Summary
ROS intracelular se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la inducción de senescencia celular. Aquí, describimos un análisis sensible para cuantificar los niveles ROS durante la senescencia celular. También ofrecemos protocolos para evaluar el fenotipo secretor asociados a senescencia, que supuestamente contribuye a diferentes disfunciones relacionadas con la edad.
Abstract
Senescencia celular se ha considerado un estado de detención del crecimiento irreversible sobre agotamiento de la capacidad proliferativa o la exposición a tensiones diferentes. Estudios recientes han ampliado el papel de la senescencia celular a varios procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo, la cicatrización de heridas, vigilancia inmune y la disfunción relacionada con la edad del tejido. Aunque la detención del ciclo celular es una característica crítica de senescencia celular, una producción de aumento intracelular de oxígeno reactivo (ROS) las especies también se ha demostrado que juegan un papel importante en la inducción de senescencia celular. Además, estudios recientes revelaron que las células senescentes exhiben actividades potente paracrina sobre vecinos células y tejidos a través de un fenotipo secretorio asociada a la senescencia (spas). Fuerte aumento de interés sobre estrategias terapéuticas contra la senescencia celular hace hincapié en la necesidad de un entendimiento preciso de los mecanismos de la senescencia, incluyendo ROS intracelular y el SASP. Aquí, describimos protocolos para evaluar cuantitativamente los niveles ROS intracelulares durante la senescencia celular inducida por el H-Ras utilizando colorante fluorescente sensible al ROS y citometría de flujo. Además, presentamos las técnicas sensibles para el análisis de la inducción de la expresión del mRNA y la secreción de factores de spas. Estos protocolos pueden aplicarse a diversos modelos de senescencia celular.
Introduction
Más de 50 años, Hayflick y Moorhead revelaron que las células normales entren la detención de crecimiento irreversible sobre el agotamiento de su potencial proliferativo después de un cierto número de divisiones celulares1. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se cree que correlaciona fuertemente con la envejecimiento2. Aunque la erosión progresiva de los telómeros es considerada una de las principales causas de la senescencia replicativa, varias tensiones celulares, tales como daño del ADN, activación oncogénica y estrés oxidativo, se han divulgado para inducir a otro tipo de senescencia celular se llama "envejecimiento prematuro" o "senescencia inducida por estrés". Curiosamente, senescencia prematura desempeña un papel supresor de tumor potente sobre la activación de oncogenes como H-Ras y BRAF. Estudios de modelos de ratón y de tejidos humanos han producido evidencia que eran predominante presentes en las lesiones premalignas donde oncogénica Ras y BRAF se activan pero fueron disminuidos en cánceres malignos que se convirtió de biomarcadores de la senescencia celular Estas lesiones3,4,5. Más allá de su papel en el envejecimiento y la supresión tumoral, senescencia celular se ha demostrado en estudios anteriores para jugar un papel en varios procesos fisiológicos, incluyendo la cicatrización de heridas, reparación de tejidos, vigilancia inmune y desarrollo embrionario6.
Aunque la detención de crecimiento ha sido estudiada extensivamente como un sello de senescencia celular7, un importante cuerpo de evidencia sugiere que esa especie intracelular de oxígeno reactivo (ROS) también contribuye a la senescencia celular8. La elevación de los niveles ROS durante varios tipos de senescencia celular, senescencia replicativa como senectud oncogene-inducida (OIS), originalmente se informó hace décadas9,10. Más directamente, el tratamiento exógeno con una dosis subletal de H2O2 induce senescencia11,12. La inhibición de enzimas barrido ROS como SOD1, también causa senescencia prematura13. En contraste, bajo condiciones de oxígeno ambiente y el aumento de retardo barrido ROS el inicio de la senescencia10,14,15. Sin duda, estos resultados indican que los ROS son mediadores importantes o determinantes de la inducción de senescencia celular. Sin embargo, cómo ROS contribuyen a la inducción de senescencia celular y cómo se elevan los niveles ROS durante la senescencia celular requieren una investigación adicional.
