Summary
Nous présentons ici un protocole pour obtenir un grand champ de vision (FOV) en trois dimensions (3D) fluorescence et l’image rétinienne OCT en utilisant une nouvelle plate-forme multimodale d’imagerie. Nous allons introduire la configuration du système, la méthode de l’alignement et les protocoles opérationnels. L’imagerie in vivo sera démontrée, et recevront les résultats représentatifs.
Abstract
Alors que l’imagerie de fluorescence est largement utilisée en ophtalmologie, une image rétinienne en trois dimensions (3D) fluorescence du grand champ de vision (FOV) est toujours un grand défi avec la rétine state-of-the-art modalités d’imagerie car il leur faudrait z un empilement de Compiler un ensemble de données volumétrique. Plus récente tomographie à cohérence optique (OCT) et systèmes d’angiographie (OCTA) OCT surmonter ces restrictions afin de fournir des images vasculaires et anatomiques en trois dimensions (3D), mais la nature sans colorant, octobre ne peut pas visualiser la fuite indicative de vasculaire dysfonction. Ce protocole décrit une oblique roman analyse technique de laser ophtalmologique (oSLO) qui fournit l’imagerie rétinienne fluorescence volumétrique 3D. Le programme d’installation du système d’imagerie génère l’oblique le balayage par un curseur de queue de colombe et aligne le système d’imagerie final à un angle pour détecter les images fluorescentes en coupe transversale. Le système utilise la méthode de balayage au laser et par conséquent, permet une intégration facile des OCT comme volumétrique modalité d’imagerie structurelle complémentaire. L’imagerie in vivo sur la rétine de rat est démontré ici. Solution de fluorescéine est injectée par voie intraveineuse pour produire l’angiographie à la fluorescéine volumétrique (vFA).
Introduction
Ophtalmologie et vision science bénéficier grandement les techniques modernes d’imagerie optiques, étant donné que la rétine est facilement accessible avec la lumière. Imagerie rétinienne de fluorescence est un outil essentiel dans le diagnostic et la gestion de Chorio-rétinienne de maladies vasculaires comme la rétinopathie diabétique (RD) et de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), qui sont causes principales de cécité aux Etats-Unis.
Toutefois, il est toujours difficile d’acquérir un grand champ de vision (FOV), en trois dimensions rétinienne (3D), imagerie par imagerie de fluorescence. La photographie du fond de œil n’a pas la capacité de résolution de profondeur et ne rejette pas la lumière diffuse. Ainsi, le mélange des signaux provenant de différente profondeur réduit la qualité de l’image. Balayage ophtalmoscopie laser (SLO) et confocale SLO (cSLO) ne peut réduire l’effet de lumière diffuse à l’aide de gating confocal1. Toutefois, il est difficile pour SLO ou cSLO d’acquérir une image 3D de rétine humaine en raison de la limite de leur profondeur de champ. Optique adaptative SLO (AOSLO) permettent une superbe résolution et un contraste en corrigeant les aberrations de wavefront introduite par le œil humain. Toutefois, AOSLO aurait encore besoin z d’empilage pour imagerie volumétrique2. Systèmes de l’angiographie (OCTA) de OCT et de tomographie par cohérence optique3 surmonter ces restrictions afin de fournir en trois dimensions (3D) des images anatomiques et vasculaire4,5,6, mais la nature sans colorant d’OCT ne peut pas visualiser fuite indicative de dysfonction vasculaire.
Ce protocole décrit une nouvelle plate-forme multimodale pour rétinienne de fluorescence volumétrique 3D imaging, nommément oblique de balayage laser ophtalmologique (oSLO). Dans ce système d’imagerie, une oblique de la numérisation est générée par un curseur de queue de colombe, et un système d’imagerie final est aligné dans un angle pour détecter la fluorescence Croix images sectionnelles. Le système utilise des méthodes de balayage laser, et ces techniques permettent une intégration facile avec OCT comme volumétrique modalité d’imagerie structurelle complémentaire. La résolution actuelle de profondeur est d’environ 25 µm dans la rétine de rat et le champ de vision est de 30°. Essentiellement, l’oSLO permet une version fluorescente de OCT et peut être associé simultanément OCT et OCTA sur un grand champ de vision.
