Summary
نقدم هنا، بروتوكول للإعداد وإدارة ستيريوتاكسيك للخلايا الليمفاوية البشرية متمكنة في الفئران العوز تحمل أورام الدماغ الأولية البشرية أورثوتوبيك. وتوفر هذه الدراسة من بين مفهوم إثبات للجدوى وفعالية تسليم إينترابرين إيمونوثيرابيس الخلوية انتيتومور.
Abstract
جليوبلاستوما عديدة الأشكال (GBM)، سرطان الدماغ الأولية الأكثر تواترا والعدوانية لدى البالغين، يرتبط عموما سوء تشخيص، وقد اقترحت العلاجات الفعالة النادرة على مدى العقد الماضي. بين المرشحين الواعدين لتصميم استراتيجيات علاجية جديدة، إيمونوثيرابيس الخلوية قد استهدفت القضاء على الغازية عاليا والكيماوي راديوريسيستانت الخلايا السرطانية، يحتمل في الارتداد السريع وقاتلة من هذا النوع من السرطان. وهكذا، سوف يمثل فرصة فريدة لتحقيق كفاءة administration(s) متمكنة من الخليج للحاسبات الآلية--رد الفعل الخلايا المناعية المستجيبة، مثل الخلايا اللمفية تي Vϒ9Vδ2 البشرية، محيط الورم والتركز الشديد للعوامل العلاجية مباشرة في الموقع من الأورام الخبيثة في الدماغ. نقدم هنا، بروتوكول للإعداد وإدارة ستيريوتاكسيك للخلايا الليمفاوية البشرية متمكنة في الفئران العوز تحمل أورام الدماغ الأولية البشرية أورثوتوبيك. وتوفر هذه الدراسة السريرية من-مفهوم إثبات للجدوى وفعالية هذه إيمونوثيرابيس الخلوية التي تعتمد على حقن المناظير باستخدام الأشعة من الخلايا الليمفاوية البشرية متمكنة داخل أسرة الورم إينترابرين انتيتومور.
Introduction
الخليج للحاسبات الآلية (من الصف الرابع astrocytoma)، هو سرطان الدماغ الأولية الأكثر تواترا والعدوانية لدى البالغين. على الرغم من العلاجات العدوانية التي تجمع بين الجراحة والعلاج الكيميائي الإذاعة، ما زال GBM مقترنة تكهن سيئة للغاية (متوسط بقاء 14.6 شهرا و ٪ 2-السنة-وفيات > 73)1. وهذا يدل على أن السلف علاجية فعالة قليلة وقد تم التحقق من صحة على مدى العقد الماضي2. ومن بين المرشحين لتصميم استراتيجيات علاجية أكثر فعالية3،،من45، يتم استكشاف إيمونوثيرابيس6 حاليا لتعقب والقضاء على درجة عالية من الورم الغازية ومقاومة لراديو/الكيماوي الخلايا، ويشتبه في أنها لمساهمتها الرئيسية في انتكاس الورم السريع وقاتلة7. كانت مختلف الأهداف المناعية المحتملة إيمونوثيرابيس المحددة والمقترحة ل، التي تنطوي على الطبيعية أو αβ المعدلة أو لمفاوية T ϒδ مثل المستضدات الورم الخاصة بالخليج للحاسبات الآلية أو الجزيئات الناجمة عن الإجهاد8،9، 10. إمكانية تول المستجيبة الخلايا المناعية GBM--رد الفعل المحدد يمثل فرصة فريدة لتسليم كميات مرتفعة من الخلايا اللمفية المستجيب مباشرة إلى موقع خبيثة المتبقية. لدعم هذه الاستراتيجية، ونحن قد أظهرت مؤخرا أن النماذج القائمة على الفئران العوز تحمل تكثيفها GBM البشرية الأساسية أورثوتوبيك أمانة الخص تطوير أورام الدماغ في الخليج للحاسبات الآلية المرضى9،11. وعلاوة على ذلك، استخدمت هذه النماذج لإثبات كفاءة انتيتومور قوية لنقل أدوبتيفيلي متمكنة من الخلايا اللمفية Vϒ9Vδ2T البشرية.
