Summary
Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse og stereotaxic administrasjonen av allogene menneskelige lymfocytter i immunodeficient mus bærer orthotopic primære hjernesvulster. Denne studien gir en proof-of-concept for både gjennomførbarhet og antitumor effekten av intrabrain-levert mobilnettet immunotherapies.
Abstract
Glioblastom multiforme (GBM), den mest hyppig og aggressiv primære hjernen kreften i voksne, er vanligvis forbundet med en dårlig prognose knappe effektiv terapi foreslått det siste tiåret. Blant lovende kandidatene for utforming av romanen strategier, mobilnettet immunotherapies har blitt målrettet for å eliminere svært invasiv og kjemoterapi-radioresistant kreftceller, sannsynlig involvert i en rask og dødelig tilbakefall av denne kreften. Dermed administration(s) av allogene GBM-reaktive immun celle effektor, som menneskelige Vϒ9Vδ2 T-lymfocytter, i nærheten av svulsten ville representerer en unik mulighet til å levere effektiv og svært konsentrert terapeutiske agenter direkte inn i området av hjernen malignancies. Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse og stereotaxic administrasjonen av allogene menneskelige lymfocytter i immunodeficient mus bærer orthotopic primære hjernesvulster. Denne studien gir en prekliniske proof-of-concept for både gjennomførbarhet og antitumor effekten av disse mobilnettet immunotherapies som bruker stereotactic injeksjoner av allogene menneskelige lymfocytter i intrabrain svulst senger.
Introduction
GBM (som klasse IV astrocytom), er den mest hyppig og aggressiv primære hjernen kreften hos voksne. Til tross for aggressive behandlinger som kombinerer kirurgi og radio-kjemoterapi, fortsatt GBM knyttet til en ekstremt dårlig prognose (median overlevelse 14,6 måneder og en 2-år-dødelighet > 73%)1. Dette bevis at noen effektiv terapeutiske fremskritt har validert over de siste tiår2. Blant kandidater for design av mer effektive strategier3,4,5, er immunotherapies6 nå undersøkt for å eliminere svært invasiv og radio/chemo-resistant svulst celler, mistenkt for deres viktige bidrag til rask og dødelig svulst tilbakefall7. Ulike potensielle immunologiske mål var identifisert og foreslåtte for immunotherapies, som involverer naturlig eller modifisert αβ eller ϒδ T-lymfocytter som GBM-spesifikke svulst antigener eller stress-indusert molekyler8,9, 10. Muligheten til å administrere valgte GBM-reaktive immun celle effektor representerer en unik mulighet til å levere forhøyede mengder effektor lymfocyttene direkte i stedet for gjenværende kreft. For å støtte denne strategien, har vi nylig vist at modeller basert på immunodeficient mus bærer orthotopic primære menneskelig GBM xenografts trofast recapitulate utviklingen av hjernesvulster i GBM pasienter9,11. Videre ble disse modellene brukt til å demonstrere sterke antitumor effektiviteten av adoptively overførte allogene menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter.
Denne protokollen beskriver kritiske eksperimentelle trinnene for å oppnå stereotactic immunotherapies av hjernen tumorer, for eksempel GBM, basert på adopsjon overføring av allogene T-lymfocytter. Artikkelen viser: (i) forsterkning av terapeutiske allogene immun effektor T-lymfocytter, som menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter; (ii) utarbeidelse av disse effektor T-lymfocytter for injeksjon; (iii) prosedyre for stereotactic administrasjon i hjernen, i nærheten av svulsten. Denne artikkelen gir også innsikt i virkemåten til disse cellulære effektor etter stereotactic injeksjon.
Den terapeutiske tilnærmingen presenteres her er basert på injeksjon av 20 x 106 Effektor celler per dose for hver hjerne svulst-bærende immunodeficient musen. En første i vitro ekspansjon trinn kreves produserer store mengder av immunceller. Derfor ikke-spesifikk celle utvidelser utføres ved hjelp av phytohemagglutinin (PHA-L) og bestrålt allogene mater celler: perifere blod mononukleære celler (PBMCs) fra friske blodgivere og Epstein Barr Virus EBV-forvandlet B-lymphoblastoid celle linjer (BLCLs), avledet fra PBMCs av i vitro infeksjon med EBV inneholder kultur supernatant fra Marmoset B95-8 cellen linje, i nærvær av 1 µg/mL Ciklosporin-A.
