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Chemistry

स्वयं के संश्लेषण के लिए सतही प्रोटोकॉल-कोडांतरण Polyamine-आधारित पेप्टाइड Amphiphiles (PPAs) और संबंधित सामग्री

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57908
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

polyamine के संश्लेषण आधारित पेप्टाइड amphiphiles (PPAs) एक महत्वपूर्ण कई अमीन नाइट्रोजन, जो समूहों की रक्षा के लिए इन प्रतिक्रियाशील कार्यक्षमताओं मुखौटा के विवेकपूर्ण उपयोग की आवश्यकता की उपस्थिति के कारण चुनौती है । इस पत्र में, हम स्वयं के अणुओं कोडांतरण के इन नए वर्ग की तैयारी के लिए एक सतही विधि का वर्णन ।

Abstract

Polyamine-आधारित पेप्टाइड Amphiphiles (PPAs) के एक नए वर्ग के स्व-कोडांतरण amphiphilic के लिए पेप्टाइड Amphiphiles (क़दम) से संबंधित सामग्री कर रहे हैं । पारंपरिक क़दम solubilizing समूहों (lysine, arginine), जो सीधे एक लिपिड खंड से जुड़े हुए है या एक linker तटस्थ अमीनो एसिड से बना क्षेत्र शामिल कर सकते है के रूप में अमीनो एसिड चार्ज अधिकारी । इस क़दम के पेप्टाइड अनुक्रम ट्यूनिंग विविध morphologies उपज कर सकते हैं । इसी तरह, PPAs एक hydrophobic खंड और तटस्थ अमीनो एसिड के अधिकारी हैं, लेकिन यह भी पानी solubilizing (हाइड्रोफिलिक) समूहों के रूप में polyamine अणुओं होते हैं । के रूप में क़दम के साथ मामला है, PPAs भी स्व-छोटे छड़, मुड़ नैनो रिबन सहित विविध morphologies, में इकट्ठे कर सकते हैं, और नैनो-चादरें, जब पानी में घुल से जुड़े । हालांकि, एक एकल polyamine अणु पर दोनों प्राथमिक और माध्यमिक अमीन की उपस्थिति एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया जब synthesizing PPAs । इस पत्र में, हम एक सरल प्रोटोकॉल, साहित्य मिसाल के आधार पर दिखाने के लिए, ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण (SPPS) का उपयोग कर PPAs का एक सतही संश्लेषण को प्राप्त करने के लिए. इस प्रोटोकॉल के क़दम और अन्य समान प्रणालियों के संश्लेषण को बढ़ाया जा सकता है. हम भी राल, पहचान, और शुद्धि से दरार के लिए आवश्यक कदम है कि वर्णन ।

Introduction

स्व-कोडांतरण पेप्टाइड amphiphiles (क़दम) आम तौर पर निंनलिखित क्षेत्रों के शामिल की एक वर्ग है: (क) हाइड्रोफिलिक सिर, (ख) linker क्षेत्र, और (ग) hydrophobic पूंछ । ज्यादातर क़दम साहित्य में वर्णित एक हाइड्रोफिलिक आरोप या ध्रुवीय एमिनो एसिड अवशेषों के शामिल सिर1,2,3,4। प्राधान्य दवा वितरण, रोग निदान, अपक्षयी दवा, आदि5सहित चिकित्सा में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला मिल गया है । उनके एमिनो एसिड अनुक्रम के आधार पर, प्राधान्य गोलाकार micelles, और नैनो-रेशा सहित nanostructures की एक विस्तृत विविधता के रूप में कर सकते हैं । हम हाल ही में संकर polyamine के एक वर्ग की सूचना दी है आधारित पेप्टाइड amphiphiles, PPAs6का कार्यकाल । morphologies, स्व-कोडांतरण कैनेटीक्स, और चयापचय क्षरण, इन गैर-भौतिक, उनके solubilizing सिर समूह से संबंधित होना पाया गया । इसके अलावा, PPA nanostructures परीक्षण सांद्रता में स्तनधारी कोशिकाओं (MiaPaCa2 और हेला सेल लाइनों) की ओर विषाक्तता नहीं दिखा था । PPA-आधारित nanocarriers आकर्षक औषधि-वितरण वाहन हैं क्योंकि: (१) polyamine और चयापचय को कैंसरपूर्ण कोशिकाओं में वृद्धि के लिए दिखाया गया है, (२) cationic nanostructures प्राप्त कर सकते हैं endosomal एस्केप७,८, जो एक सेल के भीतर उच्च परिसंचरण और निवास की ओर जाता है, और (3) वे एक विशिष्ट चयापचय प्रोफ़ाइल जब फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ तुलना में होना चाहिए; उदाहरण के लिए, वे मानव शरीर में पाया छेड़ने की दिशा में अधिक स्थिर हो जाएगा (हालांकि वे शायद इस तरह के अमीन oxidases के रूप में अंय एंजाइमों के प्रति संवेदनशील)9,10। इसके अलावा, PPAs के लिए विविध morphologies, भौतिक गुण, nanoparticle कठोरता, और विधानसभा कैनेटीक्स लंबाई और व्यक्तिगत PPA अणु6के प्रभारी के आधार पर पाया गया है । इस के साथ साथ, हम संश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन, पहचान, और PPAs की शुद्धि कि भी क़दम या इसी तरह संकर पेप्टाइड अणुओं की तैयारी के लिए लागू किया जा सकता.

