Summary
조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.
Abstract
예측에 관한 (미르)은 작은 비 코딩 RNA는 post-transcriptional 메신저 RNA (mRNA) 식 억제. 인간의 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 같은 조직 및/또는 질병 진행과 관련 된 셀 전용 미르 식 활성화를 표시 되었습니다. MiRNA 식의 억제 치료 적 개입에 대 한 가능성을 제공합니다. 그러나, miRNAs, antagomir oligonucleotides 채용을 억제 하는 기존의 방법과 글로벌 배달 시 특정 miRNA의 기능에 영향을. 여기, 우리가 쥐 모델에서 미르-181 가족의 비보에 심장 관련 금지에 대 한 프로토콜을 제시. 미르-스폰지 구조는 10 반복된 안티 miR-181 바인딩 시퀀스를 포함 하도록 설계 되었습니다. 심장 관련 α-MHC 발기인은 심장 관련 미르-181 미르-스펀지 식 드라이브를 pEGFP 등뼈에 복제 됩니다. 안정적인 셀을 만들려면 미르-181-스폰지, myoblast H9c2 셀을 표현 하는 라인 α-MHC-EGFP-miR-181-sponge 구조와 페 되 고 형광 활성화 된 세포 (FACs) 네오 마이 신으로 교양 GFP 긍정적인 H9c2 세포로 정렬 하 여 정렬 (G418)입니다. 네오 마이 신에 안정적인 성장, 단일 클로 널 세포 인구 추가 FACs 및 단일 세포 복제에 의해 설립 됩니다. 결과 myoblast H9c2-미르-181-스폰지-GFP 셀 미르-181 대상 단백질의 증가 된 표현을 통해 평가 미르-181 가족 구성원의 기능의 손실을 전시 하 고 출 격 비 기능 스폰지를 표현 하는 H9c2 세포에 비해. 또한, 우리는 complexing 긍정적으로 자주 나노 입자를 충전 하 고 부정적으로 위탁 미르-181-스폰지 플라스 미드에 의해 미르-181-스폰지 구문의 체계적 전달에 대 한 nanovector를 개발 한다. GFP의 이미징 vivo에서 3 주 기간 동안에 nanovector의 여러 꼬리 정 맥 주사는 심장 특정 방식으로 미르-181-스폰지의 중요 한 식 홍보 수 있습니다 밝혀. 중요 한 것은, 미르-181 기능의 상실 심 혼 직물에는 신장 이나 간만 관측 된다. 미르-스폰지 조직 관련 미르 식 억제 하는 강력한 방법입니다. 미르-스폰지 식 조직 특정 발기인에서 운전 대상된 기관 또는 조직에 국한 될 수 미르 저해에 대 한 특이성을 제공 합니다. 또한, nanovector 및 미르-스폰지 기술을 결합 한 효과적인 배달 및 조직 관련 미르 저해에서 vivo에서허용 합니다.
Introduction
지난 2 년간 인간의 질병에 miRNAs의 중요 한 역할을 지적 하는 수많은 연구 되었습니다. 문학의 큰 몸 결과 miRNAs 질병, 암1 등 심혈 관 질환2,3,,45의 이상에의 명백한 중요성을 보여 줍니다. 예를 들어, 미르-21는 증가 세포 주기, 세포 확산6결과 많은 암에 upregulated입니다. C 형 간염 감염에서 미르-1227바이러스 복제에 중요 한 역할 하 고 미르-122의 저해 바이러스 부하8감소 표시 되었습니다. 심장 비 대에서 미르-212/132에에서 upregulated 이며 병 적인 표현 형9에 관여. downregulation의 명백한 중요성 또는 upregulated miRNA의 기능 억제 치료로 거의 모든 질병에 미르 생물학을 악용에 대 한 기회를 제안 합니다.
4 미르-181 가족 구성원, 미르-181a/b/c/d, 인간 게놈에 있는 3 개의 genomic 위치에서 찾을 수 있습니다. 비 코딩 RNA 호스트 유전자 (MIR181A1-HG)의 intronic 지역 미르-181-a/b-1의 클러스터를 인코딩합니다. NR6A1 유전자의 intronic 지역 미르-181-a/b-2를 인코딩합니다. 미르-181-c/d 클러스터는 염색체 19에 새롭거나 사본에 있습니다. 모든 미르-181 가족 같은 "씨앗" 시퀀스를 공유 하 고 모든 4 명의 미르-181 가족 구성원 잠재적으로 동일한 mRNA 표적을 통제할 수 있다.
우리3,4 등10 말기 심장 마비 동안 미르-181 가족의 중요성을 강조 했다. 우리는 또한 미르-181 c upregulation는 타입 II 당뇨병 등 심장 질환의 위험 증가, 비만, 노화3,,45와 관련 된 병 적인 조건 하에서 발생 하는 것을 인식 했다. 그것은 overexpression 미르-181 c의 산화 스트레스는 심장 부전4에 이르게 하면 가정 되었습니다.