Estudios recientes han revelado que las células senescentes tienen actividades paracrinas potente sobre vecinos células y tejidos a través de una spas16,17. En el tejido envejecido, las células senescentes promoción disfunciones relacionadas con la edad del tejido mediante muchas vías a través de spas además de una disminución Autónoma de las células proliferativas. Factores proinflamatorios como la IL-6, IL-8, TGFβ y metaloproteinasas de matriz (MMPs), secretadas por las células senescentes, causan disfunciones relacionadas con la edad del tejido a través de la alteración de la homeostasis del tejido, destrucción de la arquitectura del tejido, senescencia de las células vecinas e inflamación estéril18,19. Sin embargo, SASPs puede tener efectos beneficiosos dependiendo el contexto biológico. Además, la naturaleza heterogenetic del SASPs depende del tipo de células senescentes y la etapa de la célula, haciendo hincapié en la necesidad de más investigación19.
Aquí, describimos técnicas basadas en citometría rápidos y sensibles para evaluar los niveles ROS intracelulares durante infecciones oportunistas. Además, se introducen métodos para el análisis de los factores de spas mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR) y ELISA.
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Protocol
1. induce senectud Oncogene-inducida
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Preparación de un H-RasV12 retrovirus
- Capa de la placa de cultivo de 100 mm, añadir 2 mL de 0.001% poly-L-lisina/fosfato tampón salino (PBS) por 5 min a temperatura ambiente.
- Retirar la solución de poli-l-lisina, mediante una pipeta de vidrio conectada a una aspiradora y lavar la placa de cultivo, añadir 2 mL de 1 x PBS.
- Placa de 3 x 106 ecotropic BOSC-23 empaquetado sobre la cultura cubierta plato con de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina y cultivo a 37 ° C en un cultivo de tejidos de CO2 incubadora de 1D.
- Al día siguiente, transfectar 2 μg de pBabe puro-H-RasV12 DNA junto con ADN empaquetado retroviral (2 μg de pGAG/pol y 0.25 μg de pVSVG) mediante un reactivo de transfección para 8 h según las instrucciones del fabricante.
- Retirar los medios de comunicación de transfección y añadir 8 mL de medio fresco.
- Después de 48 h, recoger los medios de comunicación que contiene las partículas virales y remueva los restos celulares por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
- Filtro de los medios de comunicación que contiene el virus H-Ras con un filtro de jeringa de 0.45 μm.
Nota: Evite cualquier congelación y descongelación de los sobrenadantes de virus por una infección viral eficaz. Para obtener el mejor rendimiento, use un virus que fue cosechado en el mismo día de la infección.
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Fibroblastos humanos normales de infección WI-38 con el retrovirus de H-RasV12
- Placa de 5 x 104 WI-38 células en una placa de cultivo de 60 mm con DMEM con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina 1 d antes de la cosecha el retrovirus H-RasV12 y cultura de 1 día a 37 ° C.
- Retire el medio de crecimiento al día siguiente y añadir 1 mL de H-RasV12 retrovirus medios. Agregar un adicional 1 mL de medio de cultivo que contiene 2 μl de una solución stock de polibreno (8 mg/mL en agua destilada). Incubar la muestra durante 1 día en un humidificado 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultivo de tejidos.
- Retire la mezcla del retrovirus de H-RasV12 24 h más tarde y lavar las células 2 x con PBS 1 x. Agregar medio de cultivo y tratar las células con 2 μg/mL de puromicina por 2 días en un humidificado 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultivo de tejidos.
- Después de 2 d de selección puromicina, eliminar el medio de crecimiento y lavar las células 2 x con PBS 1 x. Agregar medio de cultivo y de la cultura de las células en un humidificado 37 ° C, 5% CO2 incubadora hasta el tiempo indicado del punto (véase figura 1A para un diagrama esquemático).
2. monitoreo de senescencia mediante tinción de senescencia asociada β-galactosidasa
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Preparar las siguientes soluciones stock.
- Preparar 20 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranosida (X-gal) en dimetil formamida (DMF). La solución a-20 ° C.
- Preparar un tampón de fosfato de sodio ácido cítrico disolviendo 3,377 g de Na2HPO4.7H2O (126 mM) y 0,708 g de ácido cítrico (36,8 mM) en 100 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 6.0, si es necesario.
- Preparar el ferrocianuro de potasio de 0,5 M. Almacenar la solución en la oscuridad a 4 ° C.
- Preparar el Ferricianuro de potasio de 0,5 M. Almacenar la solución en la oscuridad a 4 ° C.
Nota: El pH de la solución de tinción asociados a senescencia de β-galactosidasa (β-gal de SA) es fundamental para obtener resultados precisos.
