Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

En Pipette-spissen basert metode for Seeding celler til dråpe Microfluidic plattformer

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/57848
Automatic Translation
*1, *1, *2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll for såing knappe populasjon av celler med pipette-tips for slippverktøy microfluidic enheter for å gi høyere innkapsling effektiviteten av celler i dråper.

Abstract

Blant ulike microfluidic plattform design brukte for mobilnettet analyse, gir slippverktøy-microfluidics et kraftig verktøy for å isolere og analysere celler på encellede nivå ved å fjerne påvirkning av eksterne faktorer på mobilnettet microenvironment. Innkapsling av celler i dråper er diktert av Poisson-fordelingen som en funksjon av antall celler i hver dråpe og gjennomsnittlig antall celler per antall slippverktøy. Primær celler, spesielt immunceller eller klinisk prøver kan bli knappe og tap-mindre innkapsling av celler fortsatt utfordrende. I dette papiret presenterer vi en ny metode som bruker pipette-tips for å belaste cellene slippverktøy-baserte microfluidic enheter uten betydelige tap av celler. Med ulike celletyper viser vi effektiv celle innkapsling i dråper som stemmer til innkapsling effektivitet spådd av Poisson-fordelingen. Vår metode sikrer tap-mindre lasting av celler til microfluidic plattformer, og kan lett tilpasses for nedstrøms enkelt celle analyse, f.eks dekode mobilnettet interaksjoner mellom ulike celletyper.

Introduction

De siste årene, bruk av microfluidics som en robust og allsidig plattform for mobilnettet analyse på enkeltcelle nivå har raskt økt1. Disse plattformene gir høy gjennomstrømming screening av enkeltceller og biologiske molekyler med høy presisjon og følsomhet bruker veldig lite utvalg volum2,3,4. Blant forskjellige typer microfluidic design aktiverer slippverktøy-baserte plattformer høy gjennomstrømming analyse av enkeltceller ved å isolere dem i en vandige fasen slippverktøy omgitt av en ikke blandbar fase som gir presis og nøyaktig kontroll over mobilnettet microenvironment5,6. Slippverktøy-baserte microfluidics gir fleksibilitet til å isolere én eller flere celler i, både vandige og hydrogel dråper og er verdifull i utprøvende komplekse mobilnettet opptreden, som protein sekresjon eller cellular interaksjoner7, 8 , 9. signal- og kryss-snakk blant immunceller kan være påvirket av interaksjon med andre celler i microenvironment10. Isolering av enkeltceller i dråper gir en effektiv støyfri analyselaboratorium, uten påvirkning av miljøfaktorer for mer effektiv og nøyaktig resultater11,12. Endre utformingen av en dråpe-microfluidic plattform med flere viker lar innkapsling av flere celletyper å studere mobilnettet interaksjoner via cellen-sammenkobling12,13.

Prosessen med innkapsling av celler i dråper er tilfeldig og frekvensen av innkapsling av celler kan være statistisk bestemmes ved hjelp av formelen for Poisson-fordelingen14,15. Denne innkapsling kan anslås ved å vurdere gjennomsnittlig rente på ankomsten av celler i slippverktøy krysset og forutsatt at ankomsten av hver celle er uavhengig av andre celler16. Selv om uavhengige celle ankomst ikke kan garanteres, i tilfeller av tynt distribuert celler forutsetning av uavhengighet kan betraktes og sannsynligheten for et slippverktøy som inneholder én eller flere celler kan forutses som en funksjon av antall celler i hver dråpe og gjennomsnittlig antall celler per slippverktøy16,17. Siden denne estimering av mobilnettet innkapsling i dråper er avhengig av antall celler i hver dråpe, kan en foreslå at øker konsentrasjonen av cellene på innløpet øker gjennomsnittlig antall celler i hver dråpe 16. derfor for å sikre én celle innkapsling, celle konsentrasjonen må reduseres men dette ofte fører til et stort antall tomme dråper18.

