cytosin till uracil i enkelsträngat DNA sammanhang17 . Använda bisulfite sekvensering, har en konstellation av studier upptäckt förekomsten av cytosin metylering på olika nivåer. Metylering mtDNA i regionen D-loop, 12S eller regionen 16S upptäcktes lätt i mänskliga18,19,20,21,22,23 och mus24 vävnader och celler, dock med ett spännande variationer, 1-20% av totala cytosin i studier.
I jämförelse med dessa många studier, har endast ett fåtal studier, bland annat från vår grupp, bestritt förekomsten av mtDNA metylering3,25,26,27 eller ifrågasatte den biologiska relevansen av mycket låga nivåer av mtDNA nivåer (under 2%)28. Nyligen rapporterade vi observationen av en potentiell bisulfite-sekvensering artefakt i hela mitokondriell bisulfite sekvensering3. Vi tillhandahållit bevis för att det sekundära strukturerar av mitokondrie-DNA kan leda till falskt positiva i bisulfite sekvensering, därigenom överskattar metylering nivåer. Vi erbjuder här ett protokoll för att förhindra en artefakt av bisulfite-konvertering av mtDNA. Detta protokoll används en enkel enzymatisk nedbrytning av DNA att störa mtDNA sekundära strukturer och tillåter fullständig åtkomst till bisulfite efter ett bisulfite sekvensering protokoll. Dessutom ger vi en medföljande bioinformatiska pipeline för analys av bisulfite sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. restriktionsenzym behandling
- Linjär mtDNA genom att behandla totala mänskliga DNA med restriktionsenzym BamHI, som skär position 14258 i den mänskliga mitokondrie-DNA.
Obs: För musen DNA, Använd enzymet begränsning BglII under identiska förhållanden som nedan. - För varje prov där mtDNA metylering är att bedömas, förbereda en 0,2 mL reaktionsröret och Lägg till följande mix: 3 μg genomisk DNA (kvantifieras av fluorometry), 15 μL buffert 3, 3 μL BamHI och vatten upp till 150 μL
- Placera rören i en termocykel för 4 h vid 37 ° C.
2. bisulfite konvertering
- Konvertera BamHI-behandlade DNA använder natrium bisulfite som beskrivs på andra ställen29.
- Använda 200-500 ng BamHI-behandlade DNA för varje konvertering reaktion i en total volym på 20 μL. DNA återhämtningen är 50-70%.
- Eluera Bisulfite-konverterade DNA i 10 μL eluering buffert.
- Kvantifiera enkelsträngat DNA genom fluorometry.
- Tillval: Lagra bisulfite-konverterade DNA vid-20 ° C innan den återstående delen av protokollet. För långsiktig lagring, lagra bisulfite-konverterade DNA vid-80 ° C
3. design av Bisulfite sekvensering grundfärger
- Design primers för bisulfite sekvensering med hjälp av online-verktyg Methprimer30 och BiSearch31,32.
Obs: Methprimer och BiSearch kan söka efter primer bindande sekvenser på genomsekvenser där cytosin konverteras till thymines, på samma sätt som efter bisulfite behandling. - För optimal och opartisk amplifiering, undvika CpG dinucleotides i primers och utforma kopiestorlek mellan 100-300 bp.
- Säkerställa att designade primers är specifika för den mitokondrie-DNA med hjälp av Bisearchs funktion Primer Sök. Infoga redan utformade bisulfite omvandlas primers, markera rutan bisulfite och inkluderar en referens genomet och PCR-parametrarna.
Obs: En lista över möjliga PCR-produkter kommer att visas. - Kopiera upp 1-5 primer sekvenser och klistra in dem i en beställningsformuläret för oligonukleotiden syntes.
Obs: En lista över mänskliga och mus mtDNA primer-sekvenser som validerats i labbet visas i tabell 1. - Test primers hjälp bisulfite omvandlas PCR efter agaros gel-elektrofores som beskrivs i steg 4. Testa och optimera alla primer par separat och säkerställa den rätta kopiestorlek visas på agarosgel.
Obs: Om multiplexering primers behövs, lägga till flera grundfärger till en enda PCR-reaktion och visualisera de PCR-produkterna på agaros gel-elektrofores eller, mer hävningsklausulerna metod såsom polyakrylamid gelelektrofores, att skilja produkter av liknande storlek.