Dans ce protocole, nous allons décrire l’installation de l’oSLO, la méthode d’alignement et de la construction, la méthode de l’imagerie in vivo de la rétine de rat et les résultats représentatifs.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’utilisation Comité (ACUC) du centre médical de Boston et animalier.
1. Configuration du système
- Système d’oSLO
- Utiliser une source de laser de supercontinuum comme la source de laser de système.
- Séparer la gamme de lumière visible (450-650 nm) des longueurs d’onde plus élevée (650-2000 nm) par un miroir dichroïque (DM1). Élargir le spectre d’une paire de prismes dispersion après la poutre, en passant par un séparateur de faisceau de polarisation (PBS).
- Placer une fente pour sélectionner la plage de longueur d’onde d’excitation (475-495 nm). Utiliser un miroir réfléchissant pour refléter le faisceau filtré à la paire de prisme et puis coupler la lumière dans une fibre monomode (SMF 1).
- Utiliser un spectromètre pour confirmer la sélection de longueur d’onde à la sortie de la fibre monomode.
- Raccorder la fibre monomode à deux coupleurs en cascade fibre optique tel qu’illustré à la Figure 2. On le port fibre de sortie du deuxième coupleur fibre de livre la lumière sur le système d’oSLO.
- Collimater le laser tout d’abord dans le système d’oSLO.
- Faire dévier le laser par un miroir de galvanomètre (GM1). Relais le laser sur un second miroir galvanomètre (GM2) par un système de télescope de 1:1 et plus loin à la pupille de le œil par un système de télescope de 3:1.
- Installer un miroir dichroïque (DM2) au sein du système de 3:1 télescope afin de refléter les signaux de fluorescence.
- Monter le système de télescope de 3:1 et le miroir dichroïque (DM2) sur un curseur personnalisé Colombe de queue pour compenser l’axe optique et créer l’oblique illumination de numérisation tel qu’illustré à la Figure 3. Un pied à coulisse permet de contrôler précisément la longueur d’offset comme vous le souhaitez.
- Chemin optique d’imagerie de fluorescence.
- Tenir compte de la fluorescence par le miroir dichroïque et relais vers le troisième miroir galvanomètre de numériser le balayage lent.
- Relais de la lumière à un objectif d’imagerie par un autre système du télescope de 1:1. Installer l’optique ci-dessus sur une étape de traduction.
Remarque : Deux étapes de traduction supplémentaires sont installés sous le troisième miroir de galvanomètre (GM3) pour fournir la redondance dans les degrés de liberté pour l’optimisation de l’imagerie.
- Monter un système d’imagerie final sur une scène qui possède trois degrés de liberté (deux axes de translation et rotation). Utiliser une caméra plane pour capturer les images de coupe transversale de fluorescence.
- Utiliser une source de laser de supercontinuum comme la source de laser de système.
- Système de tomographie à cohérence optique
- Utiliser la même source de laser de supercontinuum comme la source du système laser.
- Séparer le proche infrarouge (NIR) (650 à 900 nm) de la lumière restante (650-2000 nm) par un autre miroir dichroïque (DM3). Utilisez un filtre passe longue pour limiter la bande passante à 800-900 nm. Coupler le faisceau dans une fibre monomode (SMF 2).
- Raccorder la fibre monomode à l’autre port d’entrée des deux dispositifs en cascade de fibre optique à combiner avec l’excitation d’oSLO bleu. Diriger la lumière de la deuxième voie de sortie de la deuxième coupleur fibre sur le bras de référence OCT, qui dispose d’un filtre de densité neutre variable (VNDF), plaques de compensation de dispersion et d’un miroir réfléchissant.
NOTE : La lumière rentrait le bras de référence et le œil se recombine à la deuxième coupleur fibre optique et est livré au spectromètre OCT de recueillir le signal.
- Utiliser la même source de laser de supercontinuum comme la source du système laser.
- Acquisition de données
- Utiliser un logiciel de système acquisition données écrit dans LabVIEW et modification du protocole balayage OCTA7,8,9,10. Pour chaque B-scan, un cycle d’utilisation de 80 % ont vu la dent avec 500 marches est sortie par une carte de sorties analogiques (AO1) pour contrôler le x' miroir de balayage rapide, GM2.