Tap av celler under lasting av enten vedlegg, sedimentering, og/eller klumper i sprøyten, rør eller produksjon enhet er en vanlig ulempe ansvarlig for avvik av faktiske innkapsling verdier fra spådd innkapsling verdier19 . Dette problemet blir ytterligere overdrevet når seeding sjeldne immunceller eller klinisk eksemplarer som de er allerede mangelvare i befolkningen og innkapsling av bare noen celler, mye lavere enn forventet, inneholder ikke nok data for eksperimentanalyse. Presenterer antigener dendrittiske celler (PDC) er sjelden delsett av immunceller som bare utgjør ca 0.2 - 0,6 prosent av hele hvit blod celle befolkningen20. Disse cellene skille ut enorme mengder type I interferoner ved aktivering og dermed spille en avgjørende rolle i immunreaksjoner21. Når studere mobilnettet atferden til slike sjeldne celler i dråper, er det viktig å hindre tap av cellen under cellen såing og innkapsling22. Det er flere design relaterte utviklingen som har sikret innkapsling av enkeltceller i dråper med aktive innkapsling metoder som bruker ulike fysiske krefter som akustisk eller elektrisk styrker for generering av dråpestørrelse inneholder Single-celler23,24. Men har disse metodene sine egne begrensninger i slippverktøy produksjon16.

I denne studien etablert vi en robust og enkel metode som omgår manglene ved tradisjonelle metoder for å laste inn én eller flere celler til microfluidic enheter. Vår metode, inspirert av Rho et al., utnytter forskjellig størrelse pipette-spisser for såing små mengder sjeldne immunceller dråpe microfluidic plattformer uten signifikant utvalg tap og gitt resultater som er sammenhengende med teoretisk spådommer25. Denne metodikken lett og vellykket for flere programmer med slippverktøy-basert microfluidics og gjeldt for en rekke celletyper eller selv microparticles.

Protocol

1. 3-vik Polydimethylsiloxane (PDMS) apparat fabrikasjon

  1. Måler 40 g PDMS base i en condition blandebatteri kopp og legge 4 g PDMS herding agent til base reagensen i cup, nøye, bruker en dropper.
  2. Plasser koppen i innehaveren av condition blandebatteri og måle den totale vekten av koppen med innehaveren. Angi denne verdien av sentrifuger balanse vekten på condition mikseren.
  3. Bland base og herding agent i condition mikseren på 2000 rpm i 2 minutter etterfulgt av de fråde rundt 2000 rpm i 2 minutter.
  4. Forberede en aluminium båt, med en diameter omtrent samme størrelse som en 100 mm silisium wafer. Plasser silisium kjeks, fremstille for replikaen molding prosessen, i aluminium båt og sette dette oppsettet i en Petriskål (diameter = 120 mm, høyde = 20 mm).
    Merk: Størrelsen på Petriskål avhenger av størrelsen på silisium kjeks.
  5. Fjern koppen fra abonnenten og hell pre herdet PDMS blandingen (innholdet i koppen), nøye, på silisium kjeks.
  6. Plass Petriskål, som inneholder silikon kjeks med pre herdet PDMS blandingen, i en desiccator i ca 20 min å fjerne alle luftbobler.
  7. Fjerne Petriskål etter 20 min og sjekk for eventuelle gjenværende luftbobler som kan fjernes.
  8. Plass Petriskål i ovnen, satt til 65 ° C, i minst 3 timer.
  9. Fjerne Petriskål fra ovnen etter 3t og nøye skrelle den herdet PDMS fra silicon kjeks.
  10. Skjær PDMS enheter langs kuttet linjene, med en kniv eller en skalpell. Hull på inn- og utløp for hver enhet bruker en 1,2 mm puncher. Rengjør hver PDMS enhet med teip til å fjerne alle støv eller gjenværende deler av PDMS.
    1. Eventuelt slag med nitrogen fjerne gjenværende PDMS stykker.
  11. Klargjør glass lysbilder ved å rense dem med såpevann, etterfulgt av isopropanol og tørr med nitrogen.
  12. Bånd en ren PDMS enhet med et rent glass lysbilde i en plasma asher lukke flyt linjene. Bruk følgende innstillinger: strøm: 50 W, tid: 45 s, utfallende tidsforsinkelsen: 2 s, prosessen gass: gass 1 (luft), Vent: begge ventiler, begrenset vent tid: 60 s, pumpe Nedspinning tid: 10 s, Vent hold tid: 0 s, gass utkobling tid: 1 s, Turbo pumping aktivert : 0. Koble fra alle andre gass-linjene.
    Merk: Innstillingene som brukes for plasma asher kan variere avhengig av merke plasma asher brukes.
  13. Forberede silane løsningen ved å legge til 50 µL av silane (1H 1H 2H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) å 950 µL av fluorholdige olje.
    Merk: Silane er giftige. Vennligst Operer under avtrekksvifte.
  14. Tegne forberedt silane løsningen i en sprøyte, som er koblet til en Teflon rør.
  15. Salinize enheten ved flushing forberedt silane løsningen gjennom utløpet av enheten.
  16. Plass enheten i ovnen, satt til 65 ° C, i 30 min.
  17. Fjerne salinized enheten fra ovnen og flush overskytende silane ut av enheten med fluorholdige olje.
  18. Plass enheten i en ovn, satt til 65 ° C, minst 1 time å fullføre bånd.
    Merk: Protokollen kan pauses her.