GBM-reaktive effektor immunceller er forhold og valgt i vitro analyser9. Disse Effektor celler er aktivert og forsterket ved hjelp av standardprotokoller, ifølge sin natur (f.eks, menneskelige Vγ9Vδ2 T-lymfocytter9 eller menneskelig anti-herpes viruset αβ T-lymfocytter12) med minimum renhet av > 80%, som rutinemessig sjekket av cytometric analyse. Cellen ekspansjon prosedyren nedenfor gjelder ulike menneskelige lymfocytt delsett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyre som involverer dyr temaer ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer (avtalen #00186.02; regional komité av Pays de la Loire [Frankrike]). Menneskelige PBMCs ble isolert fra blodet fra informert friske blodgivere (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankrike). Alle trinnene utføres under sterile forhold.
1. ikke-spesifikk utvidelse av effektor cytotoksiske T-lymfocytter
- Forberede og irradiate mater cellene på 35 Gy. For stimulering av 2 x 105 - 4 x 105 Effektor celler, forberede 10 x 106 PBMCs og 1 x 106 BLCLs fra tre forskjellige, sunn givere.
- Resuspend både mater celler og Effektor celler i 15 mL RPMI med 10% inaktivert FCS, 2 mM L-glutamin, penicillin (100 IU/mL), og streptomycin (0,1 µg/mL) og 300 IU/mL rekombinant IL-2.
- Legger til PHA-L en siste konsentrasjon av 1 µg/mL, nøye blanding, og distribuere 150 µL av cellen suspensjon per brønn i 96-brønnen U bunn plater.
- Ruge på 37 ° C og med 5% CO2 i en fuktet atmosfære.
- Daglig sjekk platen til store celle grupperer skjemaet i brønnene som kultur (~ dag 7).
- Overføre cellene til en kultur kolbe på 1 x 106 celler/mL i frisk kultur medium.
- Fastslå hvor total-cellen ved å telle (2 x i uken) og opprettholde dem på 1 x 106 celler/mL i frisk kultur medium.
Merk: Effektor immunceller bør være klar for terapeutisk administrasjonen på en hvile tilstand (vanligvis 3 uker etter første forsterkning stimulans). Renhet og reaktivitet av disse Effektor celler skal kontrolleres før i vivo injeksjoner (f.eksmed i vitro analyser).
2. pre-operative Effektor celler forberedelse
- Etter å sjekke celletall effektor, samle Effektor celler i en 50-mL tube med sentrifugering (300 x g i 5 min).
Merk: For å kompensere for tap, forberede et overskudd av celler (f.eks, 50 x 106). - Nøye fjerne nedbryting og resuspend cellene i 15 mL steril PBS og sentrifuge for 5 min på 300 x g utføre vask.
- Nøye og fullstendig fjerne nedbryting og deretter resuspend celle pellet i 1 mL steril PBS.
- Overføre resuspended cellene i en 1.5-mL microtube for sentrifugering på 300 x g i 5 min.
- Nøye og fullstendig fjerne nedbryting av pipettering sakte.
- Resuspend celle pellet i 8 µL av sterile PBS per musen.
Merk: Dette er et viktig skritt. - Måle volumet av cellen suspensjon ved hjelp av brønnene. Eventuelt legge sterilt PBS (20 x 106 celler i 15 µL av PBS per dose) og bland forsiktig.
- Sjekk, ved hjelp av brønnene, som det siste bindet per musen er mellom 15 og 20 μL (imperatively < 20 µL).
- Holde cellene på is inntil stereotactic injeksjon.
Merk: mer enn 3-h timepoints ble ikke testet.
3. stereotactic injeksjon
-
Utstyr oppsett
- Montere og kalibrere en liten dyr stereotactic ramme etter produsentens instruksjoner for å sikre nøyaktigheten av intrakranielt injeksjoner (f.eks, sprøyte størrelse, ønsket volum og hastighet på injeksjon).
Merk: En langsom infusjonshastigheten anbefales (dvs.2-3 µL/min). - Installere materialet under en mikrobiell sikkerhet regjering (MSC) å opprettholde sterilitet av instrumenter og beskytte mus fra infeksjoner.