ويصف هذا البروتوكول الخطوات التجريبية الهامة لتحقيق إيمونوثيرابيس المناظير باستخدام الأشعة لاورام الدماغ، مثل الخليج للحاسبات الآلية، استناداً إلى نقل الخلايا اللمفية تي متمكنة التبني. تبين المادة: (ط) التضخيم من العلاج المناعي متمكنة المستجيب تي الخلايا الليمفاوية، مثل اللمفاويات Vϒ9Vδ2T البشرية؛ (ثانيا) إعداد هذه الخلايا اللمفية تي المستجيب للحقن؛ (ثالثا) إجراءات الإدارة المناظير باستخدام الأشعة داخل الدماغ، والقرب من الورم. يوفر هذا المقال أيضا نظرة ثاقبة سلوك هذه المستجيبة الخلوية بعد الحقن بالمناظير باستخدام الأشعة.
ويستند النهج العلاجية المقدمة هنا حقن 20 × 106 المستجيب الخلايا كل جرعة لكل الماوس العوز الحاملة لورم الدماغ. مطلوب خطوة توسع أولى في المختبر لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا المناعية. ولذلك التوسعات خلية غير محددة يتم تنفيذها باستخدام فيتوهيماجلوتينين (فا-L) والمشع متمكنة تغذية الخلايا: خلايا الدم الطرفية وحيدات النوى (ببمكس) من الجهات المانحة صحية وخلية حولت ابشتاين بار فيروس EBV ب-ليمفوبلاستويد خطوط (بلكلس)، مستمدة من ببمكس بالعدوى في المختبر مع الثقافة التي تحتوي على EBV طافية من خط خلية مرموز B95-8، حضور 1 ميكروغرام/مل السيكلوسبورين-أ
مقارنة مع الخلايا المناعية المستجيب GBM المتفاعلة ومختارة من المختبر فحوصات9. يتم تنشيط هذه الخلايا المستجيب وتضخيمه باستخدام البروتوكولات القياسية، وفقا لطبيعتها (مثلاً، لمفاوية Vγ9Vδ2 T البشرية9 أو فيروس القوباء المضادة البشرية αβ تي لمفاوية12) مع درجة نقاء دنيا > 80%، كشكل روتيني التحقق بواسطة تحليل سيتوميتريك. ينطبق الإجراء توسيع الخلية المفصلة أدناه على مختلف المجموعات الفرعية في اللمفاويات البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجرى الإجراء التي تشمل الحيوان المواضيع التالية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (اتفاق #00186.02؛ ولجنة الأخلاقيات الإقليمية لوار de la يدفع [فرنسا]). وكانت ببمكس البشرية المعزولة من الدم التي جمعت من الجهات المانحة صحية مستنيرة (المؤسسة الفرنسية دو سانغ نانت، فرنسا). يتم تنفيذ كافة الخطوات تحت ظروف معقمة.
1-غير محددة توسيع لمفاوية المستجيب السامة للخلايا T
- إعداد وتشعيع الخلايا المغذية في غراي 35. للحث على 2 × 105 -4 × 105 خلايا المستجيب، وإعداد ببمكس 10 × 106 و 1 × 106 بلكلس من ثلاث جهات مانحة متميزة وصحية.
- ريسوسبيند تغذية الخلايا والخلايا المستجيب في 15 مل ربمي تستكمل مع السفح إبطال الحرارة 10%، 2 مم ل الجلوتامين، البنسلين (100 وحدة دولية/مل)، وستربتوميسين (0.1 ميكروغرام/مل) والمؤتلف إيل-2 300 وحدة دولية/مل.
- إضافة فا-L بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل والمزيج بعناية، وتوزيع 150 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحات القاع ش 96-جيدا.
- احتضان عند 37 درجة مئوية ومع 5% CO2 في جو هوميديفيد.
- فحص اللوحة يوميا حتى الخلية الكبيرة كتل النموذج في آبار الثقافة (~ يوم 7).
- نقل الخلايا إلى قارورة ثقافة في 1 × 106 خلايا/مل في مستنبت الطازجة.