- Hacer una solución de tinción de β-gal SA de fresca diluyendo la solución madre que contiene NaCl 150 mM, 2 mM de MgCl2, ferrocianuro de potasio 5 mM, Ferricianuro de potasio 5 mM, tampón de fosfato de sodio ácido cítrico 20% (v/v) y 1 mg/mL de X-gal.
- Quitar los medios de cultivo y lavar las células 1 x con PBS 1 x. Fijar las células con formaldehído al 3% durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Nota: Las células que no están infectadas con el retrovirus puede usarse como un control negativo. Las células control no infectado deben seguir pasados para mantener su condición de proliferación. - Retirar la solución de fijación de las células y lavar con PBS 1 x. Añadir recién preparado 1 SA β-gal tinción solución x (1,5 mL en una placa de cultivo de 60 mm). Selle el plato con una película de parafina para evitar que se sequen e incubar por 24 h a 37 ° C. Por otra parte, incuban los platos juntos en una cámara de humedad.
Nota: La solución fijadora formol 3% debe eliminarse como residuos peligrosos. Una incubadora sin CO2 es deseable, para evitar cambios de pH durante la incubación. - Comprobar el estado de coloración de las células bajo un microscopio en el día siguiente; Las células β-gal-positive SA aparecen azul en la región perinuclear.
Nota: Las células proliferantes de control muestran una baja frecuencia de las células β-gal-positive SA. Si la tinción es demasiado ligera, continuar la incubación durante un período ligeramente más largo (ver figura 1B para ejemplos representativos). - Adquirir una imagen tinción de β-gal SA con una cámara CCD con un 10 X o mayor objetivo. Capturar un número suficiente de imágenes para calcular el porcentaje de tinción (> 200 células).
- Calcular el porcentaje de células β-gal-manchadas SA cuantificando el número de las células β-gal-positive del SA con respecto al número total de células.
Nota: Tinción de β-gal SA debe repetirse independientemente por lo menos 3 x y los valores medios se calculará basado en los resultados de los experimentos de replicación (figura 1 C). La densidad celular apropiado es crítica para el experimento tinción de β-gal SA. Una confluencia alta puede interferir con el cambio a una morfología asociada a la senescencia e inducir una señal de falsos positivos en las células del control.
3. cuantificación de una inducción de especies reactivas de oxígeno durante la senescencia inducida por Ras H
- Placa de 2 x 105 WI-38 células en un cultivo de 60 mm plato y provocan la senescencia inducida por Ras H tal como se describe en el paso 1.
Nota: Este protocolo se puede aplicar a otros tipos de modelos de senescencia celular. - Retire el medio de cultivo en el momento indicado (2, 4 o 6 días) y lavar las células con PBS 1 x. Separar las células tratando con 1 mL de solución de tripsina/EDTA 0.05% y desactivar la tripsina añadiendo 1 mL de medio de cultivo que contiene 10% FBS. Determinar el número de celular.
- Transferencia de 1 x 105 células en un tubo cónico de 15 mL y recoger las células por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
- Preparar fresca 2', 7'-dichlorofluorescin diacetato (DCF-DA) tinción los medios de comunicación mediante la adición de 50 μl de 10 mM DCF-DA a 10 mL de medio de cultivo (la concentración de trabajo de DCF-DA es de 50 μm).
Nota: DCF-DA es sensible a la luz. Debe evitarse la exposición a la luz. La concentración de DCF-DA y el tiempo de tinción puede ajustarse dependiendo del tipo de célula. - Retire el medio de crecimiento con cuidado el tubo cónico de 15 mL y añadir 1 mL de medio de tinción de DCF-DA recién preparada. Cuidadosamente Resuspender el precipitado de células e incubar a 37 ° C por 30 min en la oscuridad. Incluyen una muestra de no manchado como un control negativo de la tinción.
Nota: Proliferación células no teñidas con DCF-DA deben ser preparadas como un control negativo. - Recoger las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min y lavar 1 x con 2 mL de PBS 1 x. Resuspender las células con 1 mL de PBS 1 x y transferir la muestra a la celda activada por fluorescencia adecuada clasificación tubo (FACS).
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Mida la 2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCF-DA) señal de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo equipado con una fuente laser apropiado. Excitar las muestras con un láser azul (488 nm) y detectar la fluorescencia emitida con un detector de nm 530 ± 30 (FITC) usando una escala logarítmica.
- Analizar primero las células del control negativo no manchados. En una parcela de punto de forward scatter (FSC) versus lateral scatter (SSC), seleccionar células vivas usando una herramienta bloquea y elimina las células muertas y restos celulares.