4. bisulfite konverterade PCR och Gel utvinning
- För att förstärka regionerna av intresse, utför PCR med en varmstart Taq polymeras. Kort, mix 100 ng omvandlas DNA, 500 µM känsla och anti känsla primers, 1 µL dNTP mix (10 µM av varje dNTP) och polymeras på 7,5 U/reaktion i en total volym om 50 µL. köra PCR med följande villkor: 5 min vid 95 ° C (60 s 94 ° C, 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 cykler; 10 min 72 ° C. Använda primers antingen separat eller multiplexed. - Tillval: När multiplexing primers, Använd 200 ng konverterade DNA och cykling följande: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C, 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 cykler; 10 min 72 ° C.
Obs: Temperatur kan variera beroende på smälttemperatur av primers. - Omfattas av PCR-produkter till gel elektrofores på 2% agaros 100 volt.
- Under skonsam UV ljus, extrahera PCR-produkter med en skalpell och lägga till mikrorör. Utsätt inte PCR-produkter för överdriven UV-ljus att undvika DNA-skador. Undvika exponeringstid över 30 s.
- Rena PCR-produkterna använder gel rening enligt den tidigare3.
- Kvantifiera den renade DNA från steg 4,5 med fluorometry. Fortsätt till steg 5 eller store prover vid-20 ° C.
35 cykler; 10 min 72 ° C. Använda primers antingen separat eller multiplexed.5. bisulfite sekvensering bibliotek förberedelse
- Utföra bibliotek beredning av bisulfite-konverterade PCR-produkter.
Tillval: multiplex PCR-produkter i detta skede. - Utföra slutet-reparation med upp till 100 ng av PCR-produkten. Lägga till 3 µL slutet prep enzym och 6,5 µL slutet reparation reaktion buffert (10 x) 55,5 µL PCR-produkten i en 0,2 mL tub. Placera och Inkubera röret i en termocykel för 30 min vid 20 ° C följt av 30 min vid 65 ° C.
- Ligera sekvensering adaptrar genom att blanda slutet-repareras DNA med 15 µL Blunt/TA ligase mix, 2,5 µL adapter och 1 µL Ligation förstärkare. Om du använder < 100 ng PCR-produkten som indata, späd adapter 10 gånger.
- Placera i mixen (steg 5.3) i en termocykel och inkubera 15 min vid 20 ° C. Pausa termocykel och tillsätt 3 µl användaren enzym till röret. Blanda och placera röret tillbaka i termocykel och inkubera 15 min vid 37 ° C.
- Storlek Välj adapter-sammanskrivna DNA med hjälp av fast fas reversibel immobilisering (SPRI) pärlor med varierande förhållanden av pärlor till DNA PCR-produkt storlek.
- Lägga till 13,5 µL H2O adapter-sammanskrivna DNA från steg 5,4 och 55 µL resuspended SPRI pärlor. Odla i rumstemperatur i 5 min och plats röret på en magnetisk stå. När lösningen är klar, överför supernatanten till en ny tub och kassera tube innehåller pärlorna.
Obs: Supernatanten innehåller adapter-sammanskrivna DNA och stora oönskade fragment är bundna till de kasserade pärlorna. - Lägga till 25 µL resuspended SPRI pärlor i supernatanten från steg 5,6, blanda och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Placera röret i magnetiska montern och kasta bort supernatanten när lösningen är klar.
Obs: Kasserade supernatanten innehåller oönskade DNA, medan adapter-sammanskrivna DNA binds till pärlor. - Medan röret är på magnetiska stativet, tillsätt 200 µL 80% etanol (nyberedd) för att tvätta pärlorna. Inkubera i 30 s och ta bort och Kassera supernatanten. Upprepa detta steg för totalt 2 tvättar.
- Luften torr pärlor för 5 min när röret är på magnetisk stå med öppet lock.
- Ta bort röret från magneten, eluera DNA i 23 µL eluering buffert och blanda. Odla i rumstemperatur i 2 min.
- Placera röret på en magnetisk stå och när lösningen är klar, överför 2 µL till en PCR-plattan med 96 brunnar för den pre-PCR amplifieringen (steg 5.14).
- Över den resten cirka 21 µL till en ny 0,2 mL tub för PCR-amplifiering (steg 5.17).
Obs: Glöm inte att överföra några pärlor som pärlor kan hämma enzymatiska reaktioner av nästa steg. - Fortsätt till steg 5.14 eller store prover vid-20 ° C.
- Utföra pre-PCR amplifiering av RT-qPCR att uppskatta antalet cykler behövs för att förstärka adapter-sammanskrivna DNA. Per reaktion, Lägg till följande i 96 brunnar PCR tallrik innehållande 2 µL DNA (steg 5.11): 0.4 µL Index primer, 0.4 µL universal PCR primer, 7,2 µL H2O, 10 µL RTqPCR huvudmixen.