2. tap-mindre celle innkapsling

  1. Cellen høsting
    1. Nytt suspendere Jurkat T celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium i konsentrasjoner av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, 4.0x106 celler/mL og 8.0x106 celler/mL; PDC i blodkreft serum-fri kultur medier (f.eks X-VIVO 15) i konsentrasjoner av 1.3x106 celler/mL, 3.0x106 celler/mL og 13.0x106 celler/mL; A549 celler i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) i en konsentrasjon av 1.0x106 celler/mL.
      Merk: Celler og konsentrasjonen av celler kan variere avhengig av eksperimentet. Merking av celler kan også gjøres basert på eksperimentet.
  2. Tips-lasting for vandige slippverktøy generasjon
    1. Forberede fluorholdige olje med 3% biokompatible surfactant blanding ved å legge til 3 mL surfactant 2 mL av fluorholdige olje.
      Merk: Konsentrasjonen av surfactant tilsettes oljen fluorholdige bestemmer stabiliteten i emulsjonen for ulike inkubasjon perioder. Konsentrasjonen av surfactant varierer avhengig av medier som brukes til spesifikke celletyper.
    2. Trekke olje fasen blandingen i en sprøyte (1 mL). Fjerne luftbobler i sprøyta, og koble den til en Teflon rør av passende lengde.
    3. Forbered en prøve sprøyte ved tegning biokompatible mineralolje i en sprøyte. Fjerne luftbobler og koble sprøyten til en Teflon rør av passende lengde.
    4. Slå en PDMS plugg med en diameter på 5 mm fra en herdet PDMS skive.
      Merk: Herdet PDMS skive kan tilberedes ved hjelp av trinn 1.1 til 1,9. Bruke en vanlig silisium wafer istedenfor en fabrikkert silisium wafer.
    5. Slå et hull i midten av pluggen med en 1 mm puncher.
    6. Sett inn i en 200 µL pipette tips, fra større slutten, slik at den passer tett.
      Merk: Bruk en 1000 µL pipette tips for større utvalg volum og større celler. For 1000 µL pipette tips, kan pluggene til diameteren varierer mellom 5 mm og 7 mm brukes. Med en plugg av diameter 5 mm, et eksempel volum på rundt 400 µL kan være aspirated i pipette spissen. Hvis en plugg av større diameter er brukt (7 mm), kan mer utvalg volum være aspirated (rundt 900 µL).
    7. Sett slangen, som er koblet til sprøyten, PDMS plugg, som er satt inn i pipette spissen. Skyv sprøytestempelet sakte å fylle tilkoblede pipette spissen med mineralolje. Skyv ut all gjenværende luften fra pipette spissen.
    8. Senk pipette spissen, koblet til sprøyten, i prøve løsningen og Sug opp ca 150 µL av prøve i spissen.
    9. Gjenta 2.2.4 å 2.2.8 å forberede andre eksempel sprøyte.
    10. Forsiktig plassere alle tre forberedt sprøyter på sprøytepumpen.
    11. Sett inn begge pipette tips, inneholder utvalget, i de to indre sundene på PDMS chip. Sett røret som inneholder olje fasen blandingen i ytre innløpet.
    12. Angi verdien i flow priser på sprøytepumpen som følger: kontinuerlig fase løsning: 600 µL/t, celle eksempler: 100 µL/t, hver. Angi og angi målene for sprøyten.
      Merk: Diameter innstillinger vil variere basert på sprøytemerket.
    13. Starte pumpen for å spyle eksempel løsning gjennom indre kanaler av enheten og olje fasen gjennom ytre kanalen av enheten.
    14. Koble en slange av passende lengde til utsalgsstedet for å begynne å samle dråpene når dråpe dannelsen er stabil. Anvist varierer basert på eksperimentet.
    15. Samle dråper i et lås rør. Legg til 200 µL av RPMI medium (uten serum) på de innsamlede dråpene og ruge prøven.
      Merk: Inkubasjon tiden av samlet dråpene varierer basert på eksperimentet. Dråper er samlet i en lås rør når flyt cytometri-basert analyse eller isolasjon utføres etter henting cellene fra dråper ved å bryte emulsjonen. Det er mulig å samle dråper i et glass kammer hvis eksperimentet krever i slippverktøy microscopic analyse.
  3. Emulsjon bryte og celle henting for flyt cytometric analyse
    1. Forberede 20% 1H, 1H 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol (PFO) løsning (v/v) i fluorholdige olje ved å legge 2 mL PFO i 10 mL flourinated olje.
    2. Fjern overflødig olje fra bunnen av samlingen røret, som inneholder dråper, bruker en sprøyte.
    3. Legge til 100 µL av 20% PFO løsning emulsjonen å bryte emulsjonen og slipp innkapslede cellene i den vandige fasen. Trykk og bland kort. Gjør ikke vortex på dette punktet. Inkuber i 1-2 min.
      Merk: Mengden av PFO lagt, avhenger av antall dråper produsert. Holde legge til flere PFO før olje laget er fullstendig oppløst. Vær oppmerksom at PFO er giftig for cellene og at for høy PFO konsentrasjoner eller lenge inkubasjon i PFO kan føre til økt celledød.
    4. Spin løsningen kort tid på den laveste mulig rcf for 30 s.
    5. Forberede 100 mL kaldt Phosphate-Buffered saltvann (PBS) løsning med 2% fosterets kalv Serum (FCS) (2 mL av FCS i 98 mL PBS).
    6. Pipetter 550 µL av vandig brøkdel, umiddelbart etter sentrifugering og overføre den til en ny lås rør som inneholder 500 µL av kaldt PBS løsning med 2% FCS, som utarbeidet i trinn 2.3.5. La alle gjenværende olje synke å bunnen av det nye lås røret.
    7. Sug opp 950 µL av vandige fasen som inneholder cellene fra denne lås tube, nøye, uten aspirating alle gjenværende olje og overføre løsningen til en ny lås-tube.
    8. Nedspinning cellene i det nye lås røret i 10 min.
    9. Nytt suspendere cellene i 300 µL av kaldt PBS løsning med 2% FCS, som utarbeidet i trinn 2.3.5.
      Merk: Cellene kan også re suspendert i noen annen egnet løsning som media avhengig av eksperimentet. Stain cellene, basert på eksperimentet for analyse ved hjelp av flowcytometri.