- تحديد عدد الخلايا الإجمالي عن طريق العد (2 × أسبوع) والحفاظ عليها في 1 × 106 خلايا/مل في مستنبت الطازجة.
ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا المناعية المستجيب جاهزة للإدارة العلاجية في حالة راحة (عادة 3 أسابيع بعد التحفيز التضخيم الأولية). يجب التحقق من النقاء والتفاعلية من هذه الخلايا المستجيب قبل الحقن المسجل في فيفو (مثلاً، مع فحوصات في المختبر ).
2. إعداد خلايا المستجيب قبل العملية
- بعد التحقق من عدد خلايا المستجيب، جمع الخلايا المستجيب في أنبوب 50 مل بالطرد المركزي (300 x ز لمدة 5 دقائق).
ملاحظة: للتعويض عن أي خسارة، يعد وجود فائض خلايا (مثلاً، 50 × 106). - إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 15 مل العقيمة برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ز لأداء الغسيل بعناية.
- بعناية وبشكل كامل إزالة المادة طافية وثم ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل PBS العقيمة.
- نقل الخلايا ريسوسبينديد في microtube 1.5 مل للطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
- بعناية وبشكل كامل إزالة المادة طافية بيبيتينج ببطء.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 8 ميليلتر من PBS العقيمة للماوس.
ملاحظة: هذا خطوة حاسمة. - قياس حجم تعليق خلية باستخدام ميكروبيبيتي. إذا لزم الأمر، إضافة PBS العقيمة (20 × 106 خلايا في 15 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للجرعة) وتخلط بعناية.
- الاختيار، باستخدام ميكروبيبيتي، أن الحجم النهائي للماوس ما بين 15 و 20 ميكروليتر (ضرورات < 20 ميليلتر).
- تبقى الخلايا على الجليد حتى حقن المناظير باستخدام الأشعة.
ملاحظة: لم يتم اختبار أكثر من 3-ح تيميبوينتس.
3-المناظير باستخدام الأشعة حقن
-
معدات الإنشاء
- تجميع ومعايرة إطار المناظير باستخدام الأشعة حيوانات صغيرة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ضمان دقة الحقن داخل الجمجمة (مثلحجم المحاقن، والتخزين المطلوبة ومعدل الحقن).
ملاحظة: يوصي بمعدل تسريب بطيء (أي، 2-3 ميليلتر/دقيقة). - تثبيت المواد تحت مجلس الوزراء سلامة الميكروبية (MSC) للحفاظ على العقم الصكوك وحماية الفئران من العدوى.
ملاحظة: مكان "الكتل متحاور" في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ويحد هذا النظام انخفاض حرارة الجسم الفئران خلال الجراحة. يجب أن تستخدم التدفئة منصات، والتي ضرورية للرعاية ما بعد الإجرائي، أثناء رصد درجة الحرارة المستمرة.
- تجميع ومعايرة إطار المناظير باستخدام الأشعة حيوانات صغيرة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ضمان دقة الحقن داخل الجمجمة (مثلحجم المحاقن، والتخزين المطلوبة ومعدل الحقن).
-
إعداد الحيوانات قبل العملية
- تخدير ماوس بحقنه داخل من الكيتامين (10 مغ/مل) وإكسيلازيني (0.1 مغ/مل) في 10 ميليلتر/غرام من وزن الجسم للماوس.
- إجراء اختبار قرصه أخمص القدمين لضمان التخدير الكامل والتسكين للحيوان.
ملاحظة: أي حركة هذا مؤشر التسكين غير العميقة، وإذا حدث ذلك، بضع دقائق إضافية مطلوبة قبل تكرار العملية. - حالما يتم تخديره الماوس بشكل صحيح، استخدم المقص لإزالة الفراء من موقع العمليات الجراحية (بين الأذنين اثنين، وتصل إلى الآنف).
-
إعداد الخلية قبل العملية
- عناية ريسوسبيند الخلايا مع ماصة (عدة مرات) قبل كل حقنه لمنع أي خلية التثاقل.
- رسم بعناية حجم تعليق الخلية المطلوبة (15-20 ميليلتر) في ميكروسيرينجي 22-ز لتجنب تطلع فقاعات.