- Déclencher la caméra de balayage de ligne à chaque étape afin d’acquérir des données pour l’OCT uniquement lorsque le miroir est à l’avant en direction de numérisation. Définir la durée d’exposition pour la caméra de balayage ligne être 17 µs.
- Pour acquérir le signal de l’OCTA, recommencez la mesure 5 fois au même endroit B-scan.
- Fixer le taux de sortie AO à 100 kHz et le taux d’a-line OCT à 50 kHz. Contrôler le y' lent miroir de balayage, GM1, par une forme d’onde rampe. Synchroniser le miroir de balayage, GM3, avec GM1 de numériser le balayage lent.
- Déclencher la caméra plane par une autre carte de sorties analogiques (AO2) pour capturer une image fluorescente à chaque y' emplacement. Récolte de la taille d’imagerie ou bin les pixels voisins pour augmenter la vitesse et la sensibilité comme vous le souhaitez.
2. alignement du système
- Ajuster la fente dans la source de lumière oSLO pour sélectionner la longueur d’onde d’excitation bleu. Utiliser un spectromètre pour surveiller le domaine spectral à environ 475-490 nm.
- Ajustez le curseur de Mont de queue de colombe pour décaler l’axe optique de ~ 5 mm. Cela se traduira par un décalage par rapport à l’élève de rat de ~1.7 mm, ayant pour résultat un angle oblique de ~ 15° sur la rétine.
- Ajuster le positionnement de l’optique de détection de fluorescence par la même 5 mm.
- Ajuster la fluorescence finale d’imagerie système pour être ~ 30°.
- Mesurer la puissance optique à l’aide d’un wattmètre. Assurez-vous que la puissance d’excitation oSLO bleu est ≤0, 2 mW et l’OCT laser puissance ≤0.8 mW, ce qui ne causera pas de dommages de la rétine.
Remarque : Selon la norme ANSI, l’exposition maximale permissive (MPE) à la rétine est au niveau du ~ 2mW7,8 , dans la gamme de lumière visible. Selon la formule de Delori et al. 9, l’erreur maximale tolérée pour la lumière infrarouge proche est environ deux fois plus élevée que la lumière visible, à environ 4 mW.
3. in Vivo une expérimentation animale
- Transférer un rat Long Evans mâle de 12 semaines dans la chambre de l’induction. Anesthésier le rat à l’isoflurane de 4,5 % en oxygène pendant 10 minutes avec un débit de 2 L/min par un vaporisateur isoflurane.
- Confirmer la profondeur de l’anesthésie, comme déterminé par l’absence du réflexe de retrait pendant une pincée interdigitale.
- Après l’induction, placez le rat sur un support de 5 axes (x, y, traductions de z, lacet et tangage). Fournir de la chaleur supplémentaire par utilisation d’une platine chauffante, couverture de l’eau chaude ou autre méthode appropriée dans une expérience prolongée en circulation. Maintenir l’anesthésie à 1,5 % d’isofluorane avec un débit de 2 litres/minutes au cours de la partie restante de l’expérience. Quand ne pas utiliser une chambre à induction avec échappement actif, la chambre d’induction doit être placée sur une table backdraft ou encastré ou sous un tuba pour piéger l’isoflurane.
- Dilater la pupille avec 1 % Tropicamide solution ophtalmique pendant 2 minutes. Appliquer 0,5 % HCl Tétracaïne solution ophtalmique sur oeil de rat pour anesthésie locale supplémentaire, si nécessaire. Gardez le œil bien hydratée avec des larmes artificielles commerciales au moins une fois par minute au cours de l’expérience.
- Injecter la fluorescéine sel (10 % p/p) ou FITC (10 % p/p) diluée dans du sérum physiologique stérile (0,1 à 0,3 mL) par l’intermédiaire de la veine caudale avec 1 mL d’une seringue et une 29G aiguille.
- Allumez la source de laser. Placer un filtre de densité neutre pour atténuer l’excitation lumineuse bleue lors de l’alignement. Mesurer la puissance de la lumière d’OCT à être ~0.8 mW et la lumière bleue < 0,01 mW pour éviter la formation de cataractes.