미토 콘 드리 아11,12,,1314에 존재 하는 miRNA 하지만 우리 미르-181 c 처리, 핵 게놈에서 파생 된 증명을 최초로 여러 그룹 제안 및 그 후 translocated RISC3에서 미토 콘 드리 아에. 또한, 우리 심장5의 미토 콘 드리 아 구획에 181a 미르와 미르-181b 낮은 식을 감지 했습니다. 중요 한 것은, 우리는 발견 그 미르-181 c 누르는 mt COX1 mRNA 식 miRNAs 미토 콘 드리 아 유전자 규칙에 참여 하 고 미토 콘 드리 아 기능3,4를 변경 함으로써 시연.
이 문서는 cardiomyocytes에 미르-181 가족 전체를 허물고 미르-스폰지를 디자인 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다. 또한, 우리 미르-181-스폰지의 비보에 응용 프로그램에 대 한 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었다.
1. 스폰지 디자인
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바인딩 3' UTR 예측에 관한
참고: 특정 기본 쌍 상호 작용을 통해 3' 되지 않은 지역 (UTR)에 부분적으로 무료 사이트와 그것의 표적 mRNAs의 A 미르 기능 (종합적인 검토에 대 한 참조 Bartel)15.- MiRNA 식 oligonucleotides 상당한 complementarity 미르 시퀀스에 포함 된로 억제제를 디자인 합니다. 미르는 oligonucleotide 미르 기능을 차단 하는 광범위 한 기본 쌍을 통해 복잡 한에 격리.
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MiRNA 스폰지의 디자인
- Tandemly 기준점과 부분적으로 보완 미르 시퀀스 Argonaute 2에 의해 일반적으로 죽 습 위치에 돌출을 포함 하도록 디자인. 돌출은 RNA 간섭 유형 분열 및 스폰지의 저하를 방지 하기 위해 성숙한 미르 순서의 뉴클레오티드 9-12에 배치 됩니다.
- 원하는 경우 모든 미르-181 가족 구성원에 바인딩할 미끼 대상 시퀀스 디자인. 심사와 미르-181 가족 미르 시퀀스의 비교, 5'-측면에 8 연속 뉴클레오티드를 포함 하는 돌출의 일반적인 시퀀스 찾기 또는 3'-측면에 추가 8의 돌출의 모든 4 미르-181 가족 구성원에 게 일반적인 시퀀스를 찾을 연속 뉴클레오티드입니다. 이러한 2 시퀀스 각각 왼쪽 및 오른쪽 절반 바인딩 사이트를 나타냅니다.
참고: 미끼 시퀀스 GGA 공백에 의해 구분 된 왼쪽과 오른쪽 절반 바인딩 사이트의 직렬 식 배열입니다. 함께 5'-끝 순서 및 3'-사이드 시퀀스 (단계 1.2.2에서에서 설명)을 연결 GGA 스페이서 돌출 (단계 1.2.1에서에서와 같이)는 미르를 단련 하는 때 생성 하도록 합니다. 반복이 1 미르 바인딩 사이트 10 최종 미르-스폰지 구문에서 x.
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다른 미르 스폰지 고려 사항
참고: 받는 사람 표정 벡터에 스폰지 시퀀스를 복제 하려면 제한 nuclease 인식 사이트 포함 되어야 합니다 시퀀스의 각 끝에. 선택한 제한 효소와 다운스트림 복제 응용 프로그램에 사용 되는 다른 제한 효소에 의해 스폰지 시퀀스의 일반적인 분열을 확인 하 철에서 소화 분석을 사용 해야 합니다.- 미르-181-스폰지 시퀀스는 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)에 대 한 코딩 시퀀스의 일부가 아니다는 5'-끝에는 합성 3' UTR의 두 배 정지 codon (TAA TAA)를 추가 합니다.
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복제에 대 한 스펀지 DNA의 합성
- DNA 합성기를 사용 하거나 복제에 대 한 장소에서 제한 nuclease 인식 사이트와 최종 미르 스폰지 시퀀스를 합성 하는 상용 소스. 스폰지는 박테리아에 증폭에 대 한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있는 플라스 미드에 제공 됩니다. 또한, 스폰지 복제에 대 한 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 될 수 또는 단순히 기증자 벡터 1.3 단계에서 설명한 제한 사이트를 사용 하 여 퇴 (또한, 단계 3.1 참조).
2. 복제 조직 특정 발기인을 포함 하도록 받는 사람 벡터
참고: 미르 스폰지의 식 카세트에 대 한 받는 사람 벡터로 pEGFP C1 벡터를 사용 합니다. PEGFP-C1 벡터에는 EGFP 세포 (CMV) 모터에 의해 구동의 독서 프레임을 포함 되어 있습니다. CMV 발기인은 포유류 세포에서 constitutively 활성화 됩니다. 조직의 특정 발기인이 필요한 경우 CMV 발기인 AseI 및 NheI 효소 (단계 2.1 참조)의 소화에 의해 제거할 수 있습니다. 플라스 미드 포함 한 광범위 한 여러 복제 사이트 (MCS) 박테리아에 선택과 포유류 세포에 있는 안정 된 식에 대 한 대 (관)과 네오 마이 신 (G418) 뿐만 아니라 각각 합니다.