ملاحظة: هذه الخطوة تحميل خلية إلى ميكروسيرينجي مهم لتقليل الفروق في حجم المحقون. تحميل خلايا لكل حقن الفردية بين إجراءات لمنع أي خلية التثاقل والتأكد من عدد زوجي من إدارة خلايا المستجيب في الفوج. - ثم، ضع المحاقن في ضخ حقنه تكييفها.
-
الرعاية الإجرائية
- تطهير الموقع الجراحي مع مسحات غارقة في بوفيدون حل 5% على الأقل من 3 س.
- ضع مرهم العيون التشحيم في العيون الماوس لمنع أي جفاف القرنية.
- موقف الماوس أنيسثيتيزيد على الإطار المناظير باستخدام الأشعة، على كتلة متحاور حارة مغطاة غلاف بلاستيكي معقم الحفاظ على درجة الحرارة للماوس أثناء الجراحة، والحد من الوفيات.
ملاحظة: الماوس في الآنف والأسنان ينبغي مناسب وضع أعلاه شريط الأسنان، لضمان تدفق كاف في الجهاز التنفسي أثناء الإجراء. - حالما يتم وضع الماوس فوق شريط الأسنان، تشديد أشرطة الإذن بشدة تحت الأذنين الماوس شل الرأس.
ملاحظة: كن حذراً لا ضرر في طبلة الإذن أو التوصل إلى حل وسط في التنفس. - جعل شق جلد السهمي خط الوسط 1-2 سم مع مقص معقم على طول الجزء العلوي من الجمجمة من عرفت الخلفي لفضح الجمجمة.
- تحديد تقاطع خيوط السهمي والاكليليه (بريجما) ليكون بمثابة معالم للتعريب المناظير باستخدام الأشعة قبل الحقن (كما هو موضح في الشكل 1).
- مكان ميكروسيرينجي فوق هذه النقطة.
- تحريك ميكروسيرينجي 2 حق الأفقي و 0.5 ملم الأمامي بريجما.
- استخدام ميكرودريل، جعل ثقب صغير في الجمجمة مع قليلاً حفر عقيمة في إحداثيات محددة سلفا. احرص على أن تظل سطحية بغية تجنب أي الإصابات الرضية للدماغ.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم حقن الخلايا المناعية داخل ورم المنشأة (أسبوع واحد بعد حقن الخلايا السرطانية). ينبغي أن يكون الجلد أعيد فتحها (ندبة) والحقن تتم في نفس الإحداثيات المستخدمة لزرع خلايا الورم (الثقب عموما لا تزال موجودة تصل إلى 2 أسابيع بعد الحقن). واختيرت الإحداثيات لحقن الخلايا السرطانية والمستجيب في الدماغ حمة13،14.
-
حقن الخلايا المناعية المستجيب
- عناية إدراج ميكروسيرينجي في حفر حفرة، وتتحرك ببطء، إلى الأمام الإبرة 3 أسفل في دوراً وثم الخلف 0.5 ملم بعمق 2.5 مم قبل حقن الخلايا المستجيب نهائي.
- تشغيل حقن الخلية المستجيب في 2-3 ميليلتر/دقيقة ومراقبة على طول الوقت حقن الفئران.
- بمجرد اكتمال الحقن، سحب الإبرة عن 1 مم فقط والحفاظ ميكروسيرينجي في المكان لمدة دقيقة واحدة إضافية قبل أن تنسحب ببطء تماما ميكروسيرينجي، لمنع أي تسرب من موقع التسريب.
ملاحظة: بعد إزالة الحيوان من جهاز المناظير باستخدام الأشعة، فورا تنظيف معدات الحقن للتجارب القادمة.
-
الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية والمتابعة للماوس
- إزالة الحيوان من الإطار المناظير باستخدام الأشعة وفورا تطبيق الحل 5% بوفيدون على موقع شق وإغلاق الجلد خياطة جراحية مناسبة.
- تطبيق هلام ليدوكائين 2% مباشرة على الجرح وإدارة 0.15 ميكروغرام/غرام من البوبرينورفين الحقن تحت الجلد لتسكين ما بعد الإجرائي.