- Démarrer le mode de numérisation et de l’alignement du galvanomètre. Régler la hauteur de la boule d’oeil pour faire un laser stationnaire spot sur la cornée. Ajuster la position des yeux rat pour rendre le bord de la pupille à peu près perpendiculaire au laser et compenser le laser au pôle apical de le œil à tout ~1.5 mm.
- Plus loin ajuster le titulaire de l’animaux images OCT jusqu'à une qualité optimale. Au x ' direction de numérisation rapide, s’assurer que l’image coupe transversale de la B-scan apparaît plate. Lors du passage à l’o ' lent balayage direction, assurez-vous que l’image de B-scan coupe transversale apparaît inclinée, en raison de la numérisation oblique.
- Enlever le filtre de densité neutre à l’excitation lumineuse bleue et surveiller l’alimentation de la caméra en temps réel. Image de fluorescent sectionnelle croisée doit apparaître montrant les vaisseaux sanguins qui apparaissent dans différentes profondeurs.
- Régler la netteté de la fluorescence finale d’imagerie afin de parvenir à la mise au point optimale. Permettent un réglage de la position de le œil dans le plan latéral pour atteindre une qualité d’image optimale oSLO.
- Après la mise en conformité, commencent à acquérir simultanément OCTA et angiographie à la fluorescéine volumétrique (vFA).
- Construire les images volumétriques pour les OCTA et oSLO par Matlab. Les algorithmes sont décrites en détail10. Générer vasculatures rétiniennes résolue en profondeur en segmentation d’image.
- À l’issue de l’imagerie, éteindre le laser, libérer l’animal et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux et puis placer l’animal dans une zone de récupération.
- N’abandonnez pas l’animal jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal ou selon la politique de l’établissement.
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Representative Results
Figure 4 a montre une image de OCT transversale de la rétine de rat. Figure 4 b -4 c montrent les mêmes images rétiniennes transversales de vFA OCTA et oSLO acquis en même temps. L’oSLO permet transversale FA analogue à l’OCT B-scan. En comparaison de l’OCTA, l’image coupe transversale d’oSLO vFA identifie clairement les vaisseaux dans la couche de fibres nerveuses (NFL) et de la couche de cellules de ganglion (GCL) et les capillaires dans la couche plexiforme externe (OPL). Figure 4 d et g 4 montrent la couche superficielle de l’image de vFA OCTA et oSLO. Contrairement à l’OCTA, l’image de vFA oSLO (Figure 4 g) permet d’éviter les artefacts de mouvement (bandes verticales dans la Figure 4 d) en utilisant le contraste d’émission de fluorescence. En comparant le vFA oSLO (Figure 4e) et les images d’OCTA (Figure 4 h) au sein de la couche intermédiaire rétinienne, les bateaux de plongée verticalement sont clairement indiquées dans l’image de FA d’oSLO, mais non apparentes en OCTA. C’est sans doute parce que la vitesse d’écoulement de sang ou de l’orientation du navire aura une incidence sur le signal de l’OCTA, mais pas le contraste de fluorescence d’oSLO.
Figure 4f et 4i montrent les images dans la couche du plexus capillaire profond. Les régions indiquées par les flèches bleues en vFA oSLO ont un meilleur contraste que OCTA dans le système vasculaire. La taille de la veinule indiqué par les flèches blanches à oSLO est plus grande que celle de l’OCTA. Dans l’ensemble, l’image de vFA oSLO ressemble à la morphologie vasculaire réelle avec une précision supérieure OCTA, puisqu’il n’est pas dépendant de la vitesse d’écoulement de sang ou de l’orientation du navire. Un visage en survol de deux ensemble de données volumétriques simultanément acquises depuis oSLO et OCTA apparaissent dans la vidéo 1.