क्योंकि polyamines सामांयतः व्यावसायिक रूप से उनके संरक्षित रूपों में उपलब्ध नहीं हैं, और क्योंकि polyamines के प्राथमिक और माध्यमिक अमीनों की रक्षा उंहें एमिनो एसिड और अंय अणुओं के साथ conjugating के लिए अत्यंत महत्व का है, हम रेखांकित किया है सिंथेटिक कदम उनके संरक्षण प्राप्त करने के लिए । इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य अमीनो एसिड को conjugating polyamines के लिए एक सरल विधि प्रदान करना है । Polyamines कमी एक carboxylic गट; इस प्रकार, वे रिंक के बीच या वैंग रेजिन के साथ युग्मित नहीं किया जा सकता । इसके बजाय, 2-chlorotrityl क्लोराइड जैसे रेजिन सिंथेटिक प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश कर रहे हैं । PPA संश्लेषण के लिए मुख्य चुनौती प्राथमिक और माध्यमिक अमीन कार्यात्मक समूहों की उपस्थिति है । हमारे प्रयोजनों के लिए, हम polyamine में सभी माध्यमिक अमीन की रक्षा करते हुए polyamine पर प्राथमिक अमीनो समूह रखते हुए मुक्त युग्मन प्रतिक्रिया की अनुमति है । प्रतिक्रिया ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण (SPPS) के सिद्धांतों के बाद एक ठोस समर्थन पर किया गया था प्रत्येक युग्मन और संरक्षण कदम के बाद काम करने की सुविधा । निंनलिखित प्रोटोकॉल PPAs के मैनुअल और स्वचालित संश्लेषण दोनों के लिए है (हालांकि कुछ चरणों का सत्यापन एक स्वचालित प्रणाली में चुनौतीपूर्ण होगा) । इन अणुओं के संश्लेषण भी एक स्वचालित सिंथेसाइज़र पर या एक माइक्रोवेव रिएक्टर की सहायता के साथ किया जा सकता है (स्वचालित या अर्द्ध स्वचालित). चित्रा 1में प्रतिक्रिया योजना संक्षेप किया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: (क) PPAs के संश्लेषण के लिए एक सामान्य प्रतिक्रिया योजना. (ख) प्रतिनिधि polyamines जिसे यहाँ वर्णित संश्लेषित PPAs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