Merk: sted "isotermiske blokkene" i et vannbad på 37 ° C. Dette systemet begrenser nedkjøling av mus under operasjonen. Oppvarming pads, som er nødvendig for etter fremgangsmåter for behandling, må brukes under kontinuerlig temperatur overvåking.
- Montere og kalibrere en liten dyr stereotactic ramme etter produsentens instruksjoner for å sikre nøyaktigheten av intrakranielt injeksjoner (f.eks, sprøyte størrelse, ønsket volum og hastighet på injeksjon).
-
Pre-operative dyr forberedelse
- Bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (10 mg/mL) og xylazine (0,1 mg/mL) på 10 µL/g av kroppsvekt av musen.
- Utfør en tå knipe for å sikre fullstendig anestesi og analgesi av dyret.
Merk: Enhver bevegelse er en indikasjon på ikke-dyp analgesi, og hvis det skjer, noen få minutter er nødvendig før gjenta operasjonen. - Når musen er riktig anesthetized, bruk saks for å fjerne fur fra det kirurgiske området (mellom to ørene, opp nesen).
-
Pre-operative celle forberedelse
- Nøye resuspend cellene med en pipette (flere ganger) før hver injeksjon for å hindre en celle clumping.
- Nøye trekke nødvendig celle suspensjon volumet (15-20 µL) i 22-G microsyringe å unngå aspirasjon av bobler.
Merk: Denne cellen-lessing steg inn i microsyringe er viktig å minimere avvik i injisert volumer. Reload celler for hver enkelt injeksjon mellom prosedyrer å hindre en celle clumping og sikre et likt antall Effektor celler administrasjon i kohorten. - Deretter plassere sprøyten til tilpasset sprøytepumpen.
-
Fremgangsmåter for behandling
- Desinfiser det kirurgiske området med vattpinner dynket i povidon-jod 5% løsning minst 3 x.
- Plass en smørende ophthalmica salve i musen er øyne å hindre noen tørking av hornhinnen.
- Posisjon bedøvet musen på stereotactic rammen, på en varm isotermiske blokk dekket med en steril plast brytes å opprettholde musen er temperatur under operasjonen og begrense dødeligheten.
Merk: Musen er nese og tenner bør riktig plasseres over baren tann å sikre tilstrekkelig åndedretts flyt under prosedyren. - Når musen er plassert over baren tann, stram øret barer fast under musen er ører til nakkens hodet.
Merk: Pass på å ikke skade trommehinnene eller kompromiss åndedrett. - Gjøre en 1-2 cm midtlinjen sagittal huden snitt med sterilt saks langs den øvre delen av kraniet fra fremre bakre å avsløre skallen.
- Identifisere skjæringspunktet mellom sagittal og koronale bildet (Bregma) å tjene som landemerker for stereotactic lokalisering før injeksjon (vist i figur 1).
- Sett microsyringe over dette punktet.
- Flytte microsyringe 2 mm rett laterale og 0,5 mm fremre av Bregma.
- Bruke en microdrill, lage et lite hull i skallen med en bakteriefri borekronen ved forhåndsbestemt. Pass på å være overfladisk for å unngå en traumatisk skade av hjernen.
Merk: I denne protokollen, immunceller ble injisert i en etablert svulst (en uke etter svulst celle injeksjon). Huden bør være gjenåpnet (scar) og injeksjon utføres med koordinatene brukes for svulst celle implantation (hullet er generelt fremdeles opp til 2 uker etter injeksjon). Koordinater ble valgt for sprøytebruk svulsten og Effektor celler i hjernen parenchyma13,14.
-
Injeksjon av immun Effektor celler
- Nøye inn i microsyringe de boret hullet, og beveger seg sakte, videresende nålen 3 mm ned i dura og deretter bakover 0,5 mm til en siste dybde på 2,5 før injisere Effektor celler.
- Kjør effektor celle injeksjon på 2-3 µL/min og overvåke musene langs injeksjon tiden.
- Når injeksjon er fullført, trekke nålen for bare 1 mm og holde microsyringe i stedet for en ekstra minutt før sakte helt microsyringe, for å hindre alle lekkasje fra webområdet infusjon.
Merk: Etter fjerning av dyret fra stereotactic enheten, umiddelbart rent sprøyteutstyr for kommende eksperimenter.