3. celle sammenkobling

  1. Cellen høsting og flekker
    1. Telle Jurkat T celler, fra kultur kolbe, og Nedspinning cellene på 1500 rpm for 5 min.
    2. Fjern nedbryting og å suspendere 1.0x106 celler i 1 mL PBS å få en konsentrasjon av 1.0x106 celler/mL. Mengden PBS lagt avhenger av celletall.
    3. Gjenta 3.1.1 til 3.1.2 å forberede en andre eksemplar av Jurkat T-celler med samme celle konsentrasjonen.
    4. Vask begge prøver to ganger med 1 mL av PBS på 1500 rpm for 5 min.
    5. Nytt suspendere en celle utvalg med 1,25 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) fargestoff og andre cellen prøven med 1,25 µM langt rød farge eller 1,25 µM celle spredning fargestoff i en celle konsentrasjon av 1.0x106 celler/mL. Farging løsning koster 1 mL for 1.0x106 celler.
      Merk: Celler kan merkes med forskjellige fargestoffer avhengig av hvilke filtre som er tilgjengelige i flyt-cytometer eller fluorescens mikroskopet.
    6. Inkuber celle prøvene med fargestoffer i 10 min på 37 ° C.
    7. Stoppe flekker reaksjonen ved å legge til 1 mL av is kaldt FCS etter 10 min.
    8. Vask celle prøvene to ganger med 1 mL av PBS på 1500 rpm for 5 min.
    9. Nytt avbryte celle prøvene RPMI media i en konsentrasjon av 10.0x106 celler/mL, for hver farge.
  2. Tips-lasting for produksjon av agarose hydrogel dråper for cellen sammenkobling
    Merk: For celle sammenkobling med agarose hydrogel slippverktøy, opprettholde temperaturen i systemet mellom 27 ° C og 37 ° C hele slippverktøy generasjon og samling prosessen å forebygge gelling av hydrogels og garanterer mobilnettet levedyktighet9.
    1. Oppløse Ultra-Low gelling temperatur agarose av varme den opp til 75 ° C i PBS i en konsentrasjon av 4% (w/v) og rør blandingen for 20 min.
    2. Bland agarose løsningen med merket Jurkat T celler for å gi en agarose konsentrasjon på 2% (w/v). Gjenta dette for andre prøven med annerledes merket celler.
    3. Forberede fluorholdige olje med 2% surfactant blanding ved å legge til 20 mL surfactant 30 mL av fluorholdige olje (olje fasen blanding).
    4. Fremgangsmåten 2.2.2 - 2.2.14.
      Merk: På grunn av flytende natur lavt Smeltepunkt agarose og å sikre stabil slippverktøy produksjon, angi verdien for flyt priser på sprøyten pumper som følger: olje fasen blanding: 2000 µL/t, celle eksempler: 200 µL/h. inn og sette størrelsen på sprøyten.
    5. Samle dråper i et lås rør og ruge dråpene på 4 ° C for 60 min.
  3. Emulsjon bryte og agarose perle henting for FACS analyse
    1. Etter inkubasjon av dråper for 60 min, fjerne overflødig olje fra lås røret, som inneholder dråper, bruker en sprøyte.
    2. Legge til 200 µL av PFO fjerne olje interphase fra dråpene.
      Merk: Mengden av PFO lagt til røret, avhenger av antall dråper produsert. Holde legge til flere PFO før olje laget er fullstendig oppløst.
    3. Vask samlet agarose perler to ganger med 1 mL kaldt PBS å fjerne olje helt med sentrifugering 1500 RPM for 10 min.
    4. Analysere samlet agarose perler ved hjelp av flowcytometri.
      Merk: Det er også mulig å observere perlene under fluorescens mikroskop.