1. PPAs के संश्लेषण के लिए जनरल प्रोटोकॉल

  1. संश्लेषण के पैमाने की गणना (आमतौर पर mmol). यह पैमाना लक्ष्य PPA राशि के द्रव्यमान पर आधारित है । मन में रखें कि SPPS की प्रतिक्रिया दक्षता धीरे-से एमिनो एसिड अनुक्रम की वृद्धि के साथ कम हो जाती है. इसलिए, सटीक प्रतिक्रिया दक्षता की गणना करने के लिए कठिन है ।
  2. राल के वजन की गणना राल की लोडिंग के अनुसार इस्तेमाल किया जा करने के लिए । लदान कंटेनर या राल के विश्लेषण प्रोटोकॉल पर पाया जाता है और mmol में व्यक्त/ निंनलिखित फार्मूला राल के वजन की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:
  3. ध्यान से बाहर वजन 2-chlorotrityl क्लोराइड राल (हमारे मामले में लोड हो रहा है ~ ०.८५ mmol)
  4. निंनलिखित विनिर्देशों के साथ एक fritted संश्लेषण पोत में राल प्लेस: क्षमता-५० मिलीलीटर, fritted डिस्क – 25 मिमी, Porosity-मध्यम ।
  5. राल के लिए dichloromethane (डीसीएम) की 15 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. एक चर गति यांत्रिक शेखर (कुप्पी शेखर/सरगर्मी/) के लिए संश्लेषण पोत प्रत्यय, और एक ४५ ° कोण (या क्षैतिज) के लिए आंदोलन को अधिकतम करने के लिए जहाजों की बारी है ।
  7. राल मोती 15 मिनट के लिए फूल की अनुमति दें । सूजन प्रतिक्रिया की उपज को बढ़ाता है क्योंकि यह सक्रिय साइट के लिए आणविक प्रसार और पहुंच की सुविधा, युग्मन दक्षता बढ़ाने ।
  8. (एक ०.२५ mmol पैमाने के लिए 2 mmol) वांछित polyamine (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1, 3-diaminopropane, आदि) राल को जोड़ने और यह 5 एच के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति के लिए 8 समकक्ष जोड़ें ।
    नोट: एक कम प्रतिक्रिया अवधि उपज कम हो जाएगा ।
  9. एक कैसर परीक्षण करें ( सामग्री की तालिकादेखें) को राल के लिए polyamine के सफल युग्मन की पुष्टि करें । प्राथमिक अमीन के सफल युग्मन एक बैंगनी/नीला रंग है, जो मुक्त अमीन के अनुरूप पैदावार ।
  10. 1-(4, 4-dimethyl-2, 6-dioxocyclohex-1-ylidene) एथिल (Dde), निर्जल मेथनॉल (15 मिलीलीटर) में भंग की 4 समकक्ष का उपयोग कर प्राथमिक अमीन समूह की रक्षा, प्रतिक्रिया मिश्रण रात भर11से मिलाकर ।
    नोट: एक कम प्रतिक्रिया समय उपज कम कर देता है ।
  11. कैसर टेस्ट करते हैं । राल मनका से नीले रंग की अनुपस्थिति सफल संरक्षण की पुष्टि करता है । प्राथमिक अमीन के असफल संरक्षण के मामले में, पिछले कदम दोहराएं ।
  12. डीसीएम और DMF (2:1, 15 मिलीलीटर) के मिश्रण से दो बार रेजिन को छानकर धो लें ।
  13. डीसीएम (20 एमएल) में डि-tert butyl डि-कार्बोनेट (बीओसी) के 20 समकक्ष (5 mmol) को भंग करें और 3 ज के लिए आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया दें ।
  14. एक chloranil परीक्षण करें ( सामग्री की तालिकादेखें) माध्यमिक अमीन की पूरी सुरक्षा की पुष्टि करने के लिए । एक सकारात्मक परीक्षण (संरक्षण) एक बेरंग या हल्के पीले रंग की पैदावार । प्राथमिक अमीन एक लाल रंग दे, जबकि नि: शुल्क माध्यमिक अमीन एक गहरे हरे रंग/
  15. विलायक मिश्रण नाली और डीसीएम और DMF (2:1, 15 मिलीलीटर) का एक मिश्रण के साथ दो बार धो लो ।
  16. DMF (10 मिलीलीटर) में hydrazine का एक 2% समाधान जोड़ें और 1 एच के लिए शेक ।
  17. एक कैसर परीक्षण करने के लिए प्राथमिक अमीन के सफल संरक्षण की पुष्टि करें ।
  18. उल्टे अनुक्रम में वांछित अमीनो एसिड जोड़ें जिसमें आप लिखना होगा/ पेप्टाइड्स एन टर्मिनी से सी टर्मिनी के लिए तैयार कर रहे हैं, लेकिन विपरीत दिशा में संश्लेषित कर रहे हैं, सी करने के लिए एन. उदाहरण के लिए, निंनलिखित पेप्टाइड कोर की आवश्यकता होती है एक PPA के लिए-GLFD-, एसपारटिक एसिड जोड़ें (डी), फेनिलएलनिन द्वारा पीछा (एफ), Leucine (एल), और अंत में Glycine (जी) ।
    नोट: सबसे एमिनो एसिड के लिए, निंनलिखित युग्मन कॉकटेल polyamine लोड रेजिन के लिए लगाव के लिए उपयुक्त है ।
    1. Fmoc-संरक्षित अमीनो अम्ल के 4 समकक्ष (1 mmol), 2 के ३.९५ समकक्षों को मिलाएं-(१-benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), और diisopropylethyl अमीन (DIPEA) के 15 समकक्ष ।
    2. उंहें डीसीएम और DMF (1:1, 15 मिलीलीटर) के एक मिश्रण में भंग और 2 मिनट के लिए कॉकटेल sonicate (पूर्ण विघटन तक) ।
    3. एमिनो एसिड पर carboxylic एसिड की सक्रियण सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 3-5 मिनट रुको ।
    4. पोत के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें । परिवेश के तापमान पर 2-4 ज के लिए प्रतिक्रिया बाहर ले ।
      नोट: हम HBTU के लिए कुशल विकल्प के रूप में निंनलिखित पाया है (आमतौर पर अमीनो एसिड और युग्मन एजेंट की कम मात्रा की आवश्यकता): COMU, PyBOP, हतु, Oxima/
    5. एक कैसर परीक्षण करने के लिए सफल युग्मन की पुष्टि करें ।
    6. De-DMF में 4-मिथाइल piperidine (10 मिलीलीटर) का 20% घोल जोड़कर अमीनो अम्ल से Fmoc-समूह की रक्षा करें । यह दो बार करते हैं, हर बार 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण मिलाते हुए ।
      नोट: Fmoc हटाने के लिए एक कुशल विकल्प पिपेराजीन/DBU12है ।
      1. प्रदर्शन एक डीसीएम (15 एमएल) जोड़ के बीच धो लो ।
    7. एक कैसर परीक्षण करने के लिए सफल de-अमीनो एसिड की सुरक्षा की पुष्टि करें ।
    8. 4-मिथाइल के सभी निशान हटाने के लिए अच्छी तरह से राल धो लें । DMF (10 मिलीलीटर) के साथ दो बार राल धो, प्रत्येक 5 मिनट के लिए स्थाई धोने, और अंत में डीसीएम के साथ (10 मिलीलीटर) 10 मिनट के लिए ।
    9. युग्मन और de-सुरक्षा कदम दोहरा क्रमिक द्वारा सभी शेष अमीनो एसिड जोड़ें ।
  19. अंत में, सभी आवश्यक अमीनो एसिड युग्मन के बाद, polyamine के पिछले एमिनो एसिड के लिए hydrophobic पूंछ संयुग्मी-पेप्टाइड का निर्माण:
    1. HBTU और डीसीएम और DMF मिश्रण (1:1, 20 एमएल) में भंग DIPEA के 12 समकक्ष के ९.५ समकक्ष के लिए वांछित carboxylic एसिड कार्यशीलता के 10 समकक्ष जोड़ें ।
      नोट: कुछ पूंछ की तुलना में मन में भालू विलायक के एक अलग अनुपात (आमतौर पर डीसीएम का एक बड़ा%) या इसके अलावा या एन-methylpyrrolidone (एनएमपी) के रूप में एक और विलायक की आवश्यकता हो सकती है ।
    2. Sonicate के लिए कॉकटेल 5-10 मिनट तक विघटन (हमने देखा है यह पूंछ के लिए अब लेता है पूरी तरह से भंग) और पोत को जोड़ने के लिए ।
      नोट: कई प्रतिक्रियाशील साइटों से युक्त पूंछ के लिए, वे युग्मन उंहें पहले की रक्षा की आवश्यकता होगी ।
    3. इस प्रतिक्रिया बाहर ले (hydrophobic पूंछ युग्मन) कम से 5 घंटे के लिए, हालांकि यह उचित है इसे बाहर ले जाने के लिए सबसे अधिक उपज के लिए रात भर ।