- المكان مرة أخرى تعيين الماوس أنيسثيتيزيد إلى قفصة فوق وسادة تدفئة إلى 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة جسم مناسب ماوس وتجنب أي انخفاض درجة حرارة الجسم.
ملاحظة: الإسكان منفصلة غير ضروري. - رصد الماوس حتى أنه هو تعافي تماما من التخدير، وأنه نقل إلى غرفة لسكن.
ملاحظة: حتى الآن، هذا البروتوكول أيضا معتمد كما حدثت تعقيدات غير متوقعة القليلة (< 5 في المائة من حقن الفئران). - يوميا مراقبة الفئران و euthanize لهم عند ملاحظة أي علامات الصحة المتدهورة (مثلاً، موقف متحدب، حركية، السجود، أو هيئة كبيرة لتخفيف الوزن [≥ 15%]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصف هذه الدراسة استراتيجية نقل التبني المستجيب المناعي الخلوي الخلايا داخل دماغ الفئران الحاملة للورم، استناداً إلى المناظير باستخدام الأشعة الحقن مباشرة داخل السرير الورم.
للحد من أي خطر لإصابة في الدماغ المرتبطة بكمية كبيرة من حقن، تعليق خلية المستجيب يحتاج إلى تركيز (20 × 106 خلايا في 15-20 ميليلتر من برنامج تلفزيوني). للتحقق من ما إذا كانت هذه الخطوة تركيز الخلية قد تؤثر على بقاء خلايا المستجيب، وأعدت وفقا لبروتوكول وصف هذه الخلايا وتحميلها في ميكروسيرينجي. وجمعت خلايا المستجيب فورا، أو 10 دقيقة بعد تحميلها إلى ميكروسيرينجي. كانت ملطخة الخلايا يوديد propidium (PI)، عامل إينتيركالاتينج نيون الحمض النووي لا بيرمينت العيش الخلايا وتم تحليلها بالتدفق الخلوي في مختلف تيميبوينتس (0 و 24 و 72 ساعة). وتبين النتائج أن الإعداد والتحميل إلى ميكروسيرينجي لا تؤثر تأثيراً كبيرا على بقاء خلايا المستجيب لمدة 24 ساعة على الأقل (الشكل 2 ألف و 2 باء). في 72 ساعة، لوحظ حدوث زيادة طفيفة، ولكن غير الهامة، الخلاياإيجابية PI (14 في المائة مقارنة بنسبة 11% لإلغاء تحميل خلايا). بطريقة مماثلة، وقد تم تحليل مفاعليه انتيتومور المستجيب الخلايا التي تم إعدادها والإبقاء على الجليد لمدة 3 ساعات. كانت كوكولتوريد خلايا المستجيب مع خلايا ورم الدماغ لمدة 4 ساعات في حضور ماب CD107a مكافحة. أوبريجوليشن علامة التنشيط CD107a، مماثلة للقيمة التي تم الحصول عليها في ظروف السيطرة، تشير إلى أن لا يتأثر مفاعليه خلايا المستجيب بالإعداد والتحميل إلى ميكروسيرينجي (الشكل 2).
لتقييم ما إذا كانت خلايا المستجيب البقاء على قيد الحياة والتحرك داخل حمة الدماغ بعد ما زرع داخل الأورام، والمستجيب 20 × 106 تم حقن الخلايا في موقع الورم الفئران تحمل ورم الدماغ (GBM-111). أسبوع واحد في وقت لاحق، تم جمع العقول، الثابتة ومقطعة، والملون لتلوين الهيماتوكسيلين ويوزين وسافران (هس) والإنسان المضادة CD3 ماب (المدينة). تلوين هس تحديد هيكل أورام الدماغ (الشكل 3، ترك الفريق). تلطيخ CD3 المحددة والمترجمة لمفاوية T المناعية المستجيب (هنا، خلايا تي Vϒ9Vδ2 البشرية) (الشكل 3، اللوحة اليمنى). من المثير للاهتمام، تم اكتشاف الخلايا اللمفية تي المستجيب حول الورم (الشكل 3، لوحة الأيمن العلوي)، في صلب الورم (الشكل 3، اللوحة اليمنى الوسطى)، ولكن أيضا في نصف الكرة الغربي contralateral (الشكل 3، اللوحة اليسرى السفلي). وعلاوة على ذلك، وظيفة اللمفاويات T البشرية المعزولة من المخ الماوس بعد 48 ساعة على حقن (4 × 106 خلايا تي αβ)، التي تمثل 2% خلايا الدماغ، وقد تم تحليل. النتائج تشير إلى أن الخلايا αβ متمكنة تي جمعت المستجيب حقن الدماغ توسيع وتتكاثر عليها تنشيط خلايا فا-تغذية غير محددة يؤديها حضور إيل-2 (الشكل 4).