-
Postoperativ omsorg og oppfølging av mus
- Fjerne dyret fra stereotactic rammen og umiddelbart bruke povidon-jod 5% løsning på webområdet snitt og lukke huden med en passende kirurgisk Sutur.
- Bruk 2% lidocaine gel på såret og administrere 0,15 µg/g av buprenorfin ved en subcutaneous injeksjon for etter fremgangsmåter for analgesi.
- Sted tilbake bedøvet musen buret sitt over en varmeputen satt til 37 ° C å opprettholde en passende musen kroppstemperatur og unngå alle nedkjøling.
Merk: Separate boliger er ikke nødvendig. - Dataskjerm musen før det er helt tilbake fra anestesi og overføre den til en bolig-rom.
Merk: Hittil denne protokollen er godt støttet som noen uforutsette komplikasjoner har skjedd (< 5% av injisert mus). - Daglig overvåke mus og euthanize dem når sviktende helse tegn er observert (f.eks, sammenkrøket holdning, redusert mobilitet, sammenbrudd eller vesentlige kroppens vekttap [≥ 15%]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien beskriver strategi adoptivforeldre overføringer av mobilnettet immunforsvaret Effektor celler i hjerne svulst-bærer mus, basert på stereotactic injeksjoner utført direkte i svulst sengen.
For å minimere risiko for hjerneskade forbundet med store injeksjon volum, må effektor celle suspensjon være konsentrert (20 x 106 celler i 15-20 µL av PBS). Hvis du vil kontrollere om denne cellen konsentrasjon trinn kan påvirke levedyktigheten til Effektor celler, var disse cellene utarbeidet etter beskrevet protokollen og lastet inn i microsyringe. Effektor celler ble samlet umiddelbart eller 10 min etter laste dem inn i microsyringe. Cellene var farget med propidium iodide (PI), en fluorescerende DNA intercalating agent som ikke permeant å leve celler og analysert av flowcytometri på forskjellige timepoints (0, 24 og 72 timer). Resultatene viser at utarbeidelsen og lasting i microsyringe betydelig ikke påvirker levedyktigheten til Effektor celler i minst 24 timer (figur 2A og 2B). På 72 timer, ble en liten, men ikke betydning, økning av PIpositiv celler observert (14% sammenlignet med 11% for losset celler). På en lignende måte, ble den antitumor reaktivitet Effektor celler som ble utarbeidet og vedlikeholdes på isen i 3 timer analysert. Effektor celler var cocultured med hjerne svulst cellene i 4 timer i nærvær av en anti-CD107a mAb. Oppregulering av aktivisering merket CD107a, lik verdien i kontrollen forhold, angir at reaktivitet Effektor celler ikke påvirkes av utarbeidelsen og lasting i microsyringe (figur 2C).
For å vurdere om Effektor celler overleve og flytte i hjernen parenchyma etter sine intra-tumoral implantasjon, 20 x 106 effektor ble celler injisert i svulst området mus bærer en hjernesvulst (GBM-1-11). En uke senere, ble hjernen samlet, fast, delt og farget for hematoxylin, eosin og safran coloration (HMS) og anti-CD3 mAb (IHC). HMS coloration identifisert strukturen i hjernesvulster (Figur 3 venstre panel). Den CD3 flekker identifisert og lokalisert effektor immun T-lymfocytter (her, menneskelige Vϒ9Vδ2 T celler) (Figur 3 høyre panel). Interessant, ble effektor T-lymfocytter oppdaget rundt svulsten (Figur 3, øvre høyre panel) i svulst kjernen (Figur 3 midten høyre panel), men også i den kontralateral halvkulen (Figur 3, nederst høyre side). Videre ble funksjonen av menneskelige T-lymfocytter isolert fra mus hjernen 48 timer etter deres injeksjon (4 x 106 αβ T celler), hvorav 2% av hjernecellene, analysert. Resultatene indikerer at samlet hjernen-injisert effektor allogene αβ T celler utvide og sprer på en uspesifisert PHA-materen celler aktivisering utført i nærvær av IL-2 (Figur 4).