2. ठोस समर्थन से PPA क्लीवेज

इस कदम का उद्देश्य राल से PPA की दरार है, और एमिनो एसिड और polyamine अवशेषों से समूहों की रक्षा बीओसी को दूर करने के लिए ।

  1. DMF (2 मिनट के लिए 8 मिलीलीटर) और डीसीएम के साथ दो बार (8 मिलीलीटर, 5 मिनट के लिए हर बार) के साथ राल धो लो । प्रत्येक जोड़ से पहले, पोत से विलायक नाली । एक बार पिछले धोने प्रदर्शन किया है, 15 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत राल सूखी ।
  2. निम्न मिश्रण अनुपात का उपयोग कर दरार समाधान तैयार: 28:1:1 trifluoroacetic अम्ल (TFA): एच२ओ: Triisopropyl silane (TIPS). क्लीवेज कॉकटेल की 15 मिलीलीटर बनाने के लिए 14 एमएल का TFA, एच2ओ के ०.५ एमएल और टिप्स के ०.५ एमएल को जोड़ें ।
  3. राल के लिए इस दरार समाधान जोड़ें और 2 के लिए शेक-कमरे के तापमान पर 4 ज ।
  4. समाधान एक 25 या ५० मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी में ले लीजिए ।
  5. vacuo में TFA ध्यान केंद्रित करने के लिए 1-2 मिलीलीटर कम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग करते हुए ४० डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हीटिंग (PPA के अपघटन से बचने के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पार नहीं) ।
  6. वाष्पीकरण के बाद, प्राप्त TFA समाधान (dropwise) निर्जल शीत ईथर (15 मिलीलीटर) युक्त एक गोल नीचे कुप्पी करने के लिए जोड़ें । इससे PPA को तुरंत हाला होगा ।
  7. इसके अलावा, मूल कुप्पी जहां TFA केंद्रित था निर्जल ठंड ईथर (5 मिलीलीटर) जोड़ें ।
  8. Sonicate इस कुप्पी अतिरिक्त ठोस वसूली और २.६ कदम से ईथर समाधान के साथ गठबंधन करने के लिए ।
    नोट: स्थानांतरित पिपेट डीसीएम की एक छोटी मात्रा के साथ धोया जा सकता है । प्रक्रिया के दौरान DMF शुरू करने से बचें क्योंकि यह एक जेल की तरह पदार्थ बनाने के लिए जाता है ।
  9. कुप्पी (कवर) को फ्रिज के अंदर रखें और इसे तेज़ी से अधिकतम होने के लिए रात भर खड़े रहने दें ।
  10. एक sintered डिस्क फिल्टर कीप का उपयोग वैक्यूम निस्पंदन द्वारा उपजी सामग्री को इकट्ठा । आदर्श ताकना आकार ठीक है या मध्यम ।
  11. किसी भी अवशिष्ट ऑर्गेनिक्स को निकालने के लिए शीत ईथर (5-10 मिलीलीटर) के साथ दो बार तेज़ी से धोएं ।

3. मालदी सूख-छोड़ विधि का उपयोग कर कच्चे उत्पाद की पहचान

  1. सकारात्मक मोड में विश्लेषण के लिए मैट्रिक्स तैयारी:
    1. आणविक भार विश्लेषण शुरू करने के लिए मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization (मालदी) मास स्पेक्ट्रोमेट्री, α के 10 से 20 मिलीग्राम जोड़ें-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड के लिए एक microcentrifuge ट्यूब ।
    2. पानी का एक समाधान जोड़ें/acetonitrile (1:1, १.० एमएल) ०.१% Trifluoroacetic एसिड (TFA) के साथ । अच्छी तरह से भंवर द्वारा मिश्रण ।
      नोट: यह मैट्रिक्स सकारात्मक चार्ज किए गए पेप्टाइड्स के लिए उपयोग किया जाना चाहिए । मालदी नकारात्मक मोड समान है लेकिन एक मैट्रिक्स की आवश्यकता होती है जिसमें 9-aminoacridine के साथ ०.१% अमोनिया विलायक additive के रूप में ।
    3. मालदी के लिए स्टेनलेस स्टील लक्ष्य प्लेट के लिए नमूने के 1 – 2 µ एल जोड़ें और हवा में नमूना सूखी । मैट्रिक्स के 1-2 µ एल जोड़ें और इसे फिर से सूखी ।
      नोट: प्लेटों लक्ष्य प्लेट के साथ gridded विशेष स्थान का पता लगाने में मदद करने के लिए परिपत्र चिह्नों है.
  2. अपनी पहचान सत्यापित करने के लिए मालदी साधन में नमूनों का विश्लेषण करें । Electrospray ionization (ईएसआई) PPAs की पहचान की पुष्टि करने के लिए एक वैध विकल्प है ।