Representative Results

For våre eksperimenter brukte vi en 3-vik PDMS basert microfluidic enhet med høyden på 25 mikrometer (figur 1). I denne Enhetsinnstillinger brukte vi ytre innløpet for rødme olje med surfactant og de to indre viker for spyling vandig faser med cellen suspensjoner eller media. Etter generasjon og samling, er dråpene ruges i et par timer av chip før nedstrøms bruker flow cytometri. Under inkubasjonstiden, kan serum komponenter i media samhandle med surfactant og føre til dråper ustabil og oppløsning. Det er derfor viktig å legge til en optimal konsentrasjon av surfactant fluorholdige olje. Vi testet stabiliteten i monodispersed dråpestørrelse inneholder blodkreft serum-fri kultur medier med 2% humant serum med ulike konsentrasjoner av surfactant i fluorholdige olje. Det kan konkluderes fra figur 2 som disse monodispersed dråper er svært stabile i opptil 24 timer når minst 3% surfactant er lagt til olje fase. Lignende resultater ble oppnådd med RPMI media med og uten tilsetning av 10% FCS (data ikke vist). Derfor er slippverktøy stabilitet svært avhengig av optimal surfactant konsentrasjoner når du arbeider med ulike kilder for kultur medier og serum komponenter.

For å demonstrere innkapsling effektiviteten i vår tilnærming seeded vi først cellene med rør koblet til sprøyter, som er den mest vanlige tilnærmingen for såing celler (Figur 3A). Vi høstet Jurkat T celler i ulike konsentrasjoner av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL og 4.0x106 celler/mL og fikk en innkapsling effektivitet som var lavere enn normalverdiene (Figur 3B). 1.0x106 celler/mL var brøkdel av dråper som inneholdt en enkeltcelle 2,5%, noe som ikke økte selv ved hjelp av høyere celle konsentrasjoner. For å effektivisere celle-lasting, vi endret vår forrige tilnærming og montert slangen på halv lengde til en forhøyet stativ og lastet celle suspensjon i halvår som var festet til PDMS enheten (Figur 4A). Bruker denne tilnærmingen, innkapslet vi Jurkat T celler i ulike konsentrasjoner av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, og 4.0x106 celler/mL, samt sjeldne PDC i ulike konsentrasjoner av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, og 12.0x106 celler/mL. Vi ventet bedre innkapsling priser forhindrer cellen sedimentering med denne metoden. Men i alle konsentrasjoner testet var de eksperimentelle resultatene mye lavere at den anslåtte Poisson verdier (Figur 4B og Figur 4C).

Med vårt tips-lasting tilnærming vi optimalisert vår celle innkapsling priser for å få eksperimentelle resultater sammenhengende med statistisk normalverdiene (figur 5et). For ulike konsentrasjoner av Jurkat T-celler matchet innhentet innkapsling effektiviteten våre beregnede verdier i alle konsentrasjoner (figur 5B). Bemerkelsesverdig, selv med tilhenger celler som A549 tumorceller, som har en tendens til å klynge, observerte vi en litt bedre innkapsling effektivitet i en mobilnettet konsentrasjon av 1.0x106 celler/mL (figur 5C). Vi har også vurdert effekten av systemet vårt å kapsle mindre tilgjengelig og knappe PDC i ulike celle konsentrasjoner av 1.0x106 celler/mL, 3.0x106 celler/mL og 13.0x106 celler/mL (figur 5D). For å lette lasting av muligens større volumer over 200 µL, f.eksnår du arbeider med linjer eller mer rikelig primære immunceller, vi også undersøkt celle innkapsling effektiviteten ved hjelp av 1000 µL tips (blå). Vi viste at tipsene for 1000 µL ga en lignende innkapsling effektivitet i forhold til 200 µL tips (gul) (figur 5E).