Sammen viser disse resultatene at celler effektor T forberedt og administreres under disse prosedyrene overleve timevis i hjernen og kan patruljere svulst og sunn hjernens vev. Disse prosedyrene har blitt brukt for å vurdere antitumor effektiviteten av terapeutiske stereotactic administrasjoner allogene menneskelige hvile Vϒ9Vδ2 T celler for å styre utviklingen av menneskelig GBM hjernen svulster9,11. Disse studier bevis at injeksjoner av allogene menneskelige effektor T-lymfocytter i svulst seng forbedre overlevelse av mus bærer hjernesvulster. Interessant, bærer gjenlevende mus ikke synlig kreftceller, noe som indikerer en komplett svulst avvisning.
Figur 1 : Bilde av de viktigste anatomiske landemerkene på musen skallen. Dette inkluderer sagittal (rød linje) og Koronal (blå linjen) suturer og skjæringspunktet (Bregma) brukes til å orientere injeksjonsstedet. Baren skala er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Overlevelse og aktivering av forberedt effektor T-lymfocytter. Effektor celler (her, hvile menneskelige eksterne Vϒ9Vδ2 T celler) ble forsterket og utarbeidet etter beskrevet prosedyren. Flekker av lymfocytter med propidium iodide (PI), en DNA intercalating fluorescerende stoff som ikke er permeant å leve celler og funksjonelle aktivisering ble utført. (A) dette panelet viser en representant tomt fremover (FSC-H) versus side (SSC-H) scatter gating av effektor lymfocyttene (venstre panel). Histogrammet viser den PI flekker av gated kontroll lymfocytter (høyre side). Prosentandelen av PIpositiv lymfocytter er angitt. (B) dette panelet viser prosentandelen av død lymfocytter (PIpositiv) samlet umiddelbart (lys blå linjen) eller etter 10 min (mørk blå linjen) i microsyringe, målt på det angitte timepoints. Som kontroll, losset forberedt celler ble brukt (grå linjen). (n = 3; mener ± SD, ns = ikke betydelig.) (C) CD107a overflaten mobilisering ble målt ved flowcytometri på enten Vδ2positive kontroll celler (uforberedt) eller forberedt lymfocytter på isen (forberedt + 3 h) etter en coculture med mål primære menneskehjernen kreftceller. Prosentandelen av lymfocytter er angitt i hver cytometric kvadrant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Deteksjon og lokalisering av effektor T-lymfocytter i hjerne svulst rentebærende mus. En uke etter glioblastom hjerne svulst implantasjon, effektor immunceller (her, hvile menneskelige eksterne Vϒ9Vδ2 T celler) ble injisert i hjernen av mus. En uke etter immunterapeutisk behandling, var hjernen samlet, fast og delt. Hjernen deler var farget for immunohistochemistry analyse (hematoxylin, eosin og safran [HMS] farge) (venstre panel) eller beiset med anti-CD3 antistoff (høyre side). Resultatene som vises er tre uavhengige eksperimenter. Baren skala er angitt.
Figur 4 : Aktivering av effektor T-lymfocytter samlet fra hjernen behandlet mus. Hvile menneskelige T-lymfocytter (her, 4 x 106 menneskelige αβ T-lymfocytter) ble injisert i hjernen av NSG mus. Etter 48 timer var hjernen samlet og avstand. Prosentandelen av menneskelige hjerne-infiltrere T-lymfocytter ble målt av flowcytometri bruker et anti-CD3 antistoff (nedre panelet). Det avhentet celler var frø (10 celler/vel) i 96-brønnen U bunn plater og stimulert (PHA-materen celler og IL-2) for 20 dager (16 dobling sykluser). Note, på dagen 10, 13,3 x 106 av menneskelige T-lymfocytter ble innhentet (høyre side).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En adopsjon overføring av valgt innfødt eller utviklet immun Effektor celler representerer en lovende tilnærming til å effektivt behandle svulster, infiltrasjon hjernen kreft, ta vare på begrense reactivities mot ikke-transformert celler15, 16,17,18. Det sentrale nervesystemet, som omfatter hjernen, har imidlertid en bestemt immun rang, spesielt på grunn av eksistensen av blod - hjerne barrieren og mangel på en klassisk lymfedrenasje systemet19,20. Funksjonene fysiologiske påvirker vev smugling og kan kompromittere systemisk injeksjoner av immunceller. For å overvinne disse hindringer, utforsket intraparenchymal injeksjoner på prinsippet om at antitumor celler heller lokalt leveres, nært til svulst området, som for mikrosfærer som inneholder farmakologiske forbindelser21, 22. på den ene siden begrenset fortynning av lymfocytter i orgelet kan forbedre antitumor effektiviteten, men det kan også forsterke skadelige mekanisk eller tumor tilpasning effekter, for eksempel tissular-komprimering, som utvikler langs hjernen tumor vekst. Dette innebærer at denne fremgangsmåten krever små mengder immunterapeutisk injeksjoner. Problemet er enda mer kritisk dyr eksperimentelle modeller i som hjernen svulster ikke kan være inngrep forbrukeravgift. Denne artikkelen beskriver en terapeutisk tilnærming for utarbeidelse og lokal levering av hjerne svulst-spesifikke cellulære effektor, basert på stereotactic injection(s) av allogene menneskelige T-lymfocytter.