- Placera plattan i en realtids PCR-maskin och plattan som omfattas av följande villkor: 30 s vid 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 cykler; 5 min 65 ° C.
- Uppskatta antalet förstärkning cykler behövs för varje prov genom att subtrahera ett Ct-värde till Ct-värdet av den före förstärkning RTqPCR motsvarar slutet av linjär fas av PCR-reaktionen.
- Förstärka adapter-sammanskrivna DNA från steg 5.12 genom att blanda: 21 µL DNA, 25 µL PCR master mix, 1 µL Index primer, 1 µL Universal PCR primer och 2 µL H2O. I en termocykel, utsätta varje prov för följande villkor: 30 s vid 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [beräknade Ct från steg 5.16] cykler; 5 min 65 ° C.
Obs: Kom ihåg att bara använda ett Index primer per prov för multiplexing. Indexet infogas under PCR. - Rena de amplifierade DNA SPRI-pärlorna och eluera i 22 µL eluering buffert.
- Styra bibliotek av gel elektrofores eller alternativa metod. Leta efter rätt bibliotek peak storlekar (PCR produkt(er) storlek plus adapter).
- Uppskatta den genomsnittliga baspar storleken på de(t) bibliotek av utstryk analys: I avancerade globala inställningar, dubbelklicka på ”tabell” under utstryk analys. Definiera regionen från 100-1000 bp och klicka på OK. Under Region tabell, regionen definierad visas och bibliotek medelstorlek (bp) beräknas.
- Kvantifiera bibliotek av fluorometry. Fortsätt till steg 6 eller store bibliotek vid-20 ° C.
6. nästa generations sekvensering
- Beräkna nM koncentrationen av bibliotek med hjälp av formeln:
- Späd bibliotek till den samma nM koncentration t.ex. 2 nM (välja 4 nM, 2 nM, 1 nM, eller 0,5 nM beroende på biblioteket koncentrationer). Poolen alla bibliotek för att uppnå en pool av 2 nM bibliotek.
- Denaturering och späd bibliotek efter guiden Sekvensering instrument. Kort sagt: denaturera 2 nM poolen av 0,2 N NaOH och odla i rumstemperatur i 5 min. Dilute denaturerat poolen till en slutspädning av 10 pM. Denaturering och späd ett kommersiellt tillgängliga kontrollbibliotek till en slutspädning av 5 12.00. Till en ny tub, blanda 10 pM poolen med 20% 5 12.00 Control library.
Obs: Bisulfite konvertering introducerar mycket låg komplexitet. 20% kontroll bibliotek spike-i kommer att resultera i bättre sekvensering kvalitet. - Kör en 150 bp Parade-end sekvensering med ett djupsekvensering instrument.
7. computational analys - uppskattning metylering nivåer
- Generera .fastq filer (som här kallas sample1_R1.fastq.gz och sample1_R2.fastq.gz), generera en bismark index av hela genomet av intresse (här i en mapp som heter bismarkIndex) och kontrollera att den genomiska sekvensen av chrM finns i fasta format (här i en mapp som heter chrM).
- Förbehandla läsningar för att ta bort adaptrar och bias infördes av primrar: Använd verktyget Trim_galore33. Ta bort två nukleotider från 5' slutet av både framåt och bakåt läser.
trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--trim1--Parade sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Justera förbearbetade läsningar till hela genomet använder Bismark34
Bismark--dovetail--bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
Om en annan aligner används, kontrollera att läsningar som inte kan anpassas unikt ignoreras. - Utdrag läser mappning till kromosomen M, här med Samtools35
samtools sortera -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
samtools index sample1_sorted.bam
samtools Visa -u sample1_sorted.bam chrM | samtools sortera - n - O BAM -o sample1_chrM.bam - Extrahera den metylering informationen
bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--omfattande--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - Använda .bedGraph, .cov eller CX_report.txt filer för ytterligare analys. Använda filen sample1_chrM.CX_report.txt för visualisering och testning.
- Utföra ytterligare klippning i förbehandling steg, om flera regioner är förhörd och en primer bias kan vara synligt i M-bias tomterna genereras under mappningen. Finns i Bismark dokumentationen för mer information.
8. computational analys - Test av skillnader
- Kontrollera att filen CX_report.txt innehåller 7 kolumner kromosom (här chrM), position, strand, antal metylerade läsningar, antal unmethylated läsningar, C sammanhang och omgivande sekvens, för varje C på kromosom M.