Avhengig av chip design og forskning spørsmålet for hånden, vårt tips lasting teknikken kan brukes til å laste cellene til en vik, for sondering i mobilnettet heterogenitet, eller flere viker parallelt for dekoding mobilnettet interaksjoner. Vi sammenlignet lasting av Jurkat T-celler (i en konsentrasjon av 10.0x106 celler/mL) fra en vik på to annerledes merket bestander av Jurkat T-celler (i en kombinert konsentrasjon av 10,0 x106 celler/mL) fra to innganger (figur 6 A og figur 6B). Under innkapsling, ble dråpene generert ved hjelp av ultra-lav gelling temperatur agarose og gelled etter produksjon til skjemaet agarose hydrogel perler som tillot påfølgende nedstrøms analyse via mikroskopi og flyt cytometri (figur 6 C og figur 6D). Mikroskopisk analyse viste at cellen sammenkobling ble oppnådd i ulike kombinasjoner som indikerer høy gjennomstrømning cellen sammenkobling (figur 6C). Videre analyse av samme populasjon av hydrogel perler av flowcytometri avdekket at perler uten celler kan skilles fra perler cellene basert på forskjellige Videresend (FSC, størrelse) og sideward (SSC, detaljnivå) XY mønster (figur 6 D). Gating befolkningen av perler uten celler bekreftet mangel på cellen innkapsling av fravær av fluorescerende signaler. I tillegg avslørte gating perle befolkningen med celler eksistensen av flere Sub-populasjoner veiledende for innkapsling av annerledes merket Jurkat T-celler. Våre resultater viser at effektiv celle sammenkobling kan oppnås, basert på både mikroskopiske og flyt cytometric analyse, og viste en økt innkapsling effektivitet sammenlignet Poisson prediksjon (figur 6E).

Figure 1
Figur 1 . PDMS basert dråpe microfluidic enhet med tre innganger og en stikkontakt. Enheten består av tre viker sammenhengende olje fasen og celle kultur medier celle suspensjon, henholdsvis. De genererte dråpene er samlet på utsalgsstedet. Prøvene flyt laminarly flyt-fokus veikrysset der de er innkapslet i dråper. På viker, filter strukturer holder store partikler som protein eller cellen aggregater tilbake. Diameteren på hullene i filter strukturen angis med blå linjer. Diameteren på kanalene ved produksjon munnstykket indikeres av røde linjer. Kanal høyden på hele chip var 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Slippverktøy stabilitet over 24 timer. Grafene viser området av dråpestørrelse inneholder blodkreft serum-fri kultur medier + 2% humant serum, over tid for tre ulike konsentrasjoner av surfactant A) 0,5% B) 3% C) 5%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Rør basert celle lasting tilnærming. Jurkat-T celler lastes i ulike konsentrasjoner til enheten med en sprøyte som er koblet til slange. A) illustrasjonen viser eksperimentelle oppsett B) innkapsling cellefrekvens som * lys. Punkt: eksperimentelt bestemt verdier. Lukket linjer: Poisson-fordelingen. Feilfelt representerer standardfeil betyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Innkapsling ulike celletyper i ulike konsentrasjoner bruker et vertikalt rør lasting tilnærming. Jurkat T celler og PDC (av ulike konsentrasjoner) var innkapslet for å fastslå effektiviteten av cellen innkapsling. A) illustrasjonen viser eksperimentelle oppsettet for loddrett røret lasting tilnærming. B) grafen viser innkapsling effektiviteten i Jurkat T celler. C) grafen viser innkapsling effektiviteten av PDC. Punkt: eksperimentelt bestemt verdier. Lukket linjer: Poisson-fordelingen. Feilfelt representerer standardfeil betyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Tips lasting tilnærming til å kapsle inn ulike celler typer. A) Mactac tips lasting teknikk. B) grafen viser innkapsling effektiviteten av Jurkat celler. C) grafen viser innkapsling effektiviteten av A549 celler. D) grafen viser innkapsling effektiviteten av PDC. E) grafen viser innkapsling effektiviteten i Jurkat T celler med 200 µL pipette tips (gul) og 1000 µL pipette-spisser (blå). Punkt: eksperimentelt bestemt verdier. Lukket linjer: Poisson-fordelingen. Feilfelt representerer standardfeil betyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Celle sammenkobling i dråper. A) Mactac tips lasting tilnærming for sammenkobling forskjellige celler fra 2 innganger i dråper. B) grafen viser innkapsling av Jurkat T celler ved hjelp av en innganger og to innganger i parallell. Cellen konsentrasjonen for ett Tips 2.0x106 celler/mL og celle konsentrasjonen for to tips begge 1.0x106 celler/mL. Punkt: eksperimentelt bestemt verdier. Lukket linjer: Poisson-fordelingen. C) The fluorescens mikroskopiske overlegg hydrogel perler og merket Jurkat T-celler. D) Diagrammet viser flyt cytometric analyse av sammenkoblede celler i agarose hydrogel perler. Plottet viser både fremover scatter og sidelengs scatter. E) sammenligning av cellen tallene i agarose hydrogel perler som oppdages av fluorescens mikroskopi og flyt cytometri. Barer: mener verdi; Værhår: standardfeil mener, n ≥ 4. Feilfelt representerer standardfeil betyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne protokollen, har vi vist en effektiv og enkel teknikk og kapsle celler i dråper for høy gjennomstrømming, én celle analyse og utføre kontrollert celle sammenkobling for mobilnettet samhandling studier. Videre har vi sammenlignet flere konvensjonelle metoder for å laste inn celler til microfluidic enheter og viste at vårt tips lasting tilnærming er en mer effektiv teknikk i forhold til andre metoder.