Denne studien viser forberedelse og stereotaxic levering av allogene menneskelige Vϒ9Vδ2 T-lymfocytter i immunodeficient NSG mus bærer menneskelig GBM xenografts. Den første fasen av denne protokollen beskriver en enkel prosedyre for forsterke allogene T-lymfocytter fra PBMCs sunn givere, bruke en standard uspesifikke PHA-forer-IL2 stimulering som produserer store mengder rent effektor T-lymfocytter, slik at deres terapeutiske utnyttelse23,24. Den andre fasen av denne artikkelen fokuserer på utarbeidelsen av hvile T lymfocytt suspensjoner på dagen for stereotaxic administrasjon. Et særlig fokus ble plassert på dette viktig skritt som krever en høy mobilnettet tetthet som ikke bør påvirke levedyktighet og funksjonen til de valgte effektor T-lymfocyttene. Til slutt om i vivo eksperimenter, utarbeidelse av effektor T-lymfocytter og deres injeksjon i svulst kjernen er forbundet med deres formidling, ikke bare i svulst men også i omkringliggende hjernen vev, fremhever deres bestemt evne å patruljere og spore invasiv kreftceller. Viktigere, beholde metodene forberedelse og injeksjon evnen til disse T-lymfocytter aktiveres i hjernen på en bestemt anerkjennelse av hjernen kreftceller. Sammen disse spennende egenskaper sikre muligheten av T-lymfocytter å spesielt og effektivt målrette og eliminere dypt infiltrasjon hjerne svulst celler som er et kjennetegn på GBM25. Av notatet, en spesiell omsorg må tas under injeksjon og fjerning av microsyringe å minimere eventuelle hjernen lesjonen eller effektor celle lekkasjer.
I konklusjonen, beskriver denne artikkelen en effektiv fremgangsmåte for å levere store mengder allogene menneskelige anti-tumor lymfocytter, som hviler menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter, i nærheten av hjernesvulster. Viktigere, er denne terapeutiske prosedyren ikke sammen med negative effekter på de overførte T-lymfocyttene (f.eks, levedyktighet, reaktivitet) eller på hjernen vev. Nyere studier, basert på murine orthotopic modeller av primære menneskelige GBM, har vist at Vϒ9Vδ2T lymfocytter effektivt målrette GBM cellene, inkludert kreftceller som har dypt infiltrert hjernen parenchyma9,11. Disse elementene åpne muligheter for utviklingen av romanen adoptivforeldre T-lymfocytter overføring prosedyrer som kan brukes i første omgang mus bærer orthotopic hjernesvulster og deretter i kliniske studier i GBM pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker hos University Hospital dyr anlegg (UTE) av Nantes for husdyrhold og pleie, mobil og tissular imaging kjernen anlegg av Nantes University (MicroPICell) for bildebehandling og funksjonen cytometri (Cytocell) fra Nantes for deres ekspert teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut nasjonale du kreft (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le kreft (AO interregionalt 2017) og europeiske konsortiet ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). Teamet er finansiert av Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Dette arbeidet ble realisert i sammenheng med LabEX IGO og IHU-Cesti programmene, støttet av den nasjonale forskning byrået Investissements d'Avenir via programmene ANR-11-LABX-0016-01 og ANR-10-IBHU-005, henholdsvis. IHU-Cesti prosjektet er også støttet av Nantes Metropole og regionen Pays de la Loire. Forfatterne takker Chirine Rafia for å gi hjelp til å korrigere manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