معا، هذه النتائج تظهر أن الخلايا المستجيب تي أعدت وتدار تحت هذه الإجراءات البقاء على قيد الحياة لمدة ساعة في الدماغ، ويمكن القيام بدوريات داخل الورم وأنسجة المخ السليمة. استخدمت هذه الإجراءات لتقييم كفاءة الإدارات المناظير باستخدام الأشعة العلاجية للخلايا Vϒ9Vδ2 T يستريح الإنسان متمكنة انتيتومور للتحكم في التنمية البشرية GBM الدماغ، أورام9،11. هذه أدلة الدراسات أن حقن لمفاوية المستجيب البشرية متمكنة تي في السرير الورم إلى حد كبير تحسين بقاء الفئران تحمل أورام الدماغ. من المثير للاهتمام، لا يحملون الباقين على قيد الحياة الفئران الخلايا السرطانية قابلة للكشف، مما يشير إلى رفض ورم كاملة.
الشكل 1 : صورة للمعالم التشريحية الرئيسية في الجمجمة الماوس. وهذا يشمل السهمي (خط أحمر) وخيوط كرونال (الخط الأزرق) وعلى التقاطع (بريجما) تستخدم لتوجيه في موقع الحقن. تتم الإشارة إلى شريط مقياس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : البقاء على قيد الحياة وتفعيل إعداد لمفاوية المستجيب تي- خلايا المستجيب (هنا، يستريح الإنسان الخلايا Vϒ9Vδ2 T الطرفية) تم تضخيمها وإعداده وفقا للإجراء المبين. تلوين لمفاوية مع يوديد propidium (PI)، أجريت الحمض النووي إينتيركالاتينج مجمع الفلورسنت لا بيرمينت العيش الخلايا، وتنشيط وظيفية. (أ) هذا الفريق يظهر مبعثر مؤامرة ممثل (منتدى التعاون الأمني-ح) الأمام مقابل الجانب (SSC-ح) النابضة لمفاوية المستجيب (غادر الفريق). ويبين الرسم البياني تلطيخ PI من بوابات التحكم لمفاوية (اللوحة اليمنى). يشار إلى أن النسبة المئوية لمفاويةإيجابية PI. (ب) هذا الفريق يبين النسبة المئوية للميت لمفاوية (PIالإيجابية) جمعت فورا (الخط الأزرق الخفيفة) أو بعد 10 دقيقة (الخط الأزرق الداكن) في ميكروسيرينجي، إذا قيست عند تيميبوينتس المشار إليها. واستخدمت كعنصر تحكم، إلغاء تحميل خلايا المعدة (خط رمادي). (n = 3؛ ويعني ± التنمية المستدامة؛ ns = ليس كبيرا.) CD107a (ج) تعبئة السطحية تم قياسه بواسطة التدفق الخلوي أما Vδ2إيجابية تحكم الخلايا (غير مهيأة) أو أعد لمفاوية الإبقاء على الجليد (استعداد + 3 ح) عقب كوكولتوري مع الخلايا ورم الدماغ البشري الأساسي الهدف. يشار إلى أن النسبة المئوية للخلايا الليمفاوية في كل رباعي سيتوميتريك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الكشف وتوطين لمفاوية المستجيب تي داخل دماغ الفئران الحاملة للورم. أسبوع واحد بعد جليوبلاستوما الدماغ ورم زرع الخلايا المناعية المستجيب (هنا، يستريح الإنسان الخلايا Vϒ9Vδ2 T الطرفية) تم حقنها في أدمغة الفئران. أسبوع واحد بعد العلاج إيمونوثيرابيوتيك، والعقول جمع، ثابتة، ومقطوع. أقسام الدماغ كانت الملونة لتحليل إيمونوهيستوتشيميستري (الهيماتوكسيلين، ويوزين، وتلوين سافران [هس]) (اللوحة اليمنى) أو ملطخة بجسم الإنسان المضادة CD3 (اللوحة اليمنى). أظهرت النتائج تمثل ثلاث تجارب مستقلة. تتم الإشارة إلى شريط مقياس.
الشكل 4 : تنشيط الخلايا الليمفاوية المستجيب تي جمعت من دماغ الفئران المعالجة. تم حقن يستريح لمفاوية T البشرية (هنا، الخلايا الليمفاوية البشرية αβ تي 4 × 106 ) في أدمغة الفئران مجموعة موردي المواد النووية. بعد 48 ساعة، جمعت العقول وفصلها. وتم قياس النسبة المئوية لمفاوية T التسلل إلى الدماغ البشري بالتدفق الخلوي استخدام جسم الإنسان المضادة CD3 (اللوحة السفلية). كان المصنف الخلايا المجمعة (10 خلايا في البئر) في لوحات القاع ش 96-جيدا وحفز (فا-تغذية الخلايا وايل-2) لمدة 20 يوما (16 مضاعفة دورات). ملاحظة، في يوم 10، 13.3 بوصة × 106 من الخلايا اللمفية تي البشرية وتم الحصول على (اللوحة اليمنى).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحديد تحويل التبني بشكل أصلي أو خلايا المستجيب مأمن هندسيا يمثل نهجاً واعداً لكفاءة علاج الأورام، مثل سرطان الدماغ إينفيلتراتيفي، العناية بالحد من ريكتيفيتيس ضد الخلايا غير تحويل15، 17،،من 1618. ومع ذلك، النظام العصبي المركزي الذي يشمل الدماغ، قد وضعا محصنة خاصة، لا سيما بسبب وجود حاجز الدم في الدماغ وعدم وجود نظام التصريف اللمفاوي الكلاسيكية19،20. هذه الخصائص الفسيولوجية تؤثر على الاتجار بالانسجة وقد يعرض للخطر المنهجي حقن الخلايا المناعية. للتغلب على هذه العقبات، تم استكشاف حقن intraparenchymal على المبدأ القائل بأن يتم تسليم الخلايا انتيتومور محلياً بدلاً من ذلك، عن كثب إلى موقع الورم، أما بالنسبة للجزئي المجالات الخرز الصغير التي تحتوي على المركبات الدوائية21، 22-من ناحية، تمييع محدودة من الخلايا الليمفاوية داخل الجهاز يمكن تحسين كفاءتها انتيتومور، بل أنه يمكن أيضا تضخيم الميكانيكية أو ورم في التكيف مع الآثار الضارة، مثل ضغط تيسولار، الذي يعكف على طول الدماغ نمو الورم. وهذا يعني أن هذا الإجراء يتطلب كميات صغيرة من حقن إيمونوثيرابيوتيك. هذه المشكلة أكثر حرجا في النماذج التجريبية الحيوانية ولا في الدماغ التي اقتطعت الأورام جراحيا. توضح هذه المقالة نهج علاجية للإعداد وتسليم الدماغ الخاصة بالورم الخلوية المستجيبة، استناداً إلى المناظير باستخدام الأشعة injection(s) من متمكنة من الخلايا اللمفية تي البشرية المحلية.