Studere klinisk prøver eller sjeldne celletyper mangelvare i nummer av droplet-baserte microfluidics har noen iboende utfordringer. Som vi har også vist, pleier celler å sedimenter i sprøyter og overflaten av forbindelsesslangen, dermed hindre mobilnettet innkapsling for å oppfylle normalverdiene. For å unngå dette problemet, bruker enkelte grupper gripende barer i sprøyter. Men når du bruker sjeldne og begrenset celle populasjoner, total-celle volumet er også begrenset, dermed begrense bruk av store sprøyter og stirring barer. Videre vi også erstattet mer brukte rør med Teflon belagt rør for å hindre celle vedlegg, men denne metoden ble ikke bedre resultatene og hvis forbindelsesslangen er for lang, problemet med cellen vedlegg forverrer (data ikke vist). Også brukte vi et vertikalt rør lasting tilnærming der cellene var lastet slangen og ikke i sprøyten for å hindre tap av celler i stor sprøyte volumer. Bruker denne teknikken, lastes celler med lite utvalg volum inn, f.eks PDC som er sjeldne og begrenset. Også lastes eksemplet fra slangen til enheten vertikalt for å hindre celle sedimentering. Rør som brukes for cellen frø er små og kan sammenlignes med microchannels. Flyten slangen er trykket drevet og følger en parabolske hastighet profil26. Dette innebærer at det maksimalt er i midten av slangen og minimum hastighet er kantene av rør27. Når en populasjon av celler gjennom slangen, fører hastighet graderingen til at cellene å bli presset mot kantene hvor de slå seg ned fordi hastigheten på grensen er nær null. Den sedimentering eller oppgjør av celler i forbindelsesslangen, dermed reduserer innkapsling effektiviteten som vist i representant resultatene der eksperimentelle data ikke samsvarte med forventede modellen.

En annen vanlig tilpasset løsning brukes av forskere, arbeider med slippverktøy microfluidics, er å øke tettheten av celle kultur media med tillegg av matchende reagenser som Iodinaxol å hindre celle sedimentering i sprøyter19. Men tetthet matchende reagenser kan påvirke mobilnettet atferd og negativt påvirke cytokin utskillelsen av celler (data ikke vist)28.

Selv om flere små og store endringer i konvensjonelle celle lessing teknikker viste overse forbedringer i innkapsling effektivitet, innhentet eksperimentelle resultatene fortsatt samsvarte ikke med teoretiske beregninger. Men spissen lasting tilnærming kunne vi de overvinne begrensningene til tidligere metoder og innkapsling effektivitet styrt av Poisson statistikk. Denne teknikken er ikke bare fordelaktig for lasting suspensjon celler, men kan også brukes for lasting tilhenger celler, for eksempel primære keratinocytter og A549 til microfluidic-prosessorene. Når du bruker rikt cellelinjer, for eksempel A549, K562, etc., kan større sample volum brukes. Derfor avhengig av prøven, forskjellige størrelser pipette-tips kan også brukes, og denne enkle teknikken kan tilpasses for både encellede innkapsling og flere celle innkapsling.

