Summary
المهم وظيفة خلايا بيتا للتوازن الجلوكوز في الدم، الذي يتم تقييمه في خلية واحدة قرار استخدام مراسل وراثيا مرمزة لتدفق الكالسيوم.
Abstract
خلايا بيتا في البنكرياس الاستجابة لتزايد تركيزات الجلوكوز في الدم بإفراز هرمون الأنسولين. اختلال وظيفي خلايا بيتا يؤدي إلى ارتفاع السكر في الدم وعواقب خطيرة، تهدد الحياة. فهم كيف تعمل خلايا بيتا تحت الظروف الفسيولوجية والعوامل الوراثية والبيئية التي قد يتسبب بها خلل يمكن أن يؤدي إلى أفضل خيارات العلاج لمرضى السكري. القدرة على قياس مستويات الكالسيوم في خلايا بيتا بمثابة مؤشر هام على وظيفة خلايا بيتا، كتدفق أيونات الكالسيوم المشغلات الأنسولين الإفراج. هنا يصف لنا بروتوكول لرصد تدفق الكالسيوم حفزت الجلوكوز في خلايا بيتا الزرد باستخدام GCaMP6s، جهاز استشعار مرمزة وراثيا من الكالسيوم. يسمح الأسلوب رصد ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا مع القرار خلية واحدة في الجزيرات السابقين فيفو الخيالة. الجلوكوز-استجابة خلايا بيتا داخل الجزيرة نفسها يمكن التقاط في وقت واحد تحت تركيزات الجلوكوز مختلفة، مما يوحي بوجود تغاير الوظيفية بين خلايا بيتا الزرد. وعلاوة على ذلك، توفر التقنية عالية الدقة الزماني والمكاني، الذي يكشف عن طبيعة تدفق الكالسيوم عند تنشيط الجلوكوز متذبذبة. لدينا نهج يفتح الأبواب أمام استخدام الزرد كنموذج للتحقيق في مساهمة العوامل الوراثية والبيئية لوظيفة خلايا بيتا والخلل الوظيفي.
Introduction
الحفاظ على السكر في الدم لدينا في نطاق ضيق، في جزء كبير منه بسبب الوظيفة البنكرياس الغدد الصماء. ويقوم دور الغدد الصماء في البنكرياس بجزر لانجرهانز، التي تحتوي على خلايا إفراز الهرمونات. خلايا بيتا إفراز الأنسولين المسؤولة عن الحد من مستويات الجلوكوز في الدم بعد وجبة المحتوية على الكربوهيدرات. يمكن أن يؤدي إفراز الأنسولين غير كاف من خلايا بيتا في داء السكري1، التي تتسم جلوكوز الدم العالي المستمر. نوع 1 ونوع 2 مرض السكري، الذي يصيب حاليا أكثر من 400 مليون شخص في العالم، يؤدي إلى الإصابة بالأمراض والوفيات2. بالتحقيق في العوامل الجزيئية والبيئية التي تسهم في ضعف خلايا بيتا، سوف نفهم أفضل كيف يبدأ مرض السكري من النوع 2 وتقدم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر القدرة على التفريق بين خلايا جذعية بشرية إلى خلايا بيتا الوظيفية في المختبر مصدرا لخلايا بيتا جديداً لعلاجات استبدال الخلية في مرض السكري من النوع 1. وتحقيقا لهذه الغاية، من المهم دراسة وظيفة خلايا بيتا والنضج في الكائنات نموذج الجينية من أجل اكتساب المعرفة اللازمة لجعل خلايا بيتا الوظيفية في طبق.
يمكن رصد وظيفة خلايا بيتا على مستوى الجامعة-جزيرة ليلى بتحديد مقدار المبلغ الإجمالي للأنسولين ويفرز استجابة للتحفيز الجلوكوز. هذا النهج التراكمي الدراسات جزيرة ليلى كمجموعة واحدة من الخلايا دون التفريق بين الخصائص الفردية في خلية. ومع ذلك، كشف تحليل الردود الجلوكوز لخلايا بيتا الفردية تنوع في الخصائص الوظيفية لخلايا بيتا ووجود عدم تجانس3. من الممكن لتقييم وظيفة خلايا بيتا الفردية، لرصد التغييرات داخل الخلايا التي تؤدي إلى إفراز الأنسولين4. يسبق إفراز الأنسولين بإدخال الجلوكوز في خلايا بيتا. يتم استقلاب الجلوكوز الذي يدخل في خلايا بيتا سرعة إلى ATP. أعلى تركيزات ATP داخل الخلايا إنقاص احتمال فتح قنوات أيون البوتاسيوم الحساسة ATP المؤدية إلى خلايا بيتا depolarization. ديبولاريزيشن يفتح قنوات أيون الكالسيوم المراعية للجهد ويزيد الكالسيوم داخل الخلايا. وفي المقابل، مشغلات الكالسيوم الرقابة للأنسولين، الذي صدر في الدورة الدموية، ويخفض مستويات السكر بتشجيع استخدام الغلوكوز5،،من67.
وقد طبقت عدة استراتيجيات للتحقيق في وظيفة خلايا بيتا، بما في ذلك الرصد المحتملة غشاء8، والتصور المباشر للأنسولين-حويصلات الرقابة9، والتحديد الكمي لكاليفورنيا داخل الخلية2 + تدفق كوكيل لاستجابة الجلوكوز10. فيما بينها، يوفر التصوير من كاليفورنيا داخل الخلية2 + استفادة زيادة التحليل إلى خلايا فردية متعددة داخل نفس جزيرة11،12، تسمح بإجراء مقارنة مباشرة للسكر-الاستجابة بين خلايا بيتا الفردية. يمكن رصدها داخل الخلية Ca2 + تركيز استخدام الأصباغ الفلورية المراعية للكالسيوم13 أو المرمزة وراثيا الكالسيوم المؤشرات (جيسيس)14. حيث يمكن التعبير عن الكالسيوم مؤشر الأصباغ الافتقار إلى خلية من نوع خصوصية، جيسيس في نوع خلية معينة من المروجين محددة. بالإضافة إلى ذلك، يوفر الجيل الجديد من جيسيس، مثل GCaMP6، نسبة الإشارة إلى الضوضاء أفضل جنبا إلى جنب مع ديناميات الزمانية أسرع15. هنا يصف لنا الفائدة من أن الجيل الجديد من جيسيس، في GCaMP6s معينة، تصور الكالسيوم في خلايا بيتا في القرار خلية واحدة. نطبق هذا الأسلوب إلى جزيرة الزرد الأولية كنموذج لدينا من خيار. أثناء التطور الجنيني، خلايا بيتا في جزيرة الأساسية تنبع من الظهرية والبنكرياس البطني براعم16. جزيرة الرئيسي يقع في موضع تشريحي نمطية داخل البنكرياس الزرد، يمكن سهولة تحديد وعزل. خلايا بيتا في جزيرة الأولية ضرورية لتنظيم الجلوكوز، على الاجتثاث الوراثية يؤدي إلى ارتفاع السكر في الدم17،18. وعلاوة على ذلك، أصبحت هذه خلايا بيتا المراعية للسكر خلال وقت مبكر الزرد التنمية19. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول للتصوير الجزيرات الثانوية، التي تشكل المراحل الجنينية بعد. يسمح البروتوكول للصورة خلايا بيتا السابقين فيفو، في مراحل لاحقة من التنمية وتركيزات الجلوكوز محددة.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية بموجب "قانون رعاية الحيوان" والحصول على إذن من ساتشسن لانديسديريكشن، ألمانيا (من الألف إلى الياء 24-9168.11-1/2013-14، T12/2016).
1-إعداد
ملاحظة: هذا البروتوكول لتصوير السابقين فيفو من جزيرة الزرد الأولية من مزدوجة تيراغرام المحورة وراثيا (ins:nls-رينيلا-mKO2؛ cryaa:CFP)؛ تيراغرام (ins:GCaMP6s؛ cryaa:mCherry) الزرد 19. في هذا السطر المعدلة وراثيا، محركات المروج الأنسولين (ins) خلايا بيتا تعبيراً محدداً المتسلسلات اثنين: nls-رينيلا-mKO2، الذي يمثل نواة لخلايا بيتا مع أحادي كوسابيرا البرتقالي 2 (mKO2) الأسفار؛ و GCaMP6s15، التي تنبعث الفلورية الخضراء في استجابة لزيادة في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. خلية بيتا حدة التعبير عن GCaMP6s يمكن دراسة الجلوكوز-استجابة خلايا بيتا دون تدخل من الكالسيوم التغيرات في أنواع الخلايا المحيطة.
- إعداد المخزون الفيبرينوجين الطازجة (10 مغ/مل) بتذويب 10 ملغ للأبقار الفيبرينوجين في 1 مل من Ca2 +/Mg2 +-التي تحتوي على حل هانكس "متوازن الملح" (حبس) في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل. الدوامة بشدة حتى يذوب مسحوق الفيبرينوجين تماما. يبقى الحل في درجة حرارة الغرفة لأكثر 15 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ الأسهم في درجة حرارة الغرفة حاء 2 – 3 تجاهل المخزون إذا كان الحل يبدأ بلمرة ويصبح لزج. - إعداد الحل العامل الفيبرينوجين (3.3 ملغ/مل) بإضعاف الأسهم الفيبرينوجين حبس مقدار ثلاثة إضعاف. على سبيل المثال، مزيج من 300 ميليلتر من مخزون الفيبرينوجين في 600 ميليلتر من حبس لإعداد 900 ميليلتر من الفيبرينوجين العامل الحل.
- إعداد ثرومبين الحل (10 U/mL) بتذويب 10 وحدات ثرومبين في 1 مل من حبس أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
ملاحظة: هذا الحل يمكن إعدادها مسبقاً، الكوتيد في 50 ميليلتر أجزاء، ومجمدة عند-20 درجة مئوية. - إعداد 200 ملم د-الجلوكوز الحل بتذويب 1.8 غ د-الجلوكوز في 50 مل الماء. تبقى في 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- إعداد 300 مم حل بوكل بتذويب ز 1.1 من بوكل في 50 مل الماء. تبقى في 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- شراء 35 ملم أطباق الزجاج أسفل القطر لتصاعد في الجزر الصغيرة.
- للتشريح والتركيب من جزيرة ليلى، استخدام مجهر ستيريو مزودة بمصباح الأسفار وتصفية الحمراء المكعب (تريتك: الإثارة: 532 – 554 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات: 570-613 نانومتر؛ أو تكساس الأحمر: الإثارة: 540-580 نانومتر، والانبعاثات: nm 592 – 667).
- لتصوير تدفق الكالسيوم في خلايا بيتا، استخدام مجهر [كنفوكل] مقلوب (زايس LSM 780 أو ما شابه ذلك) مع 20 × (0.8 غ) الهواء الهدف ومزودة بحامل لوحة للاطباق أسفل الزجاج قطرها 35 ملم.
- تعد حلاً 200 مغ/لتر من تريكيني الميثان المشبعة بالفلور أوكتين (MS222) يوثانيزينج في الزرد.
- شراء أطباق بيتري 90 مم لتشريح الزرد.
2. الزرد الابتدائية جزيرة تشريح وتركيب
- Euthanize سمكة استخدام الحضانة المطول في MS222. لهذا، بلطف إزالة الأسماك من خزان الأسماك باستخدام شباك صيد واحتضان ذلك في طبق بتري يحتوي على الحل MS222 حتى يظهر الحيوان أي حركة أوبيركولار (الخياشيم)؛ عادة، هذا يأخذ 5 دقيقة نقل السمك إلى طبق بتري يحتوي على الحل حبس مع Ca2 +/Mg2 +.
-
تحت مجهر ستيريو مزودة بمصباح الأسفار وتصفية الحمراء المكعب، تشريح الجلد الذي يغطي الجانب الأيمن من البطن للحيوان لعزل البنكرياس.
- لهذا، قطع جلد الزرد من الفم إلى الزعنفة الشرجية باستخدام الملقط حادة. قشر بعيداً من قطع الجلد لفضح البطن. هذه القطع تكشف الأجهزة الداخلية. باستخدام ومضان أحمر mKO2 التعبير في خلايا بيتا، التأكد من موقع الجزر بالفحص البصري تحت المجهر. إذا لزم الأمر، قم بإزالة الفصوص في الكبد، كما أنها يمكن أن تغطي هذه الجزيرة الصغيرة، مما يجعل من الصعب العثور على.
ملاحظة: جزيرة الابتدائي يقع قرب منطقة البطن، عادة على الجانب الأيمن الأمامي.
- لهذا، قطع جلد الزرد من الفم إلى الزعنفة الشرجية باستخدام الملقط حادة. قشر بعيداً من قطع الجلد لفضح البطن. هذه القطع تكشف الأجهزة الداخلية. باستخدام ومضان أحمر mKO2 التعبير في خلايا بيتا، التأكد من موقع الجزر بالفحص البصري تحت المجهر. إذا لزم الأمر، قم بإزالة الفصوص في الكبد، كما أنها يمكن أن تغطي هذه الجزيرة الصغيرة، مما يجعل من الصعب العثور على.
- تنظيف جزيرة الأولية عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة مثل الكبد و adipocytes بعناية. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لا لإيذاء أو الوخزة هذه الجزيرة الصغيرة؛ بعد مسح من الأنسجة المحيطة، تصبح الخلايا الفردية على سطح جزيرة ملموس.
- "الماصة؛" قطره 30 ميليلتر من حبس في وسط صحن أسفل الزجاج. نقل جزيرة تشريح لهذا الانخفاض.
- أغسل بعناية جزيرة مرة واحدة مع حبس ومرة مع 30 ميليلتر من الحل العامل الفيبرينوجين (3.3 ملغ/مل). تأكد من تجنب التجفيف من جزيرة ليلى خلال خطوات الغسيل لأن عدم القيام بذلك يؤدي إلى موت الخلية.
- ببطء لطف إضافة 10 ميليلتر من الحل ثرومبين (10 U/mL). مغادرة جزيرة ليلى والطبق منأى عن 15-20 دقيقة ملاحظة أن انخفاض الفيبرينوجين-ثرومبين سوف تصبح لزجة ومعتمة قليلاً عند هذه النقطة.
3- فيفو السابقين يعيشون-التصوير جكامب Fluorescence كثافة في الجزيرات الابتدائية الزرد
- إضافة 200 ميليلتر من حبس على رأس العفن ووضع الطبق بعناية على حامل اللوحة المجهر [كنفوكل]. استخدم هدفا جوية 20 س، غ 0.8، لتصوير [كنفوكل]. تحديد موقع هذه الجزيرة الصغيرة باستخدام الخيار برايتفيلد.
- استخدام عامل التصفية للأسفار الحمراء لعرض fluorescence mKO2 النووية في خلايا بيتا، والتركيز على جزيرة ليلى. أنوية الفردية ينبغي أن تكون واضحة للعيان.
- قم بتحديد موقع طائرة تصوير واضح بتغيير المستوى البؤري المجهر [كنفوكل] بغية الانتقال من خلال سمك الذي كان سائدا على طول محور ع به يدوياً. التأكد من أن الطائرة التصوير يحتوي على عدد كاف (50 – 100) من خلايا بيتا للتصوير، وسطوع fluorescence mKO2 النووية موحدة، لا سيما في وسط جزيرة ليلى.
- إعداد عملية شراء متتابعة للأسفار GCaMP6s و mKO2 باستخدام الإعدادات التالية في "قائمة الإعداد الذكية": GCaMP6s، الإثارة: 488 نانومتر، والانبعاثات: 500 – 555 نانومتر، كاذبة-اللون: الأخضر (حدد "بروتينات فلورية خضراء")؛ mKO2، الإثارة: 561 نانومتر (مشري)، الانبعاثات: 570 – 630 نانومتر، كاذبة لون: الأحمر (حدد "مشري").
ملاحظة: هذا الإعداد، القناة الحمراء سوف يسجل موقف نويات خلايا بيتا، بينما سيتم تسجيل قناة الأخضر كثافة الأسفار جكامب. - في وضع "حيازة" تعيين دقة الصورة في 1,024 x 1,024 بكسل، بسرعة الساعة 10 ومتوسط في 1. الشروع استمرار التسجيل عن طريق تحديد خيار "السلاسل الزمنية"، وتحديد "المدة" لدورات 500، مع حوالي 2 s شراء الوقت لكل إطار.
ملاحظة: تتوافق مع الإطارات 50 الأولى من السلسلة الزمنية لنشاط خلايا بيتا في تركيز الجلوكوز 5 مم. وهذا هو رد خط الأساس. سوف تظهر خلية بيتا مجيبة الصبح وتراجع في كثافة الفلورية الخضراء مع مرور الوقت. وقد لاحظنا أن يتذبذب قليلة (1-5%) من خلايا بيتا في الجلوكوز 5 ملم. -
إبقاء عين على دورة التصوير. بعد الأول 50 الإطارات، زيادة تركيز الجلوكوز الحل المحيطة بها إلى 10 ملم دون إيقاف التسجيل.
- دون مقاومة الحصول على الصور، بلطف "الماصة؛" ميليلتر 5 مم 200 د-الجلوكوز الحل على رأس جل عقد جزيرة ليلى. الحصول على إطارات 150 في الجلوكوز 10 ملم.
ملاحظة: الزيادة في تركيز الغلوكوز ستزيد عدد خلايا بيتا تمر ذبذبات نيون جكامب في قناة الأخضر. - ضمان أن نويات الخلايا تبقى مستقرة أثناء العملية. إذا تهز جزيرة ليلى على نطاق واسع خلال اقتناء وتنتقل النواة من المستوى البؤري، تجاهل العينة (إذا لزم الأمر).
- الانتظار فترة زمنية كافية لتمكين البلمرة العفن الفيبرينوجين-ثرومبين من أجل ضمان الاستقرار للعينات اللاحقة.
- دون مقاومة الحصول على الصور، بلطف "الماصة؛" ميليلتر 5 مم 200 د-الجلوكوز الحل على رأس جل عقد جزيرة ليلى. الحصول على إطارات 150 في الجلوكوز 10 ملم.
- في إطارات 200، زيادة تركيز الحل إلى 20 ملم بلطف بيبيتينج ميليلتر 10 مم 200 د-الجلوكوز الحل. الحصول على 150 إطارات لتركيز 20 مم.
- وبعد 350 الإطارات، ديبولاريزي جزيرة استخدام 30 ملم بوكل. لهذا، أضف 20 ميليلتر من 300 ملم من حل بوكل الأسهم. في هذه المرحلة، نلاحظ أن ذبذبات الأسفار GCaMP6s سوف تتوقف وإصلاح في كثافة عالية؛ قد تعرض خلايا بيتا التي لم تستجب للسكر أيضا زيادة في كثافة الأخضر-الأسفار عند إضافة بوكل.
4-تحديد مقدار جكامب Fluorescence التتبع لخلايا بيتا الفردية
ملاحظة: لتتبع وقياس ردود خلايا بيتا الفردية على مستويات متفاوتة من السكر، قياس كثافة الأسفار جكامب طيلة فترة التصوير. يتم إجراء القياس الكمي في القرار الخلوية. لهذا، استخدم فيجي20 لاستخراج قيم الكثافة للأسفار جكامب من الصور (الخطوات 4.1 – 4.6)، وبرنامج جداول البيانات أو ص21 لإجراء تحليل (خطوات 4.8-4.9).
- قم بفتح ملف الصورة في فيجي باستخدام "مربع الأدوات LSM". لذلك، حدد "البرنامج المساعد | أدوات LSM | إظهار مربع الأدوات LSM ". في مربع "أدوات LSM"، انقر فوق "فتح LSM" وحدد ملف الصورة.
ملاحظة: تنسيقات غير معتمدة من قبل "صندوق الأدوات LSM"، تحويلها أولاً tiff للتحليل. - استخراج استجابات الخلايا باستخدام الأداة (ROI) المنطقة من الفائدة في فيجي. افتح "إدارة العائد على الاستثمار" في القائمة "تحليل" ضمن "أدوات". رسم يدوياً العائد على الاستثمار باستخدام "أداة التحديد المضلع" الموجود في شريط الأدوات.
- رسم العائد على الاستثمار في القناة الحمراء التي نواة خلية بيتا مرئية. تحديد العائد على الاستثمار بأنها تغطي مساحة أكبر من نواة خلية لكي تشمل بعض من السيتوبلازم للخلية. موقف عائد الاستثمار ضمان اتساق بين الإطارات وضبط الموضع إذا لزم الأمر.
- إضافة رويس المحدد إلى "إدارة العائد على الاستثمار" بالنقر فوق الزر "إضافة [تي]". حدد وأضف رويس متعددة للعائد على الاستثمار للحصول على بيانات في خلايا متعددة.
- وبعد ذلك، من القائمة "تحليل"، حدد "تعيين قياسات". حدد "كثافة المتكاملة" لتحديد استخراج كثافة مجموع الأسفار داخل المنطقة.
- التحول إلى قناة الأخضر الذي يحتوي على الأسفار جكامب وحدد "تدبير المتعددة" في "إدارة العائد على الاستثمار".
ملاحظة: هذا سيتم توفير قياسات كثافة للخلايا في جميع أنحاء السلسلة الزمنية. - في حالة موقف عائد الاستثمار يحتاج إلى تعديل بسبب حركة من جزيرة ليلى، يدوياً تجميع قياسات كثافة في أطر مختلفة. نسخ ولصق القيم في جدول منفصل.
- الحصول على الطوابع الزمنية إطارات الصورة من "LSM مربع الأدوات". استخدام "تطبيق الطوابع | تطبيق الطوابع تي | اسم الملف | تفريغ ل textfile "للحصول على الطوابع الزمنية. حفظ الطوابع الزمنية باستخدام الخيار "حفظ باسم"، أو نسخ منها إلى جدول البيانات.
- عند تجميع قيم الكثافة لكافة الخلايا والقيام تحليل خلية واحدة في وقت واحد أو تلقائياً (مثلاً، باستخدام صيغ Excel أو R).
-
تحليل خلايا فردية في خطوتين.
- في الخطوة الأولى، حساب كثافة الأسفار أعلاه الأساس. وتحقيقا لهذه الغاية، حساب شدة الفلورسنت خط الأساس (و0) كمتوسط كثافة الأسفار للإطارات أولاً 50 (الجلوكوز 5 مم). ثم طرح خط الأساس (و0) من الوقت-السلسلة بأكملها (و – و0).
ملاحظة: يمكن أن تظهر بعض الخلايا واضحة جكامب ذبذبات تحت الجلوكوز القاعدية، والتي عادة ما تستمر بعد التحفيز بتركيزات أعلى. لهذه الخلايا، ومن الممكن فقط لتقدير و0 بأخذ متوسط كثافة الإطارات الأولية التي أظهرت الخلايا انخفاض في الأسفار. - في الخطوة الثانية من التحليل، الحصول على كثافة الأسفار جكامب النهائي بتطبيع شدة الأسفار.
ملاحظة: هذا هو إجراء لإزالة الفروق بين الجزر الصغيرة من الحيوانات المختلفة. الجزر الصغيرة الفردية عرض مستويات مختلفة من الأسفار الانبعاثات عند تنشيط الجلوكوز. - تطبيع شدة الأسفار بتقسيمه بكثافة أعلى قيمة. لذلك، حساب كثافة الذروة (وماكس – و0)، وتقسيم القيم الأساس مطروحاً بكثافة الذروة تسفر عن شدة الأسفار جكامب النهائي (و – و0)/(وماكس – و0).
- في الخطوة الأولى، حساب كثافة الأسفار أعلاه الأساس. وتحقيقا لهذه الغاية، حساب شدة الفلورسنت خط الأساس (و0) كمتوسط كثافة الأسفار للإطارات أولاً 50 (الجلوكوز 5 مم). ثم طرح خط الأساس (و0) من الوقت-السلسلة بأكملها (و – و0).
- تجاهل الخلايا التي لا يحمل تغييرا في كثافة أثر بوكل التحفيز، كما أنها قد تكون غير صحية أو معطوب.
- لإجراء التحليل (خطوات 4.9 – 4.10) في البحث والتطوير، استخدم البرنامج النصي R (بلوتسيلتريس. R) قدم هذه المخطوطة.
Representative Results
استخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، تم تحليل استجابات الجلوكوز خلايا بيتا في جزيرة ليلى من الزرد تسميد بعد (إدارة الشرطة الاتحادية) 45 يوما. لهذا، تشريح من حيوان يوثانيزيد جزيرة الأولية وشنت في العفن الفيبرينوجين-ثرومبين في صحن زجاج السفلي. الجزيرة كانت مغمورة في حبس المحتوية على الجلوكوز 5 ملم. تمت زيادة تركيز الجلوكوز على نحو تدريجي إلى 10 و 20 ملم. وسجلت استجابات خلايا بيتا للغلوكوز التركيزات المتزايدة. وأخيراً، كانت depolarized خلايا بيتا باستخدام 30 ملم بوكل (الشكل 1). ديبولاريزيشن استخدام بوكل الحث على إدخال الكالسيوم في خلايا بيتا صحية.
باستخدام برنامج تحليل بيانات وفيجي، كثافة الأسفار GCaMP6s خلايا بيتا الفردية يتم استخراج وتطبيع (الشكل 2). كما يظهر من تتبع شدة الأسفار، عرض خلايا بيتا الفردية التذبذبات في الأسفار GCaMP6s عند الجلوكوز التحفيز، والذي يتوقف على تحفيز بوكل. الأسلوب الذي يوفر دقة خلوية الجلوكوز خلايا بيتا-الاستجابة ونافذة في وظائفها.
الشكل 1: السابقين فيفو العيش-التصوير لتدفق الكالسيوم باستخدام GCaMP6s في خلايا بيتا الزرد. جزيرة ليلى الأولية من Tg(ins:nls-Renilla-mKO2)؛ Tg(ins:GCaMP6s) الزرد (45 إدارة الشرطة الاتحادية) كان محمل في الفيبرينوجين-ثرومبين العفن والمحتضنة مع جلوكوز 5 مم (القاعدية). كانت المسماة خلايا بيتا مع علامة حمراء نووية، بينما الأسفار GCaMP6s موجود في قناة الأخضر. الجزيرة حفزت مع منحدر جلوكوز تتكون من حضانة متسلسلة مع 10 و 20 ملم د-الجلوكوز، وديبولاريزيد عن طريق إضافة 30 ملم مارك بوكل. رؤوس الأسهم الفردية خلايا بيتا وقد تم تحليل نشاطها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تطبيع GCaMP6s fluorescence الكثافة--تتبع لخلايا بيتا الفردية- تطبيع GCaMP6s fluorescence الكثافة--تتبع لخلايا بيتا التي تحمل رؤوس الأسهم في الشكل 1. المحور يدل على الوقت بالثواني. في الجزء العلوي، تصوير أشرطة تركيز الجلوكوز وبوكل في الأجلين المتوسط وحبس. المحور الصادي يدل على شدة الأسفار تطبيع خلال السلسلة الزمنية. لهذا، يحسب متوسط كثافة كثافة الأساس (و0) أثناء حضانة في الجلوكوز 5 مم. وهذا هو طرح من بيانات سلسلة زمنية كاملة (F-و0). هو تطبيع خط الأساس على مدى كثافة حدة الأقصى المعروضة بواسطة الخلية (F-و0)/(وماكس-و0). يعرض التتبع تطبيع استجابة متذبذبة من خلايا بيتا للغلوكوز، التي تستقر عند الخلايا هي ديبولاريزيد مع 30 ملم بوكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
هنا نظهر تقنية للتحديد الكمي لاستجابة الجلوكوز خلايا بيتا في القرار خلية واحدة. أصبح هذا ممكناً من قبل رصد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام مؤشر كالسيوم المرمزة وراثيا، GCaMP6s. نشاط خلايا بيتا من الأسرى السابقين فيفو متصاعدة على الجزيرة الصغيرة في العفن الفيبرينوجين-ثرومبين. خطوة حاسمة للبروتوكول هو استقرار القالب. وقت كاف ينبغي إيلاء الفيبرينوجين حل في حل حبس. وبدون هذا بلمرة العفن لا بما فيه الكفاية لتوفير الاستقرار أثناء الدورة التصوير. يمكن أن تبقى جزيرة ليلى التي شنت في الفيبرينوجين-ثرومبين العفن ومنغمسين في خلية ثقافة وسائل الإعلام قادرة على البقاء لمدة أسبوع على الأقل (البيانات لا تظهر). يمكن استخدام بدائل للعفن الفيبرينوجين-ثرومبين، مثل ذوبان منخفضة [اغروس]، جبل جزيرة ليلى22. المعلمة حاسم آخر هو التشريح لجزيرة ليلى. أثناء هذه الخطوة، الأنسجة المحيطة بجزيرة ليلى يحتاج إلى إزالة دون إصابة أو دس جزيرة ليلى. ويأتي تشريح ماهراً مع الممارسة.
تحديد بروتوكول التصوير هو التقييد لطائرة [كنفوكل] واحدة من جزيرة ليلى. ويتم ذلك لالتقاط ديناميات تدفق الكالسيوم داخل خلايا بيتا الفردية. Z-كومة من خلال سمك كامل الجزيرة يؤدي إلى انخفاض التصوير بسرعة وفقدان الإشارة متذبذبة من الخلايا الفردية. ويمكن تحسين هذا القيد باستخدام أسرع وسائل [كنفوكل]-التصوير مثل الغزل-القرص المجهري، لتمكين أسر ديناميات الكالسيوم في 3-الأبعاد. وستكون آخر الحدود في فيفو الكالسيوم التصوير12. يمكن فتح الطبيعة الشفافة للجنين الزرد أو استخدام سلالات صباغ-أقل من الزرد البالغين23 إمكانية في فيفو التصوير في المستقبل.
يمكن تصوير نشاط خلايا بيتا في عالية الدقة المكانية والزمانية للتحقيق في عدم تجانس وظيفي بين خلايا بيتا الفردية. هذا النهج يمكن أن تساعد في تسليط الضوء على وجود خلايا بيتا السكان الفرعية. في الآونة الأخيرة، أظهرت دراسات متعددة بوجود السكان الفرعية في خلايا بيتا اسمياً متجانسة24،،من2526. يمكن أن يقترن السابقين فيفو تصوير الصحفيين الوراثية لتوصيف الفرعية السكان استجابة للسكر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسمح الجمع بين الإعداد التصوير مع التحفيز الدوائي لفحص المركبات التي يمكن أن تحسن وظيفة خلايا بيتا.
وباختصار، يسمح التقنية المقدمة هنا القياس الكمي ومقارنة مدى استجابة الجلوكوز لخلايا بيتا الفردية. ويوفر نافذة مباشرة في وظيفة خلايا بيتا، معياراً هاما في تطور مرض السكري.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونشكر أعضاء المختبر نينوف للتعليقات على المخطوطة، أعضاء من مركز لمرفق درسدن العلاجات التجدد (الاتفاقية) الأسماك والفحص المجهري للمساعدة التقنية. ن. ن. هو مدعومة بتمويل من DFG الاتفاقية، "الكتلة للتميز" في درسدن تو، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG)، والمركز الألماني لبحوث مرض السكري (DZD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
| Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
| Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
| Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
| Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| 35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
| tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
| FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
| R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
| RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
| plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |
References
- Kahn, S. E. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).
- Ogurtsova, K., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).
- Pipeleers, D. G.
- MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P.
- Hellman, B., et al. Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells. Diabetologia. 37, Suppl 2. S11-S20 (1994).
- Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets. J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).
- Wollheim, C. B., Pozzan, T. Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).
- Pace, C. S., Price, S. Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).
- Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release. J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).
- Soria, B., Martin, F. Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).
- Kenty, J. H. R., Melton, D. A. Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression. PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
- Friedman, R. S., et al. An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function. Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat Commun. 7, 11756 (2016).
- Johnston, N. R., et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose. Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).