- Eftersom CX_report omfattar chrM i sin helhet, kontrollera delmängden till de regioner som förstärks.
- Använda icke-parametriska tester för skillnader mellan prover, såsom en Fishers exakta test för enskilda CS eller en sign-test för en hel region.
Obs: Kvantifiering kommer ofta vara nära 0% metylering, vilket är anledningen till varför förutsatt att normalitet inte är lämpligt. - Likaså för visualisering, antingen visualisera quantiles eller beräkna binomiala andel konfidensintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två steg i detta protokoll är avgörande när du undersöker mtDNA metylering. (1) öppnandet av det sekundära strukturerar och 2) utformningen av mitokondrie DNA-specifika primers.
Genom att smälta den humant genomiskt DNA med restriktionsenzym BamHI (figur 1), mitokondriella DNA strukturen kommer att minska på nucleotide position 14,258 och sekundära strukturen kommer att öppnas.
Eventuella nedskrivningar av bisulfite konvertering med en intakt mtDNA sekundärt strukturera är mycket sannolikt att överskatta andelen mtDNA unconversion. Av bisulfite sekvensering, mtDNA unconversion undersöktes, i osmält och rötas totala DNA från mänskliga skelettmuskulaturen celler, på 5 olika regioner av mitokondriella genomet: den förskjutning Loop (D-Loop), tRNA fenylalanin och 12S Ribosomen (tRNA - F + 12S), 16S Ribosomen (16S), NADH dehydrogenas 5 (ND5) och cytokrom b (CYTB) mRNA-encoding genen (figur 2). Unconversion ränta varierade från 0 - 15,1% i alla undersökta regioner för osmält mtDNA. Men när DNA var rötas före bisulfite konvertering, andelen unconversion sjunkit till högst 1% i alla regioner (figur 3). Således, illustrerar vikten av BamHI matsmältningen före bisulfite konvertering att undvika överskattning av mtDNA metylering nivåer.
Kontaminering av nuclear DNA är oundvikligt när isolera det mitokondriella genomet och eftersom nästan hela mitokondriella genomet har replikerats till nukleära genomet, det har gett upphov till nukleära införanden av mitokondriella genomet kallas kärn Mitokondriell segment (NUMTs)36. För att säkerställa att de analyserade DNA metylering nivåerna motsvarar mitokondrie-DNA och inte NUMTs, är det av yttersta vikt att utforma primers som är specifika för det mitokondriella genomet. Figur 4 visar hur att kontrollera primer specificitet och tabell 1 visar mänskliga och mus mtDNA primer-sekvenser.
| Namn | Sekvens | Ställning | Kopiestorlek | Glödgning temperatur | Strand | ||
| Mänskliga | |||||||
| D-Loop | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisense | |||
| D-Loop | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisense | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisense | |||
| 16S | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Känsla | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | Känsla | |||
| Mus | |||||||
| 12S | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisense | |||
| 16S | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisense | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisense | |||
| 16S | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Känsla | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | Känsla | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | Känsla | |||
Tabell 1: Primer sekvenser för mänskliga och mus mtDNA. Observera att glödgning temperaturer av PCR primers varierar beroende på skillnader i smälttemperatur av primers.
Figur 1 : Gel elektrofores av BamHI-rötas eller osmält DNA. Genomiskt DNA från mänskliga skelettmuskulatur var obehandlade eller behandlade med BamHI för 4h vid 37° C och gelelektrofores kördes på en 1,5% agarosgel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Karta över människans mitokondriella genomet. Regioner i det mitokondriella genomet utreds av bisulfite sekvensering och BamHI restriktionsenzym webbplatsen visas. Mitokondriellt DNA innehåller 13 mRNA, 2 ribosomalt RNA och 22 överföring RNAs. Förkortningar: PH1: heavy-strand arrangören 1; PH2: Heavy-strand främja 2; PL: ljus-strand arrangören; OH: Beskärningen av replikering från heavy-strand; OL: beskärningen av replikering från ljus-strand. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : BamHI matsmältningen före bisulfite konvertering minskar andelen mtDNA unconversion i humana skelettmuskel celler. Av bisulfite sekvensering, osmält och smält mitokondrie DNA unconversion andel var förhördes på fem olika områden i det mitokondriella genomet i human skelettmuskel celler (N= 3). Hela torget representerar CpG platser och det öppna torget representerar icke-CpG platser. Resultaten presenteras med en min-max intervall och ett tecken-test användes för att testa för betydande unconversion skillnader. D-Loop (6-298) P= 1.83E-42; D-Loop (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12S: P= 8.38E-16; 16s: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-Loop (6-298) omfattar ursprunget för replikering och tRNA - F + 12S omfattar tunga strand arrangören 2. Dessa data har varit publicerad någon annanstans 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Användningen av Bisearch att kontrollera primer specificitet mot mitokondriella genomet. (A) Bisulfite-konverterade primer sekvenser läggs till funktionen BiSearch Primer Sök (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). Bisulfite rutan är ikryssad, och en referens genomet är markerad. B) exempel på potentiella PCR-produkter genereras på förnuft och antisense kedjor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, tillhandahåller vi ett bisulfite-sekvensering protokoll som är speciellt utformad att förhöra mtDNA metylering. Skillnaderna med bisulfite-sekvensering protokoll används för genomiskt DNA ligger vid utnyttjande av ett tidigare restriktionsenzym matsmältningen steg och ett bioinformatiska analyser dom ut falska positiva som uppkommer NUMT sekvenser.
Vi tillhandahåller ett protokoll för att undvika bisulfite-sekvensering artefakter när du undersöker mtDNA metylering. Bisulfite sekvensering artefakter leder till falskt positiva resultat var tidigare rapporterade37. Otillräckligt avlägsnande av DNA tillbehör proteiner av proteinas K har varit beskrivs37. Ofullständig denaturering eller partiell reannealing kan leda till sträckor av ofullständig omvandling, möjligen genom att sänka tillgång av bisulfite till enkelsträngat DNA37. Den sena artefakten kan vara spelar i mtDNA om en sekundär struktur skulle försämra tillgången till cytosin. Till bäst av vår kunskap, har tillägg av ett restriktionsenzym matsmältningen steg före bisulfite konvertering i samband med uppskattningen mtDNA metylering av först rapporterats i 20163,28. I våra händer, sänkte tidigare rötning med ett singel-skärare restriktionsenzym dramatiskt detektion av oomvända cytosin3,28.
Här, tillhandahåller vi en bioinformatiska pipeline att analysera bisulfite sekvensering resultaten och att upptäcka bisulfite sekvensering artefakter i samband med hela mitokondriella genomet bisulfite sekvensering. Denna metod härstammar från vår observation att mtDNA icke-omräkningskurs var omvänt korrelerad med sekvensering djup3,28. Denna observation antyder att mtDNA sekundär och även tertiär struktur försämrar fragmenteringen av mtDNA på specifika regioner under byggandet av sekvensering bibliotek och kan också försämra full tillgång av natrium bisulfite till mtDNA. Eftersom matsmältningen med ett one-skärare enzym släpper sekundära och tertiära strukturer, indikerar våra resultat att mtDNA struktur är en källa till bisulfite artefakt och validera de metoder som beskrivs häri för kvantifiering av cytosin metylering i mtDNA.
Oundviklig kontaminering av kärn-DNA i mitokondriell förberedelse utgör en utmaning. Detta leder till förorening i NUMT sekvenser i sekvensering läser, som kan bias uppskattning av cytosin metylering i mtDNA, även när utför riktade och inte hela mitokondriella genomet bisulfite sekvensering. För att undvika sådan bias, möjliggör utformningen av unika bisulfite sekvensering primers för att utesluta kontamination med metylering på NUMTs. NUMTs spänner över vissa regioner av människa och mus mitokondriella genomet med 100% identitet, och det är därför omöjligt att utforma unika grundfärger på vissa mtDNA regioner. När du utför hela mitokondriella genomet bisulfite sekvensering, sekvensering länge kan läser lindra diskriminering mellan mtDNA och NUMTs. Anpassa läsningar till hela genomet och Använd bara läser unikt mappas till det mitokondriella genomet ytterligare kan säkerställa upptäckt av mtDNA metylering.
Slutligen, detta protokoll kan användas utöver mitokondriella genomet, till exempel i andra instanser av bisulfite sekvensering där det sekundära strukturerar av DNA utgör en potentiell källa till artefakt. Associationen mellan metylering nivåer och sekvensering djup kan undersökas för att bedöma behovet av en uppslutning med ett restriktionsenzym före bisulfite sekvensering av komplexa DNA-sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande ekonomiska intressen att deklarera.
Acknowledgments
Novo Nordisk Foundation centrum för grundläggande metabolisk forskning är en oberoende research center vid Köpenhamns universitet delvis finansieras av en obegränsad donation från Novo Nordisk Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