Nota: El cambio de tamaño de célula debe ser supervisado cuidadosamente en la trama de punto de FSC y SSC. Si el tamaño de las células senescentes se aumenta perceptiblemente, la intensidad de DCF-DA debe compararse en poblaciones de células del mismo tamaño después que bloquean en la trama de punto de FSC y SSC. - En un histograma del solo-parámetro Mostrar DCF-DA (488 nm) fluorescencia en la escala logarítmica de la x-eje y el número de eventos (número de células) en la escala lineal del y-axis, ajustar la tensión del laser de 488 nm para colocar el pico de las células no teñidas en el borde izquierdo.
- La DCF-DA manchado las muestras y registramos eventos al menos 10.000 para cada muestra a analizar. Adquirir el valor de la media de la fluorescencia de cada muestra utilizando el software de análisis específico para el citómetro de flujo.
Nota: Las mediciones de ROS deben repetirse independientemente por lo menos 3 x y los valores promedio se calculará a partir de estos resultados. Senescencia inducida por Ras representante H resultados se muestran en la figura 2.
- Analizar primero las células del control negativo no manchados. En una parcela de punto de forward scatter (FSC) versus lateral scatter (SSC), seleccionar células vivas usando una herramienta bloquea y elimina las células muertas y restos celulares.
4. cuantificación de IL-6 y la expresión del mRNA de la IL-8 por senescencia asociada a secreción fenotipo análisis usando una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real
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Preparación de RNA total
- Placa de 3 x 105 WI-38 células en un cultivo de 100 mm plato en DMEM con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina y de la cultura les a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos para 1 día. Preparar cultivos duplicados para cada punto del tiempo.
- Inducir la senescencia por infectar las células con el retrovirus de H-RasV12 como se describe en el paso 1.
- 1 día antes de la cosecha, lavar las células 2 x con PBS 1 x y añadir 3 mL de DMEM sin SFB.
Nota: Este paso se lleva a cabo para producir el medio acondicionado usado para ELISA como se describe en el paso 5. Hambre de suero puede inducir la expresión de mRNAs IL-6 e IL-8 en algunas células sensibles. Así, la IL-6 y la expresión del mRNA de la IL-8 en células cultivadas con y sin hambre de suero se deben comparar inicialmente. Si hambre suero induce cambios significativos en la expresión de la IL-6 o IL-8 ARNm, el ARN total para qPCR y el medio condicionado de ELISA deben prepararse por separado. - Recoger el medio condicionado de cada muestra 24 h más tarde y almacenar el medio a-80 ° C por ELISA.
- Separar las células tratando con 1 mL de solución de tripsina/EDTA 0.05% y desactivar la tripsina añadiendo 1 mL de medio de cultivo que contiene 10% FBS. Determinar la cuenta de célula para la normalización de los resultados de ELISA como se describe en el paso 5. Recoger las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
- Retire el medio de una succión suave y añadir 1 mL de solución de extracción de RNA. Vórtice, el tubo de microcentrífuga vigorosamente por 15 s. Posteriormente, añadir 200 μL de cloroformo y vigoroso vórtice la mezcla otra vez para un adicional 15 s.
- Centrifugar los tubos de muestra a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C. Luego, cuidadosamente transferir la fase superior a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL.
Nota: La interfase y la fase orgánica inferior no deben ser perturbados durante la transferencia de la fase superior a un tubo nuevo. - Añadir 400 μL de isopropanol para precipitar el ARN y mezclar bien por inversión suave. Luego, incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Centrifugar el tubo a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C. A continuación, descartar el sobrenadante, teniendo cuidado de mantener el pellet de RNA. Lavar el ARN mediante la adición de 1 mL de etanol al 75% e invertir el tubo de 2 – 3 x. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 17.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
- Secar el pellet de RNA en la temperatura ambiente y disolver el ARN en 50 μl de dietil pirocarbonato (DEPC)-agua destilada tratada. Con 1 μl de solución de RNA, cuantificar la concentración de RNA total con un espectrofotómetro.
Nota: Exceso de secado reduce la solubilidad del ARN; por lo tanto, evitar el secado excesivo del RNA.
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preparación de ADNc
- Preparar la mezcla de reacción de la reverso-transcripción para cada muestra añadiendo lo siguiente en un tubo de paredes delgadas de la PCR: 2 μg de ARN total (ajustar el volumen a 10 μl con agua libre de ARNasa), 2 μl de 10 x buffer de RT, 1 μl de un cebador al azar (50 pmol), 0,8 μl de mezcla de x dNTP 25 (100 m m), 1 μl de la transcriptasa inversa MMLV (50 U/μL) y 5.2 μl de ARNasa-libre del agua.
- Configurar el programa de transcripción reversa reacción en el termociclador con las siguientes condiciones: 42 ° C durante 60 min y a 95 ° C por 5 min lugar la polimerización en cadena los tubos en el termociclador y empezar el programa.
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Reacción en cadena de polimerasa en tiempo real
- Preparar la mezcla principal de PCR en tiempo real para todas las reacciones. La mezcla de reacción para cada muestra es la siguiente: 25 μl de 2 x en tiempo real PCR Master Mix, 1 μl de cada uno de los iniciadores de avance y retroceso para IL-6 o IL-8 y 21 μl de agua destilada ultra puro (DNasa y Rnasa-libre). Vea la tabla 1.
Nota: Preparar la mezcla de reacción de PCR en tiempo real para cada muestra que contiene los cebadores de ARN de actina como control interno. GAPDH puede utilizarse también como control interno para la normalización. - Añadir 48 μl de la mezcla principal y 2 μl del producto de 3-fold cDNA diluidos con agua a cada pocillo de una placa de 96 pocillos óptico qPCR. Realice cada reacción por triplicado. Preparar un control bien que contiene la plantilla de cDNA como control de polimerización en cadena.
- Establecer el programa de reacción de PCR en tiempo real en el termociclador con las siguientes condiciones: 10 min a 95 ° C, 40 ciclos of15 s a 95 ° C (desnaturalización) y 1 min a 60 ° C (recocido y extensión).
- Realizar PCR en tiempo real y grabar el valor umbral de ciclo (CT) después de la terminación de los ciclos PCR. Calcular los niveles de mRNA de IL-6 o IL-8 con el 2- ΔΔCΤ método20.
Nota: El cambio relativo doblez en expresión se determina después de la normalización de los niveles de actina mediante la siguiente fórmula:
Doble cambio = 2-Δ (ΔCT)
Aquí,
ΔCT = CT, IL-6 o IL-8- CT, actina; y
Δ (ΔCT) = ΔCT, estimulado- ΔCT, control. - Calcular el valor medio para cada muestra duplicada.
Nota: qPCR debe repetirse independientemente por lo menos 3 x y los valores medios se calculará basado en estos resultados. Senescencia inducida por Ras representante H resultados se muestran en la figura 3. Hambre de suero puede inducir la expresión de los mRNAs IL-6 e IL-8 en algunas células sensibles. Así, la IL-6 y la expresión del mRNA de la IL-8 en células cultivadas con y sin hambre de suero se deben comparar inicialmente. Si hambre suero induce cambios significativos en la expresión de IL-6 o IL-8 ARNm, el ARN total para qPCR y el medio condicionado de ELISA deben prepararse por separado.
- Preparar la mezcla principal de PCR en tiempo real para todas las reacciones. La mezcla de reacción para cada muestra es la siguiente: 25 μl de 2 x en tiempo real PCR Master Mix, 1 μl de cada uno de los iniciadores de avance y retroceso para IL-6 o IL-8 y 21 μl de agua destilada ultra puro (DNasa y Rnasa-libre). Vea la tabla 1.
5. cuantificación de los niveles de proteínas secretadas de IL-6 e IL-8 para un análisis del fenotipo secretor asociados a senescencia mediante ELISA
- Deshielo 3 mL de medio condicionado extraídas de células senescentes WI-38 como se describe en el paso 4. Eliminar restos de células por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
- El medio condicionado se concentran 10 veces por centrifugación a 3.000 x g durante 20 min con una unidad de filtro centrífugo.
Nota: La concentración de medio condicionado no necesariamente dependerá del tipo de muestra. -
Realizar el ELISA con 50 μl de cada muestra concentrada de medio condicionado de los kits de IL-6 e IL-8 ELISA apropiados.
Nota: Para probar cada muestra en dos pocillos de ELISA. Porque cada momento se duplica en el paso 4, este análisis nos permite monitorear las variaciones en el ensayo de ELISA y la técnica de preparación de la muestra.- Para la capa de la placa de ELISA, diluir la IL-6 o IL-8 anticuerpos con 1 x PBS a una concentración de 0,5 μg/mL para IL-6 o 0.125 μg/mL de IL-8. Añada 100 μl de los anticuerpos diluidos en cada pocillo de la placa ELISA. Sellar la placa con una placa de ELISA película e incubar sin agitación durante la noche a temperatura ambiente.
- Retirar la solución de anticuerpo por aspiración. Lavar cada pozo 4 x con 300 μL de 1 x de tampón de lavado (0.05% Tween-20 en PBS). Añadir 300 μL de solución amortiguadora de bloqueo (1% de BSA en PBS) a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Retirar la solución de bloqueo por la aspiración. Lavar cada pozo 4 x con 300 μL de 1 x de tampón de lavado. Preparar en serie diluida ELISA estándares en un tampón de dilución (0.05% Tween-20 y 0.1% de BSA en PBS) para generar una curva estándar.
Nota: La dilución seriada de IL-6 es 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1.000 y 2.000 pg/mL. La dilución seriada de IL-8 es 2.34, 4.69, 9.38, 18.75, 37.5, 75 y 150 pg/mL. - Añada 100 μl de la solución estándar o 100 μl de la solución de la muestra (50 μl de medio concentrada con 50 μl de tampón de dilución) en cada pocillo. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 2 h.
- Retirar la solución de estándar o muestra por aspiración. Lavar cada pozo 4 x con 300 μL de 1 x de tampón de lavado. Diluir el anticuerpo de detección con el tampón de dilución a una concentración de 0,1 μg/mL para IL-6 o 0.25 μg/mL de IL-8. Añada 100 μl del anticuerpo diluido por pozo. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 2 h.
- Retirar la solución de anticuerpo por aspiración. Lavar cada pozo 4 x con 300 μL de 1 x de tampón de lavado. Diluir estreptavidina-peroxidasa (HRP) en el tampón de dilución a una concentración de 0.05 μg/mL. Añada 100 μl de solución de estreptavidina-HRP por pozo. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Retirar la solución de anticuerpo por aspiración. Lavar cada pozo 4 x con 300 μL de 1 x de tampón de lavado. Añada 100 μl de 3, 3′, 5, 5-tetrametilbenzidina (TMB) solución sustrato a cada pocillo. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 20 minutos permitir el desarrollo del color. Detener la reacción añadiendo 100 μl de una solución de 1 M HCl.
- Leer la absorbancia de cada pocillo con un lector de ELISA a 450 nm.
- Trazar la curva estándar para los estándares generados. Calcular las concentraciones de IL-6 e IL-8 en el medio condicionado según las curvas estándar. Parcela los resultados después de una normalización para el recuento de células. Calcular los valores promedio para las muestras duplicadas.
Nota: ELISA debe repetirse independientemente por lo menos 3 x y los valores medios se calculará basado en estos resultados (figura 4).
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Representative Results
En la figura 1se muestra un ejemplo de la senescencia inducida por el H-Ras. Una infección de fibroblastos humanos normales de WI-38 con el retrovirus de H-RasV12 indujo dramáticos cambios morfológicos (figura 1B). Además, como se muestra en la figura 1, actividad tinción de β-gal SA se incrementó notablemente al H-RasV12 expresión. Más del 70% de las células demostraron SA β-gal tinción actividad 6 d después de la infección del retrovirus H-RasV12, indicando que una expresión de H-RasV12 con éxito induce senescencia celular en las células WI-38, como nosotros y otros grupos previamente registrados21 ,22.
La figura 2 muestra resultados representativos del análisis tinción DCF-DA para el monitoreo de los niveles ROS durante la senescencia celular inducida por el H-Ras. Aumento de los niveles ROS intracelular se observa ya en 2 días después de la expresión H-Ras y se mantiene hasta el momento 6 días. Mientras tanto, la inducción de la spas muestra cinética diferente. Se observan aumentos en los niveles de mRNA de IL-6 y IL-8, representantes factores de spas, de 4 días después de la expresión H-Ras y pico en el punto de tiempo de 8 días (figura 3). Como se ilustra en la figura 4, los niveles de IL-6 e IL-8 secretados muestran aumentos similares, consistentes con los resultados PCR en tiempo real. Estos resultados sugieren diferentes roles de ROS y spas en la inducción de senescencia celular.
Figura 1 : Cambios morfológicos y aumento de β-gal de SA tinción durante la senescencia inducida por el H-Ras. (A) este panel muestra el procedimiento experimental para la inducción de la senescencia inducida por Ras H en células WI-38. (B) SA β-gal la coloración fue realizada en el momento indicado después de la infección de células WI-38 con el retrovirus de H-RasV12; aquí, se muestran imágenes representativas de la tinción de β-gal SA. Se contaron las células β-gal-positivas (C) SA en tres experimentos independientes. Los resultados se presentan como los valores promedio y las barras de error representan desviaciones de estándar (SD). P < 0.01, de Student t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Aumento en los niveles ROS intracelulares durante la senescencia inducida por el H-Ras. (A) células WI-38 fueron infectadas con el retrovirus de H-Ras y manchadas con DCF-DA (50 μm) en los puntos de tiempo indicado. Intensidades de fluorescencia DCF-DA se cuantificaron utilizando un citómetro de flujo. Se muestran los histogramas representativos de la intensidad de fluorescencia DCF-DA en los puntos de tiempo de 0 - 6 d. (B) histogramas representativos de la intensidad de fluorescencia DCF-DA en los puntos de tiempo de 0 - 6 días se trazan juntos para más fácil comparación. (C) DCF-DA la intensidad de la fluorescencia durante la senescencia inducida por el H-Ras se midió en el momento indicado puntos x 3. Los resultados se presentan como los valores promedio y las barras de error representan desviaciones de estándar (SD). P < 0.05 y ** P < 0.01, de Student t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Relacionados con la cuantificación de spas de mRNAs durante la senescencia inducida por el H-Ras. RNA fue preparada de WI-38 células en los puntos de tiempo indicado después de la infección del retrovirus H-RasV12. Estos paneles muestran la inducción de la expresión de IL-6 (A) y (B) IL-8 por qPCR utilizando los cebadores específicos listados en la tabla 1. Se utilizaron los niveles de ARNm de la actina para la normalización. La IL-6 normalizado o niveles de mRNA de IL-8, medidos en la muestra de 0-day se establecieron en 1 y se calcularon los cambios veces relativa. Los experimentos fueron repetidos independientemente de 3 x. Los resultados se presentan como los valores promedio y las barras de error indican la desviación estándar (SD). P < 0.05 y ** P < 0.01, de Student t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Cuantificación de spas secretada factores durante la senescencia inducida por el H-Ras. Estos paneles muestran curvas estándar generadas con IL-6 (A) e IL-8 (C) las normas. Medios condicionados fueron extraídos WI-38 células en los puntos de tiempo indicado después de la infección por retrovirus H-RasV12. Los niveles de IL-8 (D) y secretan IL-6 (B) se analizaron con IL-6 y el kit de ELISA de IL-8, respectivamente. Los experimentos fueron repetidos independientemente de 3 x. Los resultados se presentan como los valores promedio y las barras de error indican la desviación estándar (SD). P < 0.05 y ** P < 0.01, de Student t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre gen | Primer avance | Primer revés |
| IL-6 | 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' | 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3' |
| IL-8 | 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' | 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3' |
| actinia | 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' | 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' |
Tabla 1: Cartillas PCR en tiempo real para factores de spas.
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Discussion
Aquí, hemos presentado para el monitoreo de los niveles ROS intracelulares durante la senescencia inducida por el H-Ras en fibroblastos humanos normales WI-38. Niveles ROS intracelulares en células vivas pueden medirse cuantitativamente utilizando el reactivo permeable a la célula DCF-DA y citometría de flujo. Absorción celular, DCF-DA es desacetilado por esterasas intracelulares y, posteriormente, oxidado por ROS para formar altamente fluorescente 2', 7'-Diclorofluoresceína (DCF). La fluorescencia DCF puede detectarse mediante citometría de flujo utilizando un detector de FL1 (fluorescencia verde). Usando el método de tinción de DCF-DA, con éxito detectamos un aumento en los niveles de ROS durante la senescencia celular inducida por el H-Ras en fibroblastos humanos normales WI-38. Este método puede utilizarse en varios modelos de senescencia celular para monitorear los cambios en los niveles de ROS. Además de DCF-DA métodos de tinción, adicionales que se han utilizado para medir la inducción ROS incluyen monitoreo de los niveles de proteínas oxidadas23 y un análisis de la microscopia confocal con ROS dependientes tintes fluorescentes24. Por lo tanto, más confirmación de cambios en los niveles ROS métodos adicional es deseable.
Recientemente, hemos demostrado que aumentan niveles ROS en las células cancerosas durante la senescencia inducida por p53 así como senescencia inducida por Ras H21. Aumento de los niveles ROS intracelular es observables antes del aumento SA β-gal tinción actividad, sugiriendo el papel causativo de ROS en la inducción de senescencia celular. Curiosamente, el aumento en los niveles ROS es controlado por separado por la vía de Akt-NF-κB-NOX4, mientras que la detención del ciclo celular está mediada por p2121. Sería interesante estudiar si Akt regula también el incremento ROS en otros tipos de senescencia celular.
También hemos introducido métodos para el análisis del mRNA y secretan niveles de proteína de los factores de spas, IL-6 e IL-8 durante la senescencia inducida por el H-Ras. Utilizando qPCR, cuantificamos la inducción de IL-6 e IL-8 mRNA en células senescentes WI-38. Se analizaron los niveles de ARNm de la actina como control interno para la normalización, pero GAPDH mRNA puede utilizarse también como control interno. El 18S ribosomal RNA (rRNA) es otro gen de limpieza que se utiliza comúnmente como un control interno en los experimentos de qPCR. Sin embargo, porque la maduración transcripción y ribosomas ARNr son regulados durante la detención del ciclo celular y senescencia celular25,26, 18S rRNA puede no ser un buen control interno para los estudios de la senescencia celular. ELISA, utilizando un medio condicionado de las células senescentes de WI-38, mostraron similares aumenta IL-6 secretada y niveles de IL-8. Consistente con la idea de que los spas se desarrolla en la Senectud "maduros" etapa19, aumento de IL-6 y la secreción de IL-8 es detectable en un momento más tarde que el aumento en los niveles de ROS. En particular, factores spas varían dependiendo de los tipos de células y de las condiciones de inducción de senescencia27. Por lo tanto, los factores apropiados de spas deben seleccionarse según el modelo de la senescencia celular.
Aunque confirmamos la senescencia inducida por el H-Ras mediante el control de cambios morfológicos y la inducción de la actividad de tinción de β-gal SA, senescencia celular debe verificarse aún más mediante el control de características de senescencia adicionales, incluyendo la pérdida irreversible del potencial de proliferación, focos de heterocromatina asociada a la senescencia (SAHF), factores de spas, la activación de supresores tumorales como p53 y p16INK4a, mejorado las señales de daño de ADN y focos nucleares persistente, definidos como segmentos de ADN con alteraciones de la cromatina refuerzo de senescencia (ADN-cicatrices). Sin embargo, es importante recordar que existe una heterogeneidad de características de senescencia en tipos diferentes de la senescencia. Ciertos biomarcadores de envejecimiento pueden ser observable sólo en algunos tipos específicos de senescencia celular. Por ejemplo, SAHF son generalmente evidentes en IO28,29.
Senescencia celular era considerada inicialmente para representar a la detención de crecimiento autónoma causada por las condiciones de cultivo artificial. Sin embargo, estudios en el último medio siglo han demostrado la importancia de la senescencia celular bajo varias condiciones fisiopatológicas, incluyendo cáncer y envejecimiento. La relación de causalidad entre la senescencia celular y deterioro de tejidos relacionados con la edad ha sido probado previamente en BubR1 del progeroid ratón modelos30,31. Así, controla senescencia celular a través de ya sea la eliminación de células senescentes o la modulación de la spas se considera actualmente como una estrategia prometedora para la enfermedad relacionada con la edad. De hecho, estudios recientes demostraron que la eliminación de células senescentes sería un prometedor tratamiento para patologías relacionadas con la edad, incluyendo el agotamiento de la célula de vástago, pérdida de masa ósea, pérdida de cabello y osteoartritis32,33, 3435,de,36. Una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares de inducción de senescencia y fenotipos de la senescencia, incluyendo SASPs, proporcionará mejores estrategias dirigidas a senescencia reduciendo inconvenientes posibles y selectivamente dirigidas sólo a deletéreos funciones de las células senescentes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (2015R1D1A1A01060839) (a Young Yeon Kim) y por una beca de la National Research Foundation de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (MSIT) (no. 2016R1A2B2008887 no. 2016R1A5A2007009) (a Jeanho Yun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S.
- Lu, T., Finkel, T.
- Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
- Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
- Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
- Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
- Rodier, F., Campisi, J.
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
- Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
- Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
- Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
- Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
- Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