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PEGFP-c 1에서 CMV 발기인을 제거
- 소화 반응 상용 다이제스트 버퍼 사용 제한 효소의 제조에 의해 제안 x 1의 50 μ, 플라스 미드 DNA (물)에서 5 μ g 및 AseI 및 NheI 효소의 5 μ를 각각 확인 합니다. Microcentrifuge 튜브에 모든 구성 요소를 추가 하 고 부드럽게 그것을 터치 하 여 그들을 믹스. 회전 10 튜브 하단에 반응 수집을 microcentrifuge에 s. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 반응을 품 어.
- 소화 선형화 플라스 미드 정화. 열 바인딩 버퍼 (사용 되는 DNA 정화 열 제조에 대 한 적절 한 바인딩 버퍼의 독점적인 혼합)의 반응 볼륨 5를 추가 하 고 제조 업체에 의해 설명 된 대로 DNA 정화 열 반응을 정화. 열 중심에 신중 하 게 추가 차입 버퍼 (물)의 25 μ와 elute.
- 젤 같이 0.5 %agarose 젤에 소화 플라스 미드 정화: eluted 플라스 미드를 버퍼 (50% 글리세롤-3 배 염료를 로드) 로드의 5 μ를 추가. 1 0.5 %agarose 젤에 잘로 전체 샘플을 로드 합니다. 500와 별도 레인 포함 포경된 벡터의 ng. 자르고 포경 플라스 미드의 적절 한 분리를 달성 될 때까지 30-40 분 동안 그것을 실행 합니다.
- 다음과 같이 선형화 플라스 미드 정화: UV 라이트 박스에 agarose 젤에서 DNA를 시각화. 깨끗 한 면도날으로 선형 플라스 미드에 해당 하는 밴드를 삭제할 신중 하 게.
참고: 선형 플라스 미드 포경된 플라스 미드 보다는 더 낮은 실행 해야 하 고 단일 밴드 약 4.2 kb로 표시 됩니다. 삭제 CMV 발기인 약 500 뉴클레오티드 (nt)에 빛 밴드로 표시 됩니다. - 상용 키트를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 하 고 물 25 μ와 열에서 DNA elute.
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심장 관련 발기인 pEGFP c 1로 복제
참고: 알파 myosin 무 겁 사슬 (α-MHC) 발기인은 이전 특징 이었고 다음 Molkentin, Jobe, 그리고 햄16에 설명 된 대로 심장 제한 식의 강력한 레벨을 직접 시연 했다. 다음 섹션에는 복제에 대 한 벡터의 발기인을 증폭 하는 방법을 설명 합니다.- Α-MHC 발기인 요소 420 p40 플라스 미드16 에 전사 시작 사이트를 기준으로-2934를 처음으로 사이 클론 PCR를 위한 템플렛으로이 지역 그리고 플라스 미드를 측면 PCR 뇌관 설계. 증폭 PCR 뇌관 앞에서 설명한5를 사용 하 여 모터 지역. 앞으로 반전 PCR 뇌관 퓨전 감독 복제 수 있도록 pEGFP C1 (2.1 단계)의 소화 끝에 오버랩의 시퀀스를 포함 합니다. 퓨전 클로닝을 위한 뇌관 디자인의 포괄적인 설명에 퓨전 매뉴얼을 참조 하십시오. 뇌관 순서는 표 1에서 발견 된다.
- 각 뇌관 및 10의 1 μ M를 포함 하는 50 μ PCR 반응 준비 템플릿 DNA의 ng. PCR 효소 및 선택한 PCR 시 약의 제조에 따라 dNTPs의 적절 한 금액을 추가 합니다. 표준 DNA 자전거 블록에 PCR을 수행 합니다. 수행 하는 3 분 5, 30, 및 120에 대 한 변성 시키기, 어 닐 링, 그리고 확장의 35 주기 다음 단계를 변성 시키기 98 ° C s 각각, 각각. 72 ° c.에서 10 분의 최종 확장 포함
- PCR 및 젤 추출 정리. 완료 되 면 PCR 주기, PCR 반응에 열 바인딩 버퍼의 반응 볼륨 x 5를 추가 하 고 제조 업체에 의해 설명 된 대로 DNA 정화 열과 그것을 정화 합니다. 열 중심에 신중 하 게 추가 차입 버퍼 (물)의 25 μ와 혼합 elute
- 5 μ eluted 플라스 미드를 버퍼 [50% 글리세롤 (3 배) 염료를 로드] 로드를 추가 합니다. 1 %agarose 젤에 1로 전체 샘플을 로드 합니다. 30-40 분;에 대 한 실행 시각화 및 (단계 2.1.5) 위에서 설명한 대로 PCR 제품을 삭제할 수 있습니다.
- 다음과 같이 pEGFP C1와 α-MHC 발기인 선: 10 μ 결 찰 반응 상용 결 찰 버퍼, 순화 된 PCR의 2 μ 및 선형화 벡터의 1 μ x 1을 추가. 15 분 동안 50 ° C에서 결 찰을 수행 하 고 얼음에 그것을 냉각.