Mens lav celle konsentrasjon kreves slik innkapsling av enkeltceller i dråper, er høyere celler konsentrasjoner ønsket å øke gjennomsnittlig antall celler innkapslet i hver dråpe for studier knyttet til celle paring. Det finnes flere encellede metoder som er tidligere beskrevet å par immunceller på microfluidic chips eller microfabricated nanowells29,30,31. I dråpe microfluidics tilsier Poisson statistikk at 1:1 celle sammenkobling for to forskjellige celletyper oppnås ved optimal celle konsentrasjoner. Basert på Poisson prediksjon, er det også en sannsynlighet at dråper kan inneholde andre kombinasjoner. Mens 1:1 celle sammenkobling kan være ønskelig å studere mobilnettet samhandlinger på én celle og resulterer i økt mobilnettet forståelse, har flere celle sammenkobling også store fordeler. Det tillater for å forstå innflytelsen av flere celler i én celle type på andre celle type. Kryss-snakk mellom ulike immunceller hjelpe generere en effektiv immunrespons mot flere infeksjoner og patogener og legger også til robusthet våre immunsystem32. Som sådan, kan mobil kommunikasjon bli avhørt med høy presisjon i forskjellige kontekster, f.eks 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, etc. gir økt forståelse om hvordan single eller par celleområde styre induksjon av immunreaksjoner. Dette er spesielt interessant å studere for eksempel kapasiteten til naturlige drepe celler eller cytotoxic T celler for serielt drepe deres respektive målcellene.

Som omtalt, for flere innkapsling av celler i dråper, er høyere celle konsentrasjoner ønsket. Men når lasting celler fra en åpning for cellen innkapsling, høyere konsentrasjoner av celle utvalg kan forårsake celler til samlet på innløpet. Dette resulterer i lavere innkapsling priser og høyere avvik av teoretiske verdier. For å unngå dette problemet, kan cellene lastes fra to separate innganger også. Teoretisk sett, det ville være mulig å utvikle andre microfluidic enheter med flere viker å oppnå enda høyere nivåer av cellen innkapsling der et gjennomsnitt på x antall celler garanteres. I denne studien undersøkt vi innkapsling effektiviteten av Jurkat T-celler når lastet fra en vik og to innganger med samme totale konsentrasjonen og fått lignende innkapsling effektivitet. Denne endringen gjør at forskerne å par forskjellige celletyper på chip.

Mens denne metoden hjelpemidler i lasting celler til microfluidic enheter uten betydelige tap av celler, er det visse forholdsregler som må holdes i bakhodet. Når du fyller sprøyter med mineralolje og aspirating celle eksemplet i pipette-spisser, inkorporering av luftbobler bør unngås og hele systemet skal være luft-fri. Det er også viktig å huske at mineralolje ikke bør blandes med prøven. Pipette-spisser, som inneholder eksempler, skal settes fast i viker på microfluidic enheten, med ytterste forholdsregel å hindre lekkasje og ytterligere innlemmelse av luftbobler. For å oppsummere, er tips-lasting en enkel, men, robust teknikk som gir høy gjennomstrømming analyse av mobilnettet atferd gjennom cellen innkapsling uten betydelige tap av celler på en kostnadseffektiv måte. Når den brukes med optimal eksempel konsentrasjoner på innløpet, denne tilnærmingen av lasting celler med pipette-tips er meget fleksibel og kan tilpasses til ulike celletyper, spesielt for sjeldne primære immunceller, å få høyere innkapsling effektivitet, nær anslått modeller.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Eindhoven University of Technology for sjenerøs støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
  2. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
  3. Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
  4. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  5. Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
  6. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  7. Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
  8. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  9. Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740 (2013).
  10. den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
  11. Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732 (2009).
  12. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  13. Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43 (2013).
  14. Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  15. Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  16. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  17. Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881 (2012).
  18. Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110 (2008).
  19. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  20. Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
  21. Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
  22. Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317 (2018).
  23. Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898 (2008).
  24. Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139 (2007).
  25. Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
  26. Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
  27. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42 (2001).
  28. Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
  29. Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
  30. Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
  31. Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175 (2012).
  32. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).

Tags

Engineering problemet 144 dråper Microfluidics tips lasting Poisson-fordelingen celle innkapsling celle-sammenkobling mobilnettet interaksjoner
En Pipette-spissen basert metode for Seeding celler til dråpe Microfluidic plattformer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F.,… More

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter