Summary
Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM), Yetişkin, en sık ve agresif birincil beyin kanseri genellikle kötü prognoz ile ilişkilidir ve kıt etkili tedaviler son on yılda önerilmiştir. Roman tedavi edici stratejiler tasarlamak için umut verici adaylar arasında hücresel immunotherapies son derece invaziv ortadan kaldırmak için hedef almış ve kemoterapi-olup tümör hücreleri, büyük olasılıkla bu kanser bir hızlı ve ölümcül nüks dahil. Böylece, tümör çevresinde insan Vϒ9Vδ2 T lenfositler gibi allojeneik GBM reaktif bağışıklık hücre effectors administration(s) verimli sunmak için eşsiz bir fırsat temsil eder ve son derece konsantre doğrudan içine terapötik ajanlar beyin maligniteler sitesi. Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada fizibilite ve allojenik insan lenfosit intrabrain tümör yataklar içinde stereotaksik enjeksiyonları itimat bu hücresel immunotherapies antitümör etkinliğini preklinik bir kanıtı-of-concept sağlar.
Introduction
(Kim IV tümörü grade) GBM erişkinlerde en sık ve agresif birincil beyin kanseri var. Cerrahi ve radyo-kemoterapi birleştirir agresif tedaviler rağmen GBM son derece kötü prognoz (medyan sağkalım 14.6 ay ve % 2-yılı-ölüm > 73)1ile ilişkili olarak kalır. Bu kaç etkili tedavi gelişmeler üzerinde son on yılda2doğrulandıktan kanıtlamaktadır. Daha etkili tedavi stratejileri3,4,5tasarımı için adaylar arasında immunotherapies6 Şu anda incelenmiştir izlemek ve son derece invaziv ve radyo/kemoterapi dayanıklı tümör ortadan kaldırmak için hücreleri, hızlı ve ölümcül tümörün nüks7anahtar katkılarından dolayı şüpheli. Çeşitli potansiyel immünolojik hedefleri belirlendi ve için önerilen immunotherapies, doğal içeren veya değiştirilmiş αβ veya ϒδ T lenfositler GBM özgü tümör antijenleri veya stres kaynaklı molekülleri8,9gibi olduğunu, 10. Seçili GBM reaktif bağışıklık hücre effectors yönetmek için olasılık efektör lenfositler yüksek miktarlarda kalıntı malignite siteye doğrudan sunmak için eşsiz bir fırsat temsil eder. Bu strateji desteklemek için biz son zamanlarda orthotopic birincil insan GBM xenografts sadakatle taşıyan immünyetmezligi fareler üzerinde temel modelleri beyin tümörleri GBM hastaların9,11' deki gelişimi özetlemek göstermiştir. Ayrıca, bu modeller adoptively transfer edilen allojeneik insan Vϒ9Vδ2T lenfosit güçlü antitümör etkinliğini göstermek için kullanılmıştır.
Bu iletişim kuralı GBM, allojeneik T lenfositler evlat edinen transferinde dayalı gibi beyin tümörlerinin stereotaktik immunotherapies ulaşmak için kritik deneysel adımları açıklar. Makale gösterir: (i) gibi insan Vϒ9Vδ2T lenfosit; tedavi allojeneik bağışıklık efektör T lenfositler amplifikasyon (ii) enjeksiyon için bu efektör T lenfositler hazırlanması; (iii) içinde beyin tümörü yakınındaki stereotaksik yönetim için yordam. Bu makalede ayrıca bu hücresel effectors davranışını içgörü sonra stereotaksik enjeksiyon sağlar.
Burada sunulan tedavi yaklaşımı 20 x 106 efektör hücreleri başına doz her beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi fare için enjeksiyon temel alır. Bağışıklık hücreleri büyük miktarlarda üretmek için bir ilk vitro genişleme adım gereklidir. Bu nedenle, belirsiz hücre açılımları phytohemagglutinin (PHA-L) kullanarak gerçekleştirilir ve allojenik besleyici hücreler ışınlanmış: periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) sağlıklı bağış ve Epstein Barr virüsü EBV dönüştürülmüş B-lymphoblastoid hücre vitro enfeksiyon EBV içeren kültür Marmoset B95-8 hücre satırından 1 µg/mL cyclosporin-A. huzurunda süpernatant ile PBMCs elde satırları (BLCLs),
GBM reaktif efektör bağışıklık hücreleri karşılaştırılır ve vitro deneyleri9' dan seçilmiş. Bu efektör hücreler aktif hale gelir ve standart iletişim kuralları kullanarak kendi doğası göre (Örneğin, insan Vγ9Vδ2 T lenfositler9 veya insan anti-herpes virüsü αβ T lenfositler12) > %80, rutin olarak en az bir saflığı ile güçlendirilmiş sitometrik analiz tarafından kontrol. Aşağıda verilen hücre genişletme yordam çeşitli insan lenfosit alt kümeleri için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki yordam içeren hayvan konular (anlaşma #00186.02; Pays de la Loire [Fransa] bölgesel Etik Komitesi) Kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen. İnsan PBMCs bilinçli sağlıklı bağış (Etablissement Français du Sang Nantes, Fransa) toplanan kan gelen izole edildi. Tüm adımlar steril koşullarda gerçekleştirilir.
1. non-spesifik sitotoksik efektör T lenfositler genişlemesi
- Hazırlamak ve besleyici hücreler, 35 Gy ışınlatayım. 2 x 105 - 4 x 105 efektör hücreleri, uyarılması için 10 x 106 PBMCs ve 1 x 106 BLCLs üç farklı ve sağlıklı bağışçılardan hazırlayın.
- Besleyici hücreler ve % 10 FCS ısı inaktive, 2 mM L-glutamin, penisilin (100 IU/mL) ve streptomisin (0.1 µg/mL) ve 300 IU/mL rekombinant IL-2 takıma RPMI 15 mL efektör hücrelere resuspend.
- PHA-L 1 µg/mL nihai bir konsantrasyon eklemek, dikkatlice karıştırın ve hücre süspansiyon 96-şey U popolu plakaları bir kuyu başına 150 µL dağıtmak.
- 37 ° C'de ve oksijen bir atmosferde % 5 CO2 kuluçkaya.
- Büyük hücreli kültür wells formunda kümeler kadar günlük plaka kontrol (~ 7 gün).
- Hücreleri 1 x 106 hücre/mL taze kültür ortamında, bir kültür şişesi içine aktarın.
- (2 bir hafta x) sayarak toplam cep numarasını belirlemek ve taze kültür ortamında 1 x 106 hücre/mL proje.
Not: Efektör bağışıklık hücreleri dinlenme State (genellikle 3 hafta sonra ilk amplifikasyon uyarıcı) tedavi yönetim için hazır olmalıdır. Saflık ve reaktivite bu efektör hücreler in vivo enjeksiyonları (Örneğin, vitro deneyleri ile) önce kontrol edilmelidir.
2. pre-operative efektör hücreleri hazırlık
- Efektör hücre sayısı kontrol ettikten sonra 50 mL tüp efektör hücrelerde Santrifüjü (300 x g 5 min için) tarafından toplamak.
Not: aşırı hücre (Örneğin, 50 x 106) için herhangi bir kaybı telafi etmek için hazır olun. - Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 15 mL steril PBS ve 300 x g de 5 dk santrifüj yıkama gerçekleştirmek için hücrelerde resuspend.
- Dikkatli bir şekilde ve tamamen süpernatant kaldırın ve sonra hücre pelet 1 mL steril PBS resuspend.
- Santrifüjü 300 x g 5 min için de için 1.5 mL microtube resuspended hücrelerde aktarın.
- Yavaş yavaş pipetting tarafından dikkatli bir şekilde ve tamamen süpernatant kaldırın.
- Hücre Pelet fare başına steril PBS 8 µL resuspend.
Not: Bu kritik bir adımdır. - Hücre süspansiyon hacmi bir micropipette kullanarak ölçün. Gerekirse, steril PBS (PBS 15 µL doz başına 20 x 106 hücreler) ve dikkatlice karıştırın.
- , 15 ve 20 μL (imperatively < 20 µL) arasında fare başına son birimdir micropipette, kullanarak kontrol edin.
- Buz hücrelerdeyse stereotaksik enjeksiyon kadar tutun.
Not: daha 3 h timepoints test değil.
3. stereotaksik enjeksiyon
-
Ekipman kurulumu
- Bir araya getiren ve küçük bir hayvan stereotaksik kare kafa içi enjeksiyonları (Örneğin, şırınga boyutu, istenen birim ve enjeksiyon oranı) doğruluğunu sağlamak için üreticinin yönergelerine göre kalibre.
Not: Yavaş infüzyon hızı (Örneğin, 2-3 µL/dak) önerilir. - Mikrobiyal emanet dolabı (MSC) kısırlık araçlarının bakımını ve fareler korumak için altında malzeme bulaşan yükleyin.
Not: yer "izotermal blok" 37 ° C'de bir su banyosunda Bu sistem, ameliyat sırasında fareler hipotermi sınırlar. Yastıkları, sonrası yordam bakımı için gerekli olan Isıtma sürekli sıcaklık izleme sırasında kullanılmalıdır.
- Bir araya getiren ve küçük bir hayvan stereotaksik kare kafa içi enjeksiyonları (Örneğin, şırınga boyutu, istenen birim ve enjeksiyon oranı) doğruluğunu sağlamak için üreticinin yönergelerine göre kalibre.
-
Pre-operative hayvan hazırlık
- Bir fare ketamin (10 mg/mL) ve xylazine (0.1 mg/mL) 10 µL/g fare vücut ağırlığının, mayi enjeksiyonu ile anestezi.
- Tam anestezi ve analjezi Hayvan emin olmak için bir ayak çimdik testi gerçekleştirin.
Not: Herhangi bir hareket derin olmayan analjezi bir göstergesidir ve bu durum ortaya çıkarsa, bir kaç dakika daha işlem tekrarlanmadan önce gereklidir. - Sonra fare düzgün anestezi, makas (arasında iki kulak, burun kadar) cerrahi sitesinden kürk kaldırmak için kullanabilirsiniz.
-
Pre-operative hücre hazırlık
- Dikkatli bir pipet hücrelerle topaklanma herhangi bir hücreyi önlemek için önce her iğne (birkaç kez) resuspend.
- Dikkatle gerekli hücre süspansiyon birim (15-20 µL) kabarcıklar aspirasyon önlemek için 22-G microsyringe çizin.
Not: Bu hücre-yükleme adım içine microsyringe enjekte birimleri'deki en aza indirmek önemlidir. Hücreler arasında yordamlar topaklanma herhangi bir hücreyi engellemek ve efektör hücreleri yönetim kohort çift sayıda sağlamak için tek tek her enjeksiyon için yeniden yükleyin. - O zaman, belgili tanımlık tenkıye adapte şırınga pompa yerleştirin.
-
Yordam bakım
- Cerrahi sitesi povidone-iyot %5 çözüm en az 3 batırılmış temizleme bezi ile dezenfekte x.
- Yağlama oftalmik merhem herhangi bir kornealar kurutma önlemek için fareyi'nın gözlerinin içine yerleştirin.
- Pozisyon stereotaksik karede sıcak izotermal blok imzalat fare fare ısısını ameliyat sırasında korumak ve mortalite sınırlamak için steril bir plastik film ile kaplı.
Not: Fare burun ve diş uygun şekilde işlem sırasında yeterli solunum akışını sağlamak için diş çubuğunun üzerinde konumlandırılmış olmalıdır. - Fare diş çubuğunun üzerinde konumlandırılmış bir kez sıkıca fare kulaklar kafa hareketsiz altında kulak çubuklarını sıkın.
Not: kulak zarı zarar vermemeye veya solunum uzlaşmaya dikkat et. - 1-2 cm ensizyon sagittal cilt kafatası kafatası ortaya çıkarmak için posterior anterior üst kısmı boyunca steril makasla olun.
- Sagittal ve koronal sütür (Bregma) ( Şekil 1' de gösterilen) enjeksiyon önce stereotaksik yerelleştirme için simge olarak hizmet verecek kesişimi tanımlayın.
- Bu noktada yukarıda microsyringe bir yer.
- 2 mm sağ yanal ve 0,5 mm Bregma ön microsyringe taşıyın.
- Bir microdrill kullanarak, önceden belirlenen koordinatları steril bir matkap ile kafatası içinde küçük bir delik açmak. Beynin herhangi bir travmatik yaralanmayı önlemek için yüzeysel kalması için dikkatli olun.
Not: Bu protokol için kurulan bir tümör (bir hafta sonra tümör hücre enjeksiyon) içinde bağışıklık hücreleri enjekte edildi. Deri yeniden (skar) ve enjeksiyon olmalıdır (delik genellikle hala enjeksiyon sonra 2 hafta kadar mevcut) tümör hücre implantasyonu için kullanılan aynı koordinatlarda gerçekleştirilir. Koordinatları beyin parankimi13,14tümör ve efektör hücrelere enjekte için seçildi.
-
Enjeksiyon bağışıklık efektör hücrelerin
- Dikkatle microsyringe delinmiş deliğe yerleştirin ve yavaş hareket, beyin zarı içinde aşağı 3 mm ve sonra geriye doğru 0,5 mm son derinliğe kadar efektör hücreleri enjekte önce 2.5 mm iğne iletmek.
- 2-3 µL/dak efektör hücre enjeksiyon çalıştırın ve enjeksiyon süresi boyunca fareler izleme.
- Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra yalnızca 1 mm için iğne geri çekilin ve yavaş yavaş tamamen çekilmesi infüzyon sitesinden herhangi bir sızıntı önlemek için microsyringe, önce bir dakika için microsyringe tutmak.
Not: hayvan stereotaksik aygıttan kaldırılmasını, hemen enjeksiyon donanımları yaklaşan deneyler için temiz.
-
Ameliyat sonrası bakım ve takip fare
- Hayvan stereotaksik çerçevesinden kaldırın ve hemen povidone-iyot %5 çözüm kesi sitede uygulamak ve uygun bir cerrahi sütür ile cildi kapatmak.
- %2 lidokain jel doğrudan yaraya uygulayın ve buprenorfin 0.15 µg/g tarafından Subkutan Enjeksiyon sonrası yordam analjezi için yönetmek.
- Yer geri onun kafes bir ısıtma yastığı yukarıda imzalat fare 37 ° C için uygun fare vücut ısısını korumak için ve herhangi bir hipotermi önlemek için ayarlayın.
Not: Ayrı konut gerekli değildir. - Anesteziden tamamen iyileşti kadar fareyi izlemek ve konut odasına aktar.
Not: birkaç beklenmedik komplikasyonlar (< %5 enjekte farelerin) meydana gelmiş gibi bugüne kadar bu protokolü de desteklenir. - Her gün fareler izlemek ve azalan herhangi bir sağlık işaretleri (Örneğin, Kambur duruş, hareketliliğin, secde veya önemli vücut kilo kaybı [≥ % 15]) gözlendiğinde onları ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma içinde beyin tümörü taşıyan fareler stereotaksik enjeksiyonları tümör yatağın içinde gerçekleştirilen temel hücresel bağışıklık efektör hücrelerin evlat edinen transferlerin strateji açıklar.
Herhangi bir büyük enjeksiyon birimle ilişkili beyin hasarı riskini en aza indirmek için efektör hücre süspansiyon (15-20 µL PBS, 20 x 106 hücreler) konsantre gerekir. Bu hücre toplama adımı efektör hücrelerin canlılık etkileyebilecek olup olmadığını denetlemek için bu hücreleri açıklanan protokole göre kurumlara ve microsyringe yüklü. Efektör hücreleri hemen veya 10 dk microsyringe yükledikten sonra toplanmıştır. Hücreleri propidium iyodür (PI), hücrelerin yaşamak için permeant ve akış sitometresi farklı timepoints (0, 24 ila 72 saat), tarafından analiz değil bir floresan DNA intercalating Ajan ile lekeli. Sonuçları göster: hazırlık ve microsyringe içine belgili tanımlık yük önemli ölçüde efektör hücreleri canlılığı en az 24 saat (Şekil 2A ve 2B) etkilemez. 72 saat bir küçük ama önemli olmayan-artış PIpozitif hücrelerinin (boş hücreler için % 11 karşılaştırıldığında % 14) gözlenmiştir. Benzer şekilde, kurumlara ve 3 saat boyunca buzda muhafaza efektör hücrelerin antitümör reaktivite analiz edildi. Efektör hücreleri Beyin tümör hücreleri ile 4 saat için bir anti-CD107a mAb huzurunda cocultured. Harekete geçirmek işaret CD107a, benzer Denetim koşullarında alınan değeri upregulation reaktivite efektör hücrelerin hazırlanması ve microsyringe (Şekil 2C) içine yükleme tarafından etkilenmez gösterir.
Efektör hücreleri hayatta kalmak ve takip onların içi tumoral implantasyonu, 20 x 106 efektör beyin parankimi içinde hareket olup olmadığını değerlendirmek için hücreleri bir beyin tümörü (GBM-111) taşıyan farelerde tümör siteye enjekte edildi. Bir hafta sonra sabit, kesitli ve lekeli hematoksilen eozin ve safran rengi (HES) ve anti-insan CD3 mAb (IHC) için beyin toplanmıştır. HES renklendirme beyin tümörleri (Şekil 3, Sol panelde) yapısını belirledi. CD3 boyama tespit ve bağışıklık T lenfositler efektör lokalize (burada, insan Vϒ9Vδ2 T hücreleri) (Şekil 3, doğru kapı aynası). İlginçtir, efektör T lenfositler (Şekil 3, üst doğru kapı aynası), tümör tümör çekirdek (Şekil 3, Orta doğru kapı aynası), ama aynı zamanda (Şekil 3, kontralateral yarımkürede algılandı alt doğru kapı aynası). Ayrıca, 48 saat sonra onların enjeksiyon (4 x 106 αβ T hücreleri), beyin hücrelerinin % 2 temsil, fare beyninden izole insan T lenfosit fonksiyon analiz edildi. Sonuçlar allojeneik αβ T hücreleri toplanan beyin enjekte efektör genişletin ve IL-2 (Şekil 4) huzurunda gerçekleştirilen bir non-spesifik PHA-besleyici hücreler etkinleştirme üzerine çoğalırlar gösterir.
Birlikte, bu sonuçlar hazırlanmış ve bu prosedürleri altında idare efektör T hücreleri saat için beyinde hayatta ve tümör ve sağlıklı beyin doku içinde devriye göster. Bu yordamları allojeneik insan istirahat Vϒ9Vδ2 T hücreleri tedavi stereotaksik yönetimleri antitümör verimliliğini değerlendirmek için insan GBM beyin tümörleri9,11gelişimi denetlemek için kullanılmıştır. Bu çalışmalar kanıt enjeksiyonları tümör yatakta allojeneik insan efektör T lenfositlerin beyin tümörü taşıyan fareler yaşama önemli ölçüde artırır. İlginçtir, fareler hayatta tespit tümör hücreleri, bu nedenle bir tam tümör ret gösteren taşıdın değil.
Resim 1 : Resim ana anatomik yerlerinden fare kafatasındaki. Bu sagittal (kırmızı çizgi) ve koronal (mavi çizgi) dikiş ve Enjeksiyon Makinası yönlendirmek için kullanılan kendi kesişim (Bregma) içerir. Ölçek çubuğu gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Hayatta kalma ve harekete geçirmek-in hazırlanan efektör T lenfositler. Efektör hücreleri (burada, insan periferik Vϒ9Vδ2 T hücreleri dinlenme) açıklanan yordamı göre hazırlanan ve güçlendirilmiş. Lenfosit propidium iyodür (PI) ile boyama, canlı hücreler ve fonksiyonel aktivasyon permeant değil floresan bileşik enterkalasyon bir DNA gerçekleştirilen. İleri (FSC-H) karşı tarafın (SSC-H) temsil eden bir çizim dağılım efektör lenfositler (paneli yaptı) geçişi (A) Bu panel gösterir. Histogram PI gated denetim lenfositler (doğru kapı aynası) boyama gösterir. PIolumlu lenfositler yüzdesi gösterilir. (B) Bu panel gösterir hemen toplanan yüzdesini ölü lenfositler (PIpozitif) (ışık mavi çizgi) ya da 10 dakika sonra (koyu mavi bir çizgi) microsyringe içinde ölçülen belirtilen timepoints. Denetimi gibi boş hazırlanan hücreler kullanıldı (gri çizgi). (n = 3; ± SD; yani ns = önemli değil.) (C) CD107a yüzey seferberlik tarafından akış sitometresi ya Vδ2pozitif kontrol hücreleri (hazırlıksız) üzerinde ölçülen veya hazırlanan lenfositler hedef insan birincil Beyin tümör hücreleri ile bir coculture takip buz (hazır + 3 h) yapılmaktadır. Lenfositler yüzdesi her sitometrik çeyreği'nde belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Algılama ve yerelleştirme beyin tümörü taşıyan fareler içinde efektör T lenfositlerin. Bir hafta sonra glioblastoma beyin tümörü implantasyonu, efektör bağışıklık hücreleri (burada, insan periferik Vϒ9Vδ2 T hücreleri dinlenme) farelerin beyinlerinin enjekte edildi. Bir hafta sonra immunotherapeutic tedavi, beyin toplanan, Sabit kesitli ve. Beyin bölümleri immünhistokimya analiz için (hematoksilen eozin ve safran [HES] renklendirme) renkli (sol kapı aynası) veya anti-insan CD3 antikor (doğru kapı aynası) lekeli. Gösterilen üç bağımsız deneyler temsilcisi sonuçlarıdır. Ölçek çubuğu gösterilir.
Şekil 4 : Efektör T lenfosit aktivasyonu toplanan tedavi fare beyninden. Dinlenme insan T lenfositler (burada, 4 x 106 insan αβ T lenfositler) NSG farelerin beyinlerinin enjekte edildi. 48 saat sonra zeki toplanan ve ayrışmış. İnsan beyin infiltre T lenfositler yüzdesi bir anti-insan CD3 antikor (alt paneli) kullanarak akış sitometresi tarafından ölçüldü. Kendine hakim hücre (10 hücreler/de) 96-şey U popolu plakaları ve uyarılmış (PHA-besleyici hücreler ve IL-2) 20 gün (16 döngüleri iki katına) numaralı seribaşı. Dikkat, günde 10, 13,3 x 106 insan T lenfositler (doğru kapı aynası) elde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir evlat edinen transferini yerli seçilen veya mühendislik bağışıklık efektör hücreleri temsil eden verimli tümör hücreleri dönüştürülmüş15karşı ayrıntıları sınırlayıcı dikkat çekici infiltrative beyin kanser gibi tedavisi için umut verici bir yaklaşım, 16,17,18. Ancak, beyin oluşur, merkezi sinir sistemi, kan - beyin bariyerini varlığını ve klasik lenfatik drenaj sistemi19,20eksikliği nedeniyle özellikle özel bir bağışıklık durumu olduğunu. Bu fizyolojik özellikleri doku ticareti etkileyen ve sistemik bağışıklık hücreleri enjeksiyonlari tehlikeye atabilir. Bu engelleri aşmak için intraparenchymal enjeksiyonları antitümör hücreler yerine yerel olarak, yakından farmakolojik bileşikler21, içeren mikroküreler gelince tümör site teslim edilir ve prensip olarak araştırılmalıdır 22. bir yandan organ içinde lenfositlerin sınırlı seyreltme antitümör onların verimliliği artırmak, ama aynı zamanda zararlı mekanik veya tümör adaptasyon gibi efektler beyin geliştirme tissular sıkıştırma yükseltmek tümör büyüme. Bu Bu yordam küçük hacimli immunotherapeutic enjeksiyonu gerekir anlamına gelir. Hangi beyinde tümör cerrahi olarak eksize olamaz hayvan deneysel modellerinde daha kritik bir konudur. Bu makalede bir tedavi yaklaşımı hazırlık ve beyin tümörü özgü hücresel effectors, allojeneik insan T lenfositler stereotaktik injection(s) üzerinde tabanlı yerel teslimat için.
Bu çalışmada hazırlık ve allojenik insan Vϒ9Vδ2 T lenfositler stereotaksik teslimini insan GBM xenografts taşıyan immünyetmezligi NSG farelerde gösterir. Bu iletişim kuralı ilk aşaması allojeneik T lenfositler PBMCs sağlıklı donör dan yükseltecek, büyük miktarlarda saf efektör T lenfositleri üretir standart bir nonspesifik PHA-besleyiciler-IL2 stimülasyon kullanılarak, izin için basit bir yordam açıklanır onların kullanımı kullanımı23,24. Bu makalenin ikinci aşama hazırlık T lenfosit süspansiyonlar stereotaksik yönetim gün istirahat odaklanır. Belirli bir odak canlılığı ve seçili efektör T lenfosit fonksiyon etkilememelidir yüksek hücresel yoğunluk gerektirir bu önemli bir adım yerleştirildi. Son olarak, in vivo deneyler ile ilgili efektör T lenfositler ve onların enjeksiyon tümör çekirdek içinde hazırlanması sadece vurgulayarak aynı zamanda çevre beyin dokular, tümör içinde onların yayılması ile ilişkili onların belirli yetenek devriye ve invaziv tümör hücreleri izlemek için. Önemlisi, bu hazırlık ve enjeksiyon yöntemleri bu T lenfositler beyin beyin tümör hücreleri belirli bir tanıma üzerine içinde etkinleştirilmesi yeteneğini korumak. Özet olarak, bu çekici özellikleri özellikle T lenfositler için yetenek sağlamak ve verimli bir şekilde hedef ve GBM25damgasını olan derin infiltrative Beyin tümör hücreleri ortadan kaldırmak. Notun, efektör hücre sızıntıları veya enjeksiyon ve microsyringe kaldırılması sırasında herhangi bir beyin lezyon en aza indirmek için alınması gereken özel bir bakım vardır.
Sonuç olarak, bu makalede insan Vϒ9Vδ2T lenfositler, beyin tümörleri çevresinde içinde dinlenme gibi allojeneik insan anti-tümör lenfositler, büyük miktarda teslim etmek için verimli bir yordam açıklanır. Önemlisi, tedavi bu yordamın yan etkileri (Örneğin, canlılığı, reaktivite) aktarılan T lenfositler veya beyin dokuları ile eşlik değil. Son çalışmalar, birincil insan GBM, fare orthotopic modelleri alan Vϒ9Vδ2T lenfosit verimli GBM hücreleri derin beyin parankimi9,11sızdığı tümör hücreleri de dahil olmak üzere, hedef gösterdi. Bu öğeleri orthotopic beyin tümörü taşıyan fareler ve sonra GBM hastalarda klinik çalışmalarda ilk etapta uygulanan olabilir roman evlat edinen T lenfositler transfer yordamlar gelişimi için fırsatlar açık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar personeli sitometresi tesisi (Cytocell) ve Üniversite Hastanesi hayvan tesis (UTE) Nantes hayvan yetiştirme ve bakım, hücresel ve tissular çekirdek tesis Nantes Üniversitesi (MicroPICell) görüntüleme için görüntüleme için Nantes teşekkür uzman teknik yardım. Bu eser INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du kanser (Inca #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le kanser (AO Bölgelerarası 2017) ve Avrupa konsorsiyumu dönemi-Net Transcan2 tarafından finanse edildi (Immunoglio). Takım Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) tarafından finanse edilmektedir. Bu eser IGO LabEX bağlamında gerçekleşmiştir ve IHU Cesti programları, desteklenen Ulusal Araştırma Ajansı Investissements d'Avenir yolu ile tarafından programları ANR-11-LABX-0016-01 ve ANR-10-IBHU-005, anılan sıraya göre. IHU Cesti projesi de Nantes Metropole ve Pays de la Loire bölgesi tarafından desteklenmektedir. Yazarlar Chirine Rafia el yazması düzeltmek yardım sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