- 다음과 같이 세균 변환 수행: 구성 요소를 추가 하 여 2.5 μ-퓨전 결 찰 혼합의와 유능한 세포의 50 μ transfect. 나머지는 Eppendorf 관 40 s, 그리고 다음 장소에 대 한 42 ° C 물 욕조에 그것을 넣어 20 분 동안 얼음에 2 분 동안 얼음에 튜브.
- 변환, 다음 SOC 미디어의 350 μ를 추가 하 고 성장 셀 칸 수행 파운드 접시에 파생물 솔루션의 45 분 접시 200 μ에 대 한 37 ° C에서 α-MHC 발기인 결 찰을 포함 하는 저항 하는 칸 셀을 식별 하는 PCR 식민지.
참고: 심사 뇌관 결 찰 교차점에서 PCR 하도록 설계 되었습니다.
- 변환, 다음 SOC 미디어의 350 μ를 추가 하 고 성장 셀 칸 수행 파운드 접시에 파생물 솔루션의 45 분 접시 200 μ에 대 한 37 ° C에서 α-MHC 발기인 결 찰을 포함 하는 저항 하는 칸 셀을 식별 하는 PCR 식민지.
- 파운드-칸 국물 및 제조 업체에 의해 설명 된 대로 표준 소형 예비 플라스 미드 정화 프로토콜을 사용 하 여 정화 하는 플라스 미드 PCR 긍정적인 클론 확장 합니다.
3. 복제 스폰지
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받는 사람 벡터 소화
- Α-MHC-pEGFP 플라스 미드 EcoRI와 KpnI, 복제에 대 한 선형 고 (2.1 단계) 위에서 설명한 대로 젤을 정화 합니다.
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PCR 증폭 하 고 스폰지 DNA를 소화
- PCR를 위한 서식 파일 벡터 운송 미르-181-스폰지와 해당 284-nt-긴 스크램블을 사용 합니다. 앞에서 설명한 PCR 뇌관5를 사용 하 여 스폰지 영역을 증폭. 참고 앞으로 반전 PCR 뇌관 α-MHC-pEGFP-c 1으로 결 찰을 허용 하도록 제한 효소 시퀀스를 포함 합니다. (단계 2.2.2) 위에서 설명한 대로 PCR을 수행 합니다. (2.2.3 단계)를 설명 하 고 소화를 위한 물으로 그들을 eluted 소화 전에 PCR 제품을 정화. 뇌관 시퀀스 참조 표 1.
- 스폰지 DNA 결 찰에 대 한 다이제스트. 50 μ 소화 반응 다이제스트 버퍼, 단계, 3.2.1에서에서 젤 정화 PCR 반응 및 효소 EcoRI와 KpnI의 5 μ x 1을 포함합니다. Microcentrifuge 튜브에 모든 구성 요소를 추가 하 고 부드럽게 그것을 터치 하 여 그들을 믹스. 회전 10 튜브 하단에 반응 수집을 microcentrifuge에 s. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 반응을 품 어.
- 소화 PCR 스펀지 앞에서 설명한 PCR 정리 열을 사용 하 여 (단계 2.2.1) 정화.
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Α-MHC-pEGFP-C1 벡터에 미르-181-스폰지를 선
- 21 μ 결 찰 반응 1 x 결 찰 버퍼가 포함 된 설정의 3 μ 소화 하 고 정화 하는 미르-181-스폰지 PCR, 선형화 α-MHC-pEGFP-C1 벡터의 1 μ, 1 x DNA 버퍼, 그리고 DNA 리가의 1 μ. 5 분 동안 실 온에서 결 찰을 수행 하 고 얼음에 배치.
- 결 찰 혼합의 2 μ와 XL1 블루 유능한 세포의 50 μ를 변환. 사용 하 여 변환 하 고 (단계 2.2.5) 위에서 설명한 대로 프로토콜을 도금. 식민지 올바른 α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 시퀀스를 포함 하는 칸 내성 박테리아를 식별 하는 PCR을 수행 합니다. 디자인에 PCR 뇌관 결 찰 교차점에 걸쳐 상영. 뇌관 순서 표 1 을 참조 하십시오.
- 증폭 하 고 벡터 시퀀스. 파운드-칸 국물 및 표준 소형 예비 플라스 미드 정화 프로토콜을 사용 하 여 정화 하는 플라스 미드 PCR 긍정적인 클론 확장 합니다. 확인 원하는 DNA 시퀀스를 표현 하는 플라스 미드 DNA 시퀀싱을 수행 합니다.
4. 안정적인 H9c2 미르-181-스폰지 표현 세포의 생성
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성장 및 H9c2 세포의 유지 보수
- 문화는 H9c2 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 소 태아 혈 청 (FBS)를 포함 하는 10%의 최종 농도에. 표준 프로토콜을 사용 하 여 셀을 하위 문화 5% 이산화탄소에서 37 ° C에서 그들을 성장 하 고.
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Transfection 그리고 H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge 표현 하는 셀의 선택
- 최상의 결과 대 한 H9c2 셀의 electroporation를 수행 합니다. 출 격 스폰지 (미르-181-스폰지-시퀀스를 대체 하는 284-nt-긴 출 격 순서) 나는 electroporator와 α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 구문 (H9c2) 쥐 myoblasts transfect.
- 간단히, transfect 4 x 10-5 셀 (H2O 5 µ L)에서 플라스 미드 DNA의 2 μ g과 100 µ L electroporation 장치와 호환 되는 솔루션의. H9c2 셀 transfect에 DS-120의 electroporation 프로그램을 사용 합니다.
- 실 온에서 10 분 동안 베트에 transfected 세포를 품 어. 베트에 직접 DMEM의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 6 잘 플레이트의 총 베트 콘텐츠 전송.
- FACs에 의해 48 h 후 transfection 후 GFP 긍정적인 셀을 선택 합니다. 네오 마이 신 (G418)의 6 잘 플레이트에 GFP 표현 셀 접시 (400ng/mL) 완전 한 성장 매체에.
참고: G418 선택 전에 죽이기 커브는 네오 마이 신 선택에 필요한 양을 결정 하 설립 되어야 합니다. H9c2 셀 400 ng/mL G418의 결과 비 플라스 미드의 약 80% 사망률 24 시간 후 H9c2 셀 페 하 고 이러한 셀 G418의 농도 원하는 작업으로 간주 되었다. 셀 라인 성장 G418 16 일 유지 했다 후 안정적으로 간주 되었다. - FACs 정렬 G418 안정적인 셀 스폰지 긍정적인 선택에 대 한 표식으로 GFP의 식을 사용 하 여 수행 합니다. 흐름 정렬 하 여 96 잘 접시의 각 음에 5-10의 세포를 시드하십시오. 몇 구절을 통해 24-잘 접시를 96 잘 접시에서 단일 클로 널 세포를 확장 합니다. 셀의 사용 냉장고 주식 후속 실험에 대 한 시작 점으로 3 (P3) 셀 통로.
- P5 P10 사이 낮은 통로 세포와 모든 세포 라인 기반 실험을 수행 합니다.
- 최상의 결과 대 한 H9c2 셀의 electroporation를 수행 합니다. 출 격 스폰지 (미르-181-스폰지-시퀀스를 대체 하는 284-nt-긴 출 격 순서) 나는 electroporator와 α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 구문 (H9c2) 쥐 myoblasts transfect.
5. 합성 및 스폰지-나노 입자 (미르-181-스폰지 나노 입자)의 정화
- 용 해 하 여 양이온 amphiphile (DOTAP)와 공동 지질, 콜레스테롤 및 DSPE-말뚝-오메, 5:5:0.1 m m 비율에서 각각 클로 프롬 및 유리 유리병에 메탄올의 혼합물에서 자주 나노 입자를 준비 합니다.
- 습기 없는 질소의 부드러운 흐름에 의해 다음 회전 증발 기를 사용 하 여 진공에서 44-45 ° C에서 유기 용 매를 제거 합니다. 8 h에 대 한 높은 진공 아래 지질의 남은 건된 영화를 계속.
- 진공 건조 지질 필름을 5% 포도 당을 추가 하 여 혼합물을 준비 합니다. 영화 화 하기 위한 것이 혼합물 수 있도록 그것을 하룻밤을 둡니다. 소용돌이 45 ° C 물 목욕에는 가끔 떨고와 multilamellar 소포를 생성 하기 위하여 실 온에서 2 ~ 3 분에 대 한 유리병.
- 3-4 분 때까지 선명도 관찰할 수 있다, 100% 듀티 사이클 및 25 W 출력 전력에 얼음 목욕에서 작은 unilamellar 소포 준비 하 multilamellar 소포 sonicate
- 출 격 시퀀스 또는 pEGFP(α-MHC) 벡터와 liposome nanovector4를 1:3 충전 비율 기준으로 복제 미르-181-스폰지 시퀀스를 혼합.
참고: 자주 나노 긍정적으로 위탁 하 고 부정 청구 플라스 미드 DNA의 복잡 한 정전기는 nanovector로 알려져 있다.
6. 조직 배달 스폰지-나노 입자의 생체 내에서 효과의 유효성 검사
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스폰지-나노 쥐에서의 조직 배달
- Sprague-Dawley (SD) 쥐를 사용 합니다. 미르-181-스폰지 nanovector 또는 꼬리 정 맥을 통해 출 격 nanovector 쥐를 정 맥 주사. 몸 무게에 약 200 g SD 남성 쥐를 사용 합니다.
- Nanovector/kg 몸 무게의 4 밀리 그램의 복용량을 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입을 수행 하 고 2 주 동안 6 꼬리 정 맥 주사의 처방을 사용 하 여이 반복 합니다. 반복된 nanovector 배달 다음 벡터 비보의 표현을 위한 1 주 동안 (일 15-21)을 허용 합니다.
- 전에, 하는 동안, 그리고 nanovector 납품 후 GFP 신호를 이미징 하 여 최적화를 확인 합니다. 단층 이미징 소프트웨어를 반 정량적 데이터를 생성 하 여 GFP 신호를 분석 했다.
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미르-181-스폰지에 의해 미르-181 저해 vivo에서 의 유효성 검사
- 서쪽 오 점 기능 미르-181-스폰지 심장 조직에의 식을 보여 주기 위해 수행 합니다.
참고:이 연구를 위해 몬태나 COX1 식 시험 되었다.
- 서쪽 오 점 기능 미르-181-스폰지 심장 조직에의 식을 보여 주기 위해 수행 합니다.
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표현의 vivo에서 미르-181-스폰지에에서 기능적 결과
- 동안 심장 기능과 형태학 상 변화를 분석 하는 nanovector 납품 후 2 차원, M 모드 및 도플러 심장 초음파를 수행 합니다. 설치류 마음에 더 나은 검색 용량 15 MHz 선형 배열 트랜스듀서를 장착 한 초음파 시스템을 사용 합니다.
- 마 취 심장 수축; 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 심장 초음파 과정 의식과 어떤 마 취 시 약 없이 동물 미르-181-스폰지 nanovector 또는 출 격 nanovector의 납품을 수행 합니다. 보십시오 Das, 외 알. 4 더 명확한 설명을 위해입니다.
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Representative Results
안정적으로 transfected pEGFP-미르-181-스폰지-표현 H9c2 세포에서 (4.2 단계)에서 미르-181 가족 전체 (미르 181a, 미르 181b, 미르-181 c, 그리고 미르-181 d)의 표현 알맞게 H9c2 셀 pEGFP 발진 표현에 상대적으로 감소 했다. 그래서 우리가 예상 전체 미르-181 가족의 경쟁적 억제제로 미르-181-스폰지 역할 mt COX1 증가 식은 미르-181 c의 미토 콘 드리 아 유전자를 대상. 서쪽 오 점 데이터 제안 mt COX1 식 pEGFP-미르-181-스폰지-표현 H9c2 셀 pEGFP 출 격 표현 H9c2 세포에 비해 증가 했다. 또한, mt COX2 또는 산 COX3에 대 한 식이 변경 감지 를 통해 immunoblot pEGFP-미르-181-스폰지-표현 H9c2 셀에 있었다. 우리는 α-tubulin immunoblotting 분석에 대 한 정규화 컨트롤로 사용. GFP 신호 주로 관찰 되었다 간 및 신장에까지 미르-스폰지 nanovector (그림 1A)의 2 주 후 조직 배달. 그러나, GFP 식 미르-181-스폰지 nanovector 배달 (그림 1A 및 1B)의 3 주 후 심장 조직에 훨씬 더 높은 했다. 노트, GFP 신호 체계 배달; 후 3 주 일부 동물에서 간 조직에서 발견 했다 그러나, 그 시간 시점에 미르-181-스폰지의 기능 효과 없이 했다.
서쪽 오 점 출 격 nanovector 그룹 (그림 2)에 비해 미르-181-스폰지 nanovector 주입 쥐에 mt COX1 식에 상당한 증가 보였다. 높은 산-COX1 mt COX1 미르-181 c에 대 한 직접적인 대상으로 미르-181-스폰지 nanovector 납품, 3 주 후에 낮은 c 미르-181 식은 건의 한다. 우리는 immunoblots α-tubulin 정규화 컨트롤로 사용.
심장 초음파 검사 전에, 동안, 그리고 동물의 출 격 nanovector 그룹에 비해 치료 처방의 마지막에 미르-181-스폰지 nanovector 주입 쥐의 심장 기능에 변화를 보였다.
그림 1. Vivo에서 미르-181-스폰지의 nanovector 납품의 분석. (A)이이 패널 꼬리 정 맥을 통해 6 정 맥 주사와 최적화 된 3 주 치료 프로토콜을 보여 줍니다. Epifluorescence 이미지에 노란색 색 pEGFP 벡터의 식을 보여 줍니다. 노란 색의 최대 농도 3 시간 포인트 주에 관찰 된다. (B) α-MHC 발기인 순서 pEGFP 벡터에는 선택적으로 하루 21에 미르-181-스폰지 또는 중심부에 뒤 섞이는 순서 표현 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 미르-181 c 식에 미르-181-스폰지 nanovector의 효과의 유효성 검사. 이것은 pEGFP-출 격 및 pEGFP-미르-181-스폰지 nanovector 주입 쥐에서 얻은 심장 lysates의 mt COX1 식의 서쪽 오 점 분석. 전체 심장 homogenates 표시 된 항 체와 함께 조사 했다. 우리는 로드 제어로 α-tubulin 사용. 밴드-densitometry 막대 그래프 아래에 표시 됩니다. 학생의 t-테스트를 수행 하 고 표준 오차 막대 그래프에 오차 막대로 표시 했다. p < 0.05 대 pEGFP-출 격 그룹. n = 4.
| 뇌관 이름 | 시퀀스 | TM | 노트 | 사용 | 대상 | |
| SAM3-1 층 | ATGCATTAGTTATTAATGCTT GACACACTTGACAATTTCT |
58.4 | 쥐 MHC 발기인 EGFP으로 복제 | PCR | MHC 발기인 | |
| SAM3-2R | GACCGGTAGCGCTAGCTG ACTCACTGGGAGATTGCTT |
59.8 | 쥐 MHC 발기인 EGFP으로 복제 | PCR | MHC 발기인 | |
| SAM3-3 층 | CGAACGACCTACACCGAACT | 64 | 화면 EGFP-F | 식민지 PCR | 긍정적인 발기인 클론 | |
| SAM3 4R | CGCTAGTCCTTGACCCTCTG | 63.9 | 화면 MHC-R | 식민지 PCR | 긍정적인 발기인 클론 | |
| SAM5-1 층 | CCTGTCTCCAACACACAAGC | 59.3 | 시퀀스 MHC 발기인 | 시퀀싱 | MHC 발기인 | |
| SAM5-2 라운드 | CAGACTGCAGGGCTGGTT | 60 | 시퀀스 MHC 발기인 | 시퀀싱 | MHC 발기인 | |
표 1입니다. 뇌관 시퀀스입니다.
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Discussion
이 문서 설계 및 합성 미르-스폰지의 설명 하 고 어떻게 조직 전용 스폰지의 식이 조직 관련 미르 가족 식 억제 하는 강력한 도구 설명.
우리 심장 전용 모터와 스폰지를 대상으로 하는 미르-181 가족 식 플라스 미드로 복제 될 수 있습니다 설명 했다. 플라스 미드를 효율적으로 전달에 대 한 nanovector 입자에 포장 될 수 있다 생체 외에서 그리고 vivo에서 각각 electroporation 또는 꼬리 정 맥 주사를 사용 하 여 (그림 1). 미르-181 스폰지와 미르-181 가족의 심장 관련 표현 억제 수 미르-181 대상 유전자 (그림 2)의 표현에 영향을 미칠 수 있습니다. 플라스 미드에 GFP는 이점이 있는 동물을 희생 하지 않고 배달 하 고는 nanovector의 식 프로필을 시각화 수 있습니다.
간단히, 미르-스폰지 미르 센스 시퀀스 미끼 미르 역할 mRNA 대상 취재 원 유전자 후의 일련의 구성 됩니다. 자연스럽 게 발생 미르-스폰지 endogenously 오래 비 코딩 RNAs (lncRNAs)17식물 및 동물 세포에 표현 될 발견 되었습니다. 현재 연구에서 우리에 전체 미르-181 가족을 억제 하기 위해 스폰지 접근을 활용 했습니다. 미르-181-스폰지 방식은 downregulate 경작된 한 세포에 미르-181 가족을 생리 적으로 관련 된 방법, vivo에서 신청서 미르-181-스폰지의 해로운 될 수 있습니다. 예를 들어 여러 연구 181a 미르와 미르-181b 다른 세포/조직 유형18,,1920에서 보호 역할을 증명 하고있다. 따라서, 미르-181-스펀지 식 심장 조직에 구체적으로 타겟팅 한다.
작은 oligonucleotides 성숙한 미르 가이드 물가에 어 닐 링을 통해 미르 함수 차단 입증 되었습니다 하 고 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 적절 한 로드를 방지 합니다. 이 이렇게 연관 문제 oligonucleotides saturating 성숙 miRNAs의 세포 풀을 차단 하는 충분 한 복용량에서 배달 될 것 이다. Oligonucleotides 또한 세포 막과 분자의 일반적인 안정성에 걸쳐 전송 관련 된 문제에서 고통. Ingeniously, 그것 보였다 것 제공된 미르 대상의 동족 미르21미끼로 작동할 수 있다. 의사 3' UTR에 곁에 함께 하는 여러 바인딩 사이트 덕택으로 구성, 미끼 대상, 또는 미르-스폰지, 안정적으로 그 대상 miRNAs와 상호 작용 하 고 격리는 미르 microribonucleoprotein 복합물 (miRNPs)에 따라서 효과적으로 수 miRNA 기능을 방지합니다. 소위 "미르-스폰지"는 효과적인 반대로 감각 기술, 효율적으로 downregulate 미르 수 있는 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 따라서, miRNA 스폰지의 응용 프로그램 미르 기능 손실 고기 공부 하 사용할 수 있습니다.
RNA 간섭 (RNAi) 치료제의 새로운 클래스를 이어질 수 있는 개념의 발견 직후 많은 수 사관 들의 주의 끌었다. 적용 된 RNAi 치료제 분야는 머리 맡에 실험실에서 매우 신속 하 게 이동 했다. 현재, 미르 치료제 종양에서 빠르게 성장 하는 치료 내정간섭의 하나 이며 1 임상 시험 단계에서 현재 이다. 센스 oligonucleotides, 또는 antagomirs, 가장 널리 사용 되 미르 억제 방법 중 하나입니다. 엄마 외. 22 사용 미르-10b antagomir, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서, upregulated 미르-10b 단단한 종양에 침묵 하.
Vivo에서, 개선 바인딩 선호도, biostability, 그리고 pharmacokinetic 속성 antagomirs의 화학 수정이 필요 upregulated miRNAs의 효율적인 입을 합니다. 용융 온도 (Tm) 이중 증가 개선 하 antagomirs의 nuclease 저항, 화학 수정 수행할 수 있습니다, 2 '-O-메 틸 (2 '-O-나), 2 '-O-methoxyethyl (2 모) 2 '-플 루 오로, bicyclic 잠겨 핵 산 (등 LNA)23,,2425,26,27,28,29,30,31. Vivo에서 배달의 더 나은 효율성을 위해 antagomir는 nuclease 저항28증가 phosphorothioate (PS) 연계 하 여 수정할 수 있습니다. 또한, PS 백본 수정 또한 오 줌의 배설을 감소 하는 플라스마 단백질에 바인딩을 강화. 따라서, PS 수정 antagomirs 그들의 조직의 배달32촉진 pharmacokinetic 속성의 상당한 개선을 보여줍니다. 그것은 또한 표시 되었습니다 펩 티 드 핵 산 (PNA) 또는 morpholino 올리고, 특정 miRNA를 대상으로 설계 된을 사용 하 여 사용할 수 있는 미르 기능 손실 고기33,,3435, 공부 하 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine 활용 및 나노 complexed PNA antagomirs 효율적으로 억제 하는 miRNA 기능 생체 외에서 그리고 vivo에서36,,3738, 39. 최근 진보에도 불구 하 고 미르-파생 상품의 효과적이 고 조직 특정 배달 도전 남아 있다. -대상 효과, 타고 난 면역 반응을 트리거링 및, 가장 중요 한 것은, 취득 대상된 기관/조직 세포에 특정 배달에 대 한 잠재적인 포함 됩니다.
또한, miRNA 식 레벨 셀 크게 따라 하 고 조직40을 입력 합니다. 또한, miRNA 식 증가 수 또는 질병에서 감소. 변경 된 miRNA 표현과 스폰지 억제 miRNA 표정으로 휴대 및 조직 기능에 미치는 영향의 결과 유효성을 실험적으로 결정 해야 합니다. 동물 질병 모델에서 광범위 한 임상 연구는 주어진된 미르 대상에 대 한 억제의 최적의 수준을 결정 필요 합니다.
흥미롭게도, 미르-181 c 미르 subcellular 구획3,,45를 전시 한다. 특히, 예상 했던 대로, 미르 181s는 핵에서 인코딩되고 dicing 기계 장치에 의해 세포질에서 처리 되 고 RISC에 통합 하는 긴-pri-미르 성적표로 복사할. 그러나, 세포질에 있는 정식 miRNAs와 달리 성숙한 형태 미르-181 c의 미토 콘 드리 아 및 미토 콘 드 리아-관련 유전자3의 레 귤 레이 션 기능으로 translocates. 우리는 시연 미르-181-스폰지 세포질 보다에서 성숙한 형태로 미르-181 c를 바인딩할 수 있습니다 전 좌는 미토 콘 드리 아에 방지. 따라서, 산 COX1의 upregulation 미르-181 c 식의 downregulation의 조건 하에서 미토 콘 드리 아에서 관찰할 수 있습니다.
우리 미르-스폰지를 허물고 모든 miRNA의 식 디자인 하는 데 필요한 방법론을 보고 하 고 미르-스폰지의 비보에 응용 프로그램에 대 한 프로토콜을 설명. 조직 관련 미르 억제 miRNA 필드에 아래 기술 현재입니다. Downregulation의 중요성 또는 인간의 질병에 upregulated miRNAs의 기능 억제 miRNA 생물학 치료 적 개입에 대 한 악용 가능한 수 있습니다 제안 합니다.
이 연구는 조직 특정 방법 vivo에서 성공적으로 채택 될 수 있다는 미르를 낮추기를 위한 전략을 강조 했다. 미르-스폰지 미르 "씨앗" 시퀀스의 센스 시퀀스를 사용합니다. 따라서, miRNA 스폰지 downregulate 수 모두 동일을 공유 하는 miRNAs의 "씨앗" 순서, 즉, 전체 미르 가족. 이 연구에서 우리는 미르-181-스폰지, 식 (미르 181a, 미르 181b, 미르-181 c, 그리고 미르-181 d) 전체 미르-181 가족의 중요 한 downregulation 관찰 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 만약 한 가족 구성원이 다른 가족 구성원은 동일한 기관에서 해로운 효과 보호를 수 여, 미르-스폰지 기술을 사용 하 여 이상적인 접근 않을 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 학과의 생화학 및 분자 생물학의 안토니 K. L. 렁 감사, 블룸버그 공중 보건의, 존스 홉킨스 대학 그의 기술에 대 한 미르-181-스폰지 구조 설계 도움. 우리는 또한 한국 Sysa-샤와 부의 분자와 비교 Pathobiology, 미르-스폰지 배달의 vivo에서 화상 진 찰에 의해 그들의 기술 지원에 대 한 존스 홉킨스 의료 기관의 캐슬 린 Gabrielson 감사합니다.
이 작품은 NIH, (찰스 스 틴 버 켄)를 HL39752에서에서 교부 금에 의해 그리고 과학자 개발에서에서 교부 금 미국 심장 협회 14SDG18890049 (Samarjit Das)에 의해 지원 되었다. 쥐 심장 관련 발기인 아낌없이 제프리 D. Molkentin 신시내티 아동 병원에 의해 제공 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
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