4. Preparative रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) शुद्धि का उपयोग कर PPAs का शुद्धिकरण

  1. acetonitrile और पानी की न्यूनतम मात्रा में PPA हाला को भंग करना.
    1. अंगूठे का एक नियम के रूप में, acetonitrile और पानी की 5 मिलीलीटर से भी कम समय में शुष्क क्रूड PPA के १०० मिलीग्राम भंग । अधिक hydrophobic PPAs acetonitrile का अधिक से अधिक प्रतिशत को भंग करने की आवश्यकता हो सकती है और भी सामांय में विलायक के एक बड़े खंड की आवश्यकता हो सकती है, PPAs (तालिका 1) के नेट चार्ज के आधार पर ।
    2. यदि पूर्ण विघटन नहीं होता है, तो 1% TFA (ACN या H2O) जोड़ें । यह भी dimethylsulfoxide, मेथनॉल, या isopropanol सहित अंय संगत सॉल्वैंट्स के ट्रेस मात्रा जोड़ने के लिए संभव है (5% करने के लिए अपनी सामग्री की सीमा) ।
विलायक सकारात्मक आरोप PPAs नकारात्मक आरोपी PPAs
पानी में ०.१% TFA ०.१% पानी में एनएच3
ACN मे ०.१% TFA ACN में ०.१% एनएच3

1 तालिका: विलायक प्रणालियों । प्रस्तावित विलायक प्रणाली के लिए सकारात्मक और नकारात्मक PPAs का आरोप लगाया ।

  1. Sonicate ४८% के Amp1 के साथ 10 एस दालों में 20 मिनट के लिए एक सींग sonicator का उपयोग कर PPA या 2-3 एक अल्ट्रासोनिक स्नान में एच के लिए ।
  2. फिर, एक ०.२० माइक्रोन Polytetrafluoroethylene (PTFE) सिरिंज फिल्टर का उपयोग निस्पंदन द्वारा पीछा एक ०.४५ माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फिल्टर. PPA समाधान स्पष्ट और सभी कण सामग्री से मुक्त होना चाहिए ।
    1. निस्पंदन भी मुश्किल है, तो समय की एक विस्तारित अवधि के लिए sonicate । यह दृढ़ता से सलाह दी जाती है कि PPA समाधान सिरिंज निस्पंदन के बाद तुरंत शुद्ध है, लंबे समय तक भंडारण के रूप में यह कुल या gelate के लिए कारण हो सकता है, जो पुन: sonication और, शायद, फिर से छानने का जरूरत होगा ।
  3. के दौरान और शुद्धि के बाद, या तो HPLC ग्रेड सॉल्वैंट्स या लोगों कि एक ०.२५ माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर/
    नोट: PPAs शुद्ध करने के लिए सबसे आम विलायक शर्तों एच2ओ और ACN के एक ढाल में मिलकर बनता है ।
  4. इस प्रोटोकॉल के लिए एक मानक रिवर्स चरण HPLC साधन का उपयोग करें । यह एक रेफरेंस ढाल प्रोग्रामर, एक द्विआधारी विलायक वितरण प्रणाली, एक यूवी डिटेक्टर २२० और २५४ एनएम में पता लगाने में सक्षम है, और एक प्रोग्राम अंश कलेक्टर शामिल करना चाहिए । अधिकतम प्रवाह दर ५० मिलीलीटर/
  5. जुदाई के लिए एक सी-18 रिवर्स चरण स्तंभ का उपयोग करें । निंनलिखित आयामों के कॉलम का उपयोग किया जा सकता है ठोस शुद्ध किया जा रहा है और PPA (तालिका 2) के शुद्ध प्रभारी के द्रव्यमान पर निर्भर करता है ।
PPA प्रभारी कण आकार स्तंभ आकार क्रूड PPA का द्रव्यमान
+ ve का आरोप लगाया 5 माइक्रोन १५० x 30 मिमी १७० मिलीग्राम
-ve का आरोप लगाया 5 माइक्रोन १५० x 30 मिमी १७० मिलीग्राम
+ ve का आरोप लगाया 5 माइक्रोन १५० x २१.२ मिमी ९० मिलीग्राम
-ve का आरोप लगाया 5 माइक्रोन १५० x २१.२ मिमी ९० मिलीग्राम

तालिका 2: सुझाए गए स्तंभ: स्तंभ आयाम, कण आकार और C18 रिवर्स चरण HPLC स्तंभों के लिए इंजेक्शन प्रति अधिकतम लोड क्षमता

  1. PPA दोनों कॉलम की क्षमता और HPLC के इंजेक्शन पाश की मात्रा के द्वारा निर्धारित की मात्रा के साथ सुई । तालिका 3 (४० min का रेफरेंस टाइम) में देखी गई सेटिंग्स के अनुसार HPLC ग्रेडिएंट पद्धति को चलाएँ.
समय विलायक ए (Acetonitrile) विलायक बी (जल) प्रवाह दर (एमएल/
0 5 ९५% प्रवाह की दर कॉलम पैकिंग और उसके आकार पर निर्भर करता है ।
2 5 ९५%
३५ ९५% 5
३८ १००% 0
४० 5 ९५%

तालिका 3: सुझाए गए ग्रेडिएंट: सुझाया रिवर्स चरण पानी के सापेक्ष संरचना acetonitrile बनाम समय की अवधि में दिखा ढाल । प्रवाह दर कॉलम विनिर्देशों पर निर्भर करेगा ।

  1. विभिंन परीक्षण मालदी का उपयोग कर ट्यूबों पर एकत्र भागों का विश्लेषण और जो ट्यूब (या ट्यूब) PPA शामिल है निर्धारित करते हैं । यह एक ट्यूब में पाया आणविक वजन का अध्ययन करके मूल्यांकन किया है ।
    1. एक विश्लेषणात्मक HPLC पर अंशों की शुद्धता की जाँच करें । एक HPLC-ढाल २२० एनएम पर सेट एक यूवी डिटेक्टर के साथ सुसज्जित प्रणाली का प्रयोग करें ।
    2. यदि अशुद्धियां हैं तो HPLC द्वारा शुद्धि का एक अतिरिक्त चक्र करें । ऊपर preparative HPLC के लिए इस्तेमाल किया ढाल नीचे स्केल किया जा सकता है के लिए विश्लेषणात्मक HPLC कॉलम कनवर्टर ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के साथ प्रयोग करें । प्रत्येक अंश बहुत ≥ ९५% भौतिक लक्षण वर्णन या जैविक मूल्यांकन के लिए शुद्ध हो ।
  2. एक बड़े गोल-तली हुई कुप्पी या वाष्पीकरण कुप्पी में अंशों को एकत्र करें और सभी acetonitrile और अधिकांश पानी को निकाल दें. अंतिम PPA समाधान 10 मिलीलीटर से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  3. स्थानांतरण यह ध्यान केंद्रित करने के लिए एक ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब । सलाह दी जाए कि PPAs डिटर्जेंट जैसे पदार्थ हैं; इस प्रकार, बुलबुले विलायक के वाष्पीकरण के दौरान उत्पन्न किया जाएगा । हमने पाया है कि एथिल शराब के अलावा बुलबुला गठन घटता है ।
  4. वैक्यूम ध्यान केंद्रित । निर्वात वाष्पीकरण के दौरान, PPA की एक बड़ी राशि कंटेनर की दीवारों का पालन हो सकता है. इस HPLC पानी से कुप्पी की दीवार को बार में कुल्ला करके इसे ठीक करें । केंद्रित PPA और rinsate की संयुक्त मात्रा 30 मिलीलीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
  5. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के अंदर जलीय समाधान प्लेस ।
  6. फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में इस PPA समाधान फ्रीज:
    नोट: lyophilizer में तेजी से उदात्त होगा जो छोटे बर्फ क्रिस्टल में ठंड परिणाम फ्लैश. इसके अलावा, धीमी ठंड के स्वयं के गठन supramolecular संरचनाओं इकट्ठे अनुमति दे सकता है । एक और विकल्प (लेकिन कम वांछनीय) धीरे--८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में फ्रीज या एक सूखी बर्फ + एसीटोन मिश्रण का उपयोग कर फ्रीज करने के लिए है
    1. इससे पहले lyophilizer में केंद्रापसारक ट्यूब रखने, वेध या ट्यूब की टोपी को ढीला करने के लिए नमी नमूना बचने के लिए और प्रशीतन इकाई में एकत्र हो जाओ अनुमति देते हैं । -५४ ° c और ०.०१६ mbar के लिए सेट lyophilization इकाई सेट करें ।
      नोट: एक और विकल्प के लिए टोपी हटाने और एक पोंछ (एक रबर बैंड के साथ) खोलने के शीर्ष पर जगह है । इसके अलावा, हमने पाया है कि एक कोण पर ठंड नमूने या छोटे भागों में बर्फ तोड़ने सतह क्षेत्र में वृद्धि के कारण एक तेजी से और बेहतर lyophilization के लिए अनुमति देता है ।
    2. यदि ठोस पिघल करने के लिए शुरू होता है, यह एक कार्बनिक विलायक के निशान का संकेत हो सकता है (आमतौर पर acetonitrile) मौजूद हैं । ठंड कदम दोहराएं और lyophilization की हालत का आकलन करें ।
    3. यदि पिघलने बनी रहती है, वहां दो संभावित समाधान हैं:
      1. दो भागों में नमूना भाजित (ट्यूबों में रखा जा करने के लिए), पानी के साथ पतला, और फिर से फ्रीज । अक्सर इस समाधान का उपयोग न करें क्योंकि बड़ी मात्रा में कार्बनिक सॉल्वैंट्स उपकरणों को नुकसान पहुंचा सकता है ।
      2. वैकल्पिक रूप से, एक कुप्पी में नमूना जगह और वैक्यूम के तहत कार्बनिक विलायक लुप्त हो जाना । Lyophilizing एक नमूना है कि तरल रूप में है आमतौर पर bumping और PPA यौगिक के नुकसान की ओर जाता है ।

5. PPAs का भण्डारण

  1. एक-20 डिग्री सेल्सियस में PPAs की दुकान के साथ कड़ी कर दी और एक ट्यूब पर एक उचित लेबल के साथ Parafilm के साथ बंद कर दिया ।
  2. उपयोग करने से पहले, PPAs पर पानी वाष्प के संघनित्र से बचने के लिए एक निर्वात चैंबर में परिवेश तापमान के लिए वापस PPA लाने के लिए ।

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Representative Results

संश्लेषण और शुद्धि के बाद और भौतिक या जैविक मूल्यांकन से पहले, यह PPAs की जनता की सिफारिश की है फिर से जाँच कर रहे हैं और शुद्धता विश्लेषणात्मक HPLC का उपयोग कर पता लगाया. सामग्री लक्षण वर्णन या जैविक मूल्यांकन के लिए, PPAs > 95% की एक पवित्रता की जरूरत है । चित्रा 2 HPLC ट्रेस (ऊपर) और मालदी स्पेक्ट्रा (नीचे) उत्पाद की उपस्थिति की पुष्टि से पता चलता है । HPLC विश्लेषणात्मक प्रणाली वक्र (ईमेज) और एक ईमेज > 95% के तहत क्षेत्र को एकीकृत करेगा उत्पाद पवित्रता से संबंधित हो सकता है । यूवी आधारित HPLC प्रणालियों में, एक एकल, तेज चोटी को देखने की उम्मीद है । मालदी स्पेक्ट्रा ± 1 डीए के भीतर PPA की गणना आणविक वजन के अनुरूप होना चाहिए (मालदी द्वारा विश्लेषण की विधा पर निर्भर करता है) ।

PPAs के स्व-विधानसभा कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) (चित्रा 3, बी), परमाणु सेना माइक्रोस्कोपी (AFM) (चित्रा 3सी,डी), छोटे कोण एक्स-रे सहित असंख्य तकनीकों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है कैटरिंग (SAXS), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), और गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS). सफल आत्म विधानसभा दोनों AFM और उनि में अच्छी तरह से परिभाषित nanostructures में परिणाम होगा । स्व-इकट्ठा करने में विफलता या तो अनियमित समुच्चय है कि आकार में कई सौ nanometers है के गठन में परिणाम होगा ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि विश्लेषणात्मक HPLC वर्णलेख (ऊपर) और मालदी स्पेक्ट्रम (नीचे) के PPA C16V2एक2Spermine । यह आंकड़ा समद एट अल से संशोधित किया गया है । २०१७6; जॉन विले एंड संस, २०१८ की अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) micrograph. (क) उनि छवि nanofiber और जुड़े nanosheets के गठन दिखा रहा है, (ख) बढ़ाया बंडल नैनो शीट के गठन दिखा इनसेट, (ग) परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) micrograph, (घ) और ऊंचाई नक्शा से व्युत्पंन micrograph C16V2A2KDiethyelenetriamine. के X और Y अक्षों (D) नैनो-पत्रक चौड़ाई और नैनो-पत्रक ऊंचाई क्रमशः का प्रतिनिधित्व करता है । यह आंकड़ा समद एट अल से संशोधित किया गया है । २०१७6; जॉन विले एंड संस, २०१८ की अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित क़दम और संबंधित पेप्टाइड आधारित अणुओं (जैसे संकर PA-peptoids) के रूप में कुओं के रूप में PPAs संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । SPPS का उपयोग कर पेप्टाइड्स के संश्लेषण एक सीधी प्रक्रिया है, हालांकि जैविक होमिंग अणुओं युक्त पेप्टाइड्स के संश्लेषण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है. spermine, spermidine, diethyelenetriamine, आदिजैसे Polyamines कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए होमिंग अणुओं के रूप में कार्य कर सकते हैं13. PPAs nanostructures में विविध morphologies6के साथ स्व-इकट्ठा कर सकते हैं । उनके सकारात्मक प्रभारी भी अब संचलन समय के साथ सहायता कर सकते है (endosomal भागने के कारण) और एक अलग चयापचय प्रोफ़ाइल (जब पारंपरिक फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ तुलना में) । हालांकि, synthesizing PPAs और उनके एनालॉग प्राथमिक और माध्यमिक अमीन की उपस्थिति की वजह से एक विशेष चुनौती हो सकती है । प्रस्तुत सिंथेटिक रणनीति ओर्थोगोनल की रक्षा समूह के तर्कसंगत उपयोग के द्वारा इस चुनौती पर काबू । Dde अणु चुनिंदा प्राथमिक अमीन11के साथ ही प्रतिक्रिया से गुजरती है । बीओसी, दूसरी ओर, दोनों प्राथमिक और माध्यमिक अमीन के साथ अंधाधुंध प्रतिक्रिया करता है और इसलिए, केवल प्राथमिक अमीन की रक्षा के बाद जोड़ा जा सकता है । हम उल्लेख करना चाहते है कि अंय सुरक्षा समूहों बीओसी के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एसिटिक एनहाइड्राइड के साथ प्रतिक्रिया स्थाई रूप से माध्यमिक अमीन acetylate जाएगा (इस समूह के क्लीवेज के दौरान नहीं हटाया जाएगा) । इसी तरह, trifluoacetic एनहाइड्राइड का उपयोग एक आधार संवेदनशील सुरक्षा प्रदान करेगा, जबकि benzylcarbamate एक समूह है कि एच2/Ni14द्वारा हटाया जा सकता है दे देंगे । एक बार polyamines की जरूरत के रूप में संरक्षित कर रहे हैं, PPA के संश्लेषण मानक SPPS का उपयोग कर आगे बढ़ सकते हैं । युग्मन polyamine के आराम करने के लिए hydrophobic पूंछ-पेप्टाइड का निर्माण न केवल जोड़े को समय की एक लंबी अवधि लेता है, लेकिन यह भी दो बार अमीनो एसिड की दाढ़ राशि की आवश्यकता है । hydrophobic पूंछ के कुछ कुछ पारंपरिक सॉल्वैंट्स में कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से भंग नहीं हो सकता है या प्रारंभिक विघटन के बाद भी तेज हो सकती है । इस तरह की प्रतिक्रियाओं सबसे अच्छा नीचे कुप्पी दौर के लिए सभी reactants स्थानांतरित करके हल्के हीटिंग (४० डिग्री सेल्सियस) के तहत किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, एक जैकेट सिंथेसाइज़र पोत प्रतिक्रिया भर reactants गर्म रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि उपलब्ध है, एक माइक्रोवेव सिंथेसाइज़र युग्मन15के साथ सहायता कर सकते हैं ।

हालांकि मास स्पेक्ट्रोस्कोपी के कई रूपों PPAs की जनता को निर्धारित करने के लिए उपलब्ध हैं, हम अपनी पहचान के प्रयोजन के लिए मालदी स्पेक्ट्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया । हम मालदी आणविक आयन चोटियों के उत्पादन में अधिक प्रभावी हो पाया है, विखंडन और adduct गठन को कम करने. मालदी एक आयन है कि PPA के सबसे अधिक संभावना ionization राज्य से मेल खाती है उत्पंन क्रमादेशित किया जाना चाहिए । साधन प्रोग्रामिंग के अलावा एक विशेष शुल्क के आयन का उत्पादन करने के लिए, हम भी उपयुक्त मैट्रिक्स है कि हम उपयोग करेंगे मोड के लिए उपयुक्त है के साथ नमूने गठबंधन की जरूरत है ।

प्राधान्य अक्सर मालदी प्लेट पर नमक adducts फार्म की प्रवृत्ति है । यह समस्या नकारात्मक आरोपित अणुओं के साथ अधिक बार देखा जाता है । सबसे आम लवण सोडियम के होते है (Na+ = 23 डीए) और पोटेशियम (K+ = ३९ da). इन adducts को एसिटिक एसिड के 1 – 2 µ l को जोड़कर दबाया जा सकता है । PPAs आमतौर पर एच+ adduct प्रदान करते हैं । यह केवल सिंथेटिक और शोधन प्रक्रिया में ट्विटर पानी या HPLC पानी का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त आयनों की शुरूआत से बचने की सिफारिश की है । Borosilicate ग्लास कंटेनरों और प्रतिक्रिया जहाजों सोडियम आयनों की प्रशंसनीय मात्रा जो अंतिम उत्पाद में नमकीन पानी होगा शामिल हो सकते हैं । कांच के बरतन ध्यान से पिछले धोने के लिए nanopurewater का उपयोग कर कुल्ला ।

आणविक आयन चोटियों की पहचान भी मुश्किल हो जाता है अगर मैट्रिक्स समाधान पूरी तरह से ठोस मैट्रिक्स के साथ संतृप्त नहीं है. संतृप्ति सुनिश्चित करने के लिए, वहां हमेशा ठोस मैट्रिक्स की एक छोटी राशि है कि solubilized नहीं किया जाना चाहिए ।

एक अंतिम ध्यान दें के रूप में, कृपया विचार है कि कुछ PPAs या क़दम ईथर के अलावा पर किसी भी हाला फार्म नहीं हो सकता है । यह मुख्य रूप से अधिक हाइड्रोफिलिक PPAs में मनाया गया । ऐसी घटनाओं में, हम पहले सभी ईथर लुप्त हो जाना, एनएच4ओह के साथ अतिरिक्त TFA बेअसर और पानी और Acetonitrile (०.१% TFA या एनएच4oh के साथ) को पूरी तरह से इसे solubilize और फिर हमेशा की तरह शुद्ध करने के लिए आगे बढ़ना होगा ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्वयं के अत्यधिक शुद्ध वेरिएंट संयोजन polyamine आधारित पेप्टाइड amphiphiles (PPAs) और भी क़दम संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ओर्थोगोनल सुरक्षा/संरक्षण कदम अंय स्थितियों है कि प्राथमिक और माध्यमिक अमीन समूह के चयनात्मक मास्किंग की आवश्यकता होती है में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई विरोध नहीं है एलान

Acknowledgments

इस परियोजना नेब्रास्का चिकित्सा केंद्र के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया (स्टार्ट-अप फंड, एम सी-एस); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (Bronich) और अमेरिकन केमिकल सोसायटी, PRF # ५७४३४-DNI7 (MC-S) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl chloride resin  AappTec RTZ001
SynthwareTM synthesis vessel  Aldrich SYNP120050M
Dichloromethane Acros AC406920250 Fisher Sci. Catalogue #
Wrist Shaker Boekel Scientific 401000-2
Kaiser test kit Sigma-Aldrich 60017
2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol Sigma-Aldrich CDS004772
Anhydrous Methanol Acros AC610981000 Fisher Sci. Catalogue #
Chloranil test kit TCI TCC1771-KIT VWR Catalogue #
Di-tert butyl di-carbonate  Acros AC194670250 Fisher Sci. Catalogue #
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Hydrazine Acros AC296815000 FIsher Sci. Catalogue #
(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) p3biosystems 31001
4-methyl piperidine  Acros AC127515000 FIsher Sci. Catalogue #
Trifluoroacetic Acid AappTec CXZ035
Triisopropyl Silane Sigma-Aldrich 233781
Ether Fisher Scientific E138-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C8982
9-Aminoacridine Sigma-Aldrich 92817
Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane Fisher Scientific 09-730-21

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References

  1. Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
  2. Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
  3. Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. Self-assembly of biomolecular soft matter. Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).
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  6. Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
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केमिस्ट्री इश्यू १३६ पेप्टाइड amphiphiles सेल्फ असेंबली बायो मटेरियल्स Polyamine पेप्टाइड amphiphiles पेप्टाइड संश्लेषण ओर्थोगोनल protection groups nanofiber nanoparticle
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Samad, M. B., Maddeboina, K., Rodrigues de Almeida, N., Conda-Sheridan, M. Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials. J. Vis. Exp. (136), e57908, doi:10.3791/57908 (2018).

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