Figure 1. Le système schématique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. La photographie des deux coupleurs de fibres en cascade qui dirigent l’oSLO et OCT léger. Les routes du col léger sont étiquetés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Le programme d’installation de la monture de queue de colombe pour éclairage oblique. (a) le travail solid modèle pour la partie éclairage oblique. (b-c) La vue agrandie et la vue séparée de la monture de queue de colombe. (d) la photographie de l’installation réelle pour la partie éclairage oblique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Image rétinienne de rat acquise par oSLO et OCTA dans le même temps. L’exemple de (a) l’image coupe transversale de l’OCT (b), OCTA et (c) oSLO FA. Panneaux (d) et (g) montrent le visage en OCT et images FA oSLO de la couche superficielle. Les artefacts de mouvement dans l’image de l’OCTA a été souligné par les flèches rouges. Panneau (e) et (h) montrent les résultats de la couche intermédiaire. Les emplacements où les vaisseaux se plongent dans la couche suivante ont été signalés par les flèches jaunes, qui sont plus claires sur oSLO FA que OCTA. Panneaux (f) etj’aimontrent les résultats de la couche de plexus capillaire profond. Le contraste d’oSLO est mieux que l’OCTA dans la région indiquée par les flèches bleues. La taille de la veinule indiqué par les flèches blanches à oSLO est plus grande que celle de l’OCTA. Barres dans la figure est 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons décrit à oSLO, une en vivo volumétrique fluorescent d’imagerie rétinienne technique avec un FOV de plus de 30 °. Par rapport à octobre, un standard actuel méthode en ophtalmologie, d’imagerie oSLO offre un capacité d’imagerie en 3D similaires mais permet de contraste de fluorescence qui OCT n’est pas sensible aux. L’avantage d’oSLO est qu’elle nécessite qu’une seule méthode raster et permet ainsi la combinaison transparente de PTOM, prévoyant deux techniques complémentaires imagerie volumétrique structurel et fluorescent.
Dans ce protocole, le point clé pour obtenir la bonne qualité d’image est la clarté de le œil de rat. Si l’image d’oSLO est obscurci, examiner s’il y a formation de cataractes. Plusieurs facteurs tels que l’anesthésie de la kétamine/xylazine, séchage de la cornée et une surexposition à la lumière bleue provoque la formation de cataractes, qui détériorerait considérablement la qualité de l’image. Pour éviter des cataractes, éviter une exposition continue à la lumière bleue pendant plus de 2 minutes ; appliquer larme de l’oeil artificiel au moins une fois par minute, pour éviter le dessèchement de cornée ; et laisser les yeux se reposer au moins 30 secondes entre les sections d’imagerie en bloquant la lumière.
Nous envisageons qu’oSLO peut influer significativement la pratique clinique de l’imagerie de fluorescence. Nous avons montré que la profondeur, pouvoir de résolution peut éliminer efficacement le signal provenant de la rétine externe, ce qui donne des images de FA volumétriques contrasté jusqu’au niveau capillaire unique, qui est impossible à obtenir avec SLO classique. La clarté d’image considérablement améliorée permettrait de détection plus sensible et quantification des rejets de sang-rétine barrière perturbation et décollement de rétine capillaire fuite, la marque distinctive d’un oedème maculaire vision en danger dans RD et autre Chorio-rétinienne vasculaire maladies.
Dans le système actuel, la vitesse de la caméra CCD est de 20 images par seconde, ce qui conduit à > 25 seconde acquisition fois. Une caméra CMOS scientifique améliorera considérablement la vitesse du système. La détection de la fluorescence a une autre voie optique séparée de l’éclairage. Cela simplifiera le système si la conception en utilisant le même chemin optique pour l’éclairage et la détection à l’avenir. En résumé, une nouvelle plate-forme multimodale pour l’imagerie rétinienne volumétrique, nommément oblique de balayage laser ophtalmologique (oSLO), a été présentée. Le grand champ de vision en vivo imagerie sur un angle de 30 ° de la rétine de rat à l’aide d’oSLO et la tomographie en cohérence optique simultanée (OCT) a été démontrée.
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Disclosures
ji Yi est titulaire d’un brevet en instance pour oSLO. Autres auteurs ne déclarent aucun intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Financement est assuré par le financement de la Fondation Evans Medical du centre médical de Boston, mais aussi un contrat de sous-traitance de NIH 5R01CA183101, pilote de BU-ILEC grant 1UL1TR001430, BU-Joslin programme pilote et BU-ILEC KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
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