وتبين هذه الدراسة الإعداد وتسليم ستيريوتاكسيك متمكنة من الخلايا اللمفية تي Vϒ9Vδ2 البشرية في العوز الفئران مجموعة موردي المواد النووية تحمل البشرية GBM تكثيفها. المرحلة الأولى من هذا البروتوكول ويصف إجراءات بسيطة لتضخيم لمفاوية T متمكنة من ببمكس صحية من الجهات المانحة، باستخدام معيار غير محدد فا-مغذيات-IL2 تحفيز التي تنتج كميات كبيرة من الخلايا الليمفاوية المستجيب محض ر، والسماح استخدام العلاجية23،24. أما المرحلة الثانية من هذه المادة يركز على إعداد يستريح المعلقات اللمفاويات T في يوم إدارة ستيريوتاكسيك. تم التركيز خاصة على هذه الخطوة الهامة التي تتطلب كثافة خلوية التي ينبغي أن لا تؤثر على استمرارية والوظيفة للخلايا الليمفاوية المستجيب المحدد تي. وأخيراً، فيما يتعلق بالتجارب في فيفو ، إعداد الخلايا الليمفاوية المستجيب تي وعلى حقن داخل نواة الورم يرتبط بنشرها، ليس فقط داخل الورم حسب وإنما أيضا في أنسجة المخ المحيطة، تسليط الضوء على ما قدرة خاصة للقيام بدوريات وتتبع الخلايا السرطانية الغازية. الأهم من ذلك، تحتفظ هذه أساليب إعداد وحقن قدرة هذه الخلايا اللمفية تي على تفعيلها في الدماغ عند اعتراف محددة من خلايا ورم الدماغ. بالإجمال، هذه الخصائص مقنعة ضمان قدرة الخلايا الليمفاوية T للتحديد وكفاءة استهداف والقضاء على خلايا ورم المخ العميق إينفيلتراتيفي التي سمة مميزة للخليج للحاسبات الآلية25. علما، عناية خاصة أثناء الحقن والتخلص من ميكروسيرينجي اتخاذها للتقليل إلى أدنى حد من أي آفة المخ أو تسرب الخلية المستجيب.
وفي الختام، توضح هذه المقالة إجراء فعال لإيصال كميات كبيرة من متمكنة لمفاوية المضادة للورم البشري، مثل يستريح الإنسان Vϒ9Vδ2T لمفاوية، داخل المنطقة المجاورة لاورام الدماغ. الأهم من ذلك، هذا الإجراء العلاجية لا يترافق مع آثار سلبية على اللمفاويات T المحولة (مثلاً، الجدوى، ومفاعليه) أو على أنسجة المخ. وقد أثبتت الدراسات الأخيرة، استناداً إلى نماذج أورثوتوبيك مورين GBM البشرية الأولية، أن الخلايا الليمفاوية Vϒ9Vδ2T تستهدف كفاءة الخلايا الخليج للحاسبات الآلية، بما في ذلك الخلايا السرطانية التي تسللوا إلى عمق9،حمة الدماغ11. هذه العناصر فتح الفرص لتطوير الرواية التبني تي لمفاوية نقل الإجراءات التي يمكن تطبيقها في المقام الأول في الفئران التي تحمل أورثوتوبيك أورام الدماغ، ومن ثم، في الدراسات السريرية في المرضى GBM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون موظفي المستشفى الجامعي الحيوانية المرفق (يوت) نانت لتربية الحيوانات والرعاية والخلوية و tissular التصوير المرافق الأساسية من جامعة نانت (ميكروبيسيل) للتصوير، ومرفق الخلوي (سيتوسيل) من مدينة نانت لخبراء المساعدة التقنية. تم تمويل هذا العمل من INSERM ويزأر، جامعة نانت، معهد السرطان الوطني دو (INCa #PLBio2014-155)، الرابطة الوطنية le مكافحة السرطان (AO الأقاليمي 2017) والاتحاد الأوروبي Transcan2 العصر-صافي (إيمونوجليو). وتمول الفريق بلوس أنجليس من أجل مؤسسة "بحوث ميديكال" (DEQ20170839118). وقد أدركت هذا العمل في سياق لابيكس مكتب المفتش العام ودعم برامج رامي سيستي، قبل "يشرف وكالة الأبحاث الوطنية" دعفينير عن طريق البرامج ANR-11-لابكس-0016-01 و ANR-10-إيبهو-005، على التوالي. رامي-سيستي المشروع تدعمه أيضا نانت متروبول والمنطقة يدفع de la Loire. يشكر المؤلفون رافيا شيرين لتقديم المساعدة في تصحيح هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
