Summary
Syntesen av polyaminen-baserade peptid amphiphiles (energiköpsavtalen) är en betydande utmaning på grund av närvaron av flera amine kväveatomer, som kräver förnuftig användning av skydda grupper för att maskera dessa reaktiva funktioner. I den här artikeln beskriver vi en lättköpt metod för beredning av dessa nya klass av egen montering molekyler.
Abstract
Polyamine-baserade peptid Amphiphiles (energiköpsavtalen) är en ny klass av egen montering amfifila biomaterial-relaterade till den peptid amphiphiles (PAs). Traditionella PAs äger laddade aminosyror som solubilizing grupper (lysin, arginin), som är direkt anslutna till ett lipid-segment eller kan innehålla en länkare region av neutrala aminosyror. Tuning peptid sekvensen av PAs kan ge olika morfologier. Likaså energiköpsavtalen besitter ett hydrofoba segment och neutrala aminosyror, men också innehålla polyamine molekyler som vatten solubilizing (hydrofil) grupper. Som är fallet med PAs, energiköpsavtalen kan även själv sätta ihop till olika morfologier, inklusive små stavar, vridna nano-band och smält nano-ark, när upplöst i vatten. Men utgör förekomsten av både primära och sekundära aminer på en enda polyamine molekyl en betydande utmaning när syntetisera energiköpsavtalen. I detta papper visar vi ett enkelt protokoll, baserade på litteratur prejudikat, att uppnå en lättköpt syntes av energiköpsavtalen använder fasta fasen peptidsyntesen (SPPS). Detta protokoll kan utvidgas till syntesen av PAs och andra liknande system. Vi illustrerar också de steg som behövs för klyvning från harts, identifiering och rening.
Introduction
Egen montering peptid amphiphiles (PAs) är en klass av biomaterial som vanligtvis består av följande segment: a hydrofil huvud, (b) linker region och (c) hydrofoba svans. De flesta PAs beskrivs i litteraturen äger en hydrofil huvud består av laddade eller polar aminosyra rester1,2,3,4. PAs har hittat ett brett spektrum av applikationer i biomedicin inklusive sjukdom diagnostik, regenerativ medicin, läkemedel, etc.5. Baserat på deras aminosyrasekvens, kan PAs bilda ett brett utbud av nanostrukturer inklusive sfäriska miceller och nano-filament. Vi har nyligen rapporterat en klass av hybrid polyamine-baserade peptid amphiphiles, kallas energiköpsavtalen6. Den morfologier, egen montering kinetik och metabola nedbrytning, av dessa biomaterial, befanns vara relaterade till deras solubilizing huvud grupp. PPA nanostrukturerna visade dessutom inte toxicitet mot däggdjursceller (MiaPaCa2 och HeLa cell linjer) vid de testa koncentrationerna. PPA-baserade nanocarriers är attraktiva drog-leverans fordon eftersom: (1) polyamine upptag och metabolism har visats ökas i cancerceller, (2) katjoniska nanostrukturer kan uppnå endosomal fly7,8, vilket leder till högre omsättning och bosättning inom en cell, och (3) de ska ha en tydlig metaboliska profil jämfört med PA; till exempel, de blir stabilare mot proteaser som finns i den mänskliga kroppen (även om de kanske känslig för andra enzymer, såsom amine oxidases)9,10. Inköpsavtalen har också befunnits har olika morfologier, fysikalisk-kemiska egenskaper, nanopartiklar stelhet och församlingen kinetik beroende på längd och kostnad av enskilda PPA molekyl6. Häri, beskriver vi ett detaljerat protokoll för syntes, identifiering och rening av energiköpsavtalen som kan också tillämpas på beredning av PAs eller liknande hybrid peptid molekyler.
Eftersom polyaminer vanligen inte är kommersiellt tillgängliga i sina skyddade formulär, och skydda de primära och sekundära aminesna av polyaminer är av yttersta vikt för konjugera dem med aminosyror och andra molekyler, har vi sammanställt den syntetiska steg för att uppnå deras skydd. Det övergripande målet med detta protokoll är att tillhandahålla en enkel metod för att konjugera polyaminer till aminosyror. Polyaminer saknar en karboxylsyror grupp; Således, de kan inte kopplas till rinken Amide eller Wang hartser. Istället rekommenderas protokollet syntetiska hartser såsom 2-chlorotrityl klorid. Den största utmaningen för PPA syntes är förekomsten av primära och sekundära aminen funktionella grupper. För våra syften skyddade vi alla de sekundära aminesna i polyaminen samtidigt den primära aminogruppen på polyaminen ledig för att tillåta koppling reaktionen. Reaktionen var gjort på ett massivt stöd för en fast fas peptidsyntesen (SPPS) att underlätta arbete-upp efter varje koppling och deprotection steg. Följande protokoll är för både manuell och automatiserad syntes av energiköpsavtalen (även om kontrollen av några steg kommer utmanande i ett automatiserat system). Syntesen av dessa molekyler kan också utföras på en automatiserad synthesizer eller med hjälp av en mikrovågsugn reaktor (automatiskt eller halvautomatiskt). Reaktionsformel har sammanfattas i figur 1.
Figur 1: (A) A allmänna reaktionsformel för syntesen av energiköpsavtalen. (B) representativa polyaminer som kan användas till syntetiseras energiköpsavtalen beskrivs här. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. allmänna protokoll för syntes av energiköpsavtalen
- Beräkna omfattningen av syntes (vanligen mmol). Denna skala bygger på massan av PPA målbeloppet. Tänk på att reaktionen effektiviteten i SPPS minskar gradvis med en ökning av aminosyrasekvens. Exakta reaktion effektiviteten är därför svårt att beräkna.
- Räkna ut vikten av kådan användas enligt lastning av kådan. Lastning är hittade på behållaren eller protokollet analys av kådan och uttrycks i mmol/g. Följande formel kan användas för beräkning av kådan:
- Noga väga ut 2-chlorotrityl klorid harts (i vårt fall är lastning ~0.85 mmol)
- Placera kådan i en fritted syntes fartyget med följande specifikationer: kapacitet – 50 mL, Fritted skiva – 25 mm, porositet – Medium.
- Tillsätt 15 mL diklormetan (DCM) till harts.
- Anbringa syntes fartyget till en variabel hastighet mekanisk skakapparat (kolv shaker/omrörare) och vrid kärlen till 45° vinkel (eller vågrätt) för att maximera agitation.
- Tillåta harts pärlor att svälla i 15 min. förbättrar svullnad avkastningen av reaktion eftersom det underlättar molekylär diffusion och tillgängligheten till den aktiva platsen, effektivisera koppling.
- Lägg till 8 medel (2 mmol för en 0,25 mmol skala) av den önskade polyaminen (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropan, etc.) till harts och gör det möjligt att reagera i 5 h.
Obs: En mindre reaktion period skulle minska avkastningen. - En Kaiser göra test (se Tabell för material) för att bekräfta framgångsrik koppling av polyaminen till harts. Framgångsrik koppling av de primära aminesna ger en violett/blå färg, vilket motsvarar den fria aminen.
- Skydda den primära aminen gruppen med 4 medel av 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), upplöst i vattenfri metanol (15 mL), genom att skaka reaktion blandning över natten11.
Obs: En mindre reaktion tid minskar avkastningen. - Utföra en Kaiser test. Frånvaro blå färg från det Kåda pärlan bekräftar framgångsrika skydd. Vid misslyckade skydd av den primära aminen, upprepar du föregående steg.
- Rinna DCM och tvätta hartser två gånger med en blandning av DCM och DMF (2:1, 15 mL).
- Lös upp 20 medel (5 mmol) av di-tert butyl di-karbonat (Boc) i DCM (20 mL) och låt reaktionen att gå vidare för 3 h.
- Göra en kloranil testa (se Tabell för material) för att bekräfta komplett skydd av den sekundära aminen. Ett positivt test (skydd) ger en färglös eller ljus gul färg. Gratis sekundära aminer ger en mörk grön/blå färg, medan primära aminer ger en röd färg.
- Dränera vätska blandningen och tvätta två gånger med en blandning av DCM och DMF (2:1, 15 mL).
- Lägga till en 2% lösning av hydrazin i DMF (10 mL) och skaka i 1 h.
- En Kaiser göra test för att bekräfta lyckad deprotection av den primära aminen.
-
Lägg till önskad aminosyror i omvänd ordning som du skulle skriva/rita dem. Peptider dras från N termini till C termini men syntetiseras i motsatt riktning, C till N. Till exempel för en PPA kräver följande peptiden core - GLFD-, lägga till den asparaginsyra (D), följt av fenylalanin (F), leucin (L), och slutligen glycin (G).
Obs: De flesta aminosyror, följande koppling cocktail är lämpligt för fastsättning på polyamine laddad hartser.- Blanda 4 medel (1 mmol) av aminosyran Fmoc-skyddade, 3,95 motsvarigheter till 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) och 15 medel diisopropylethyl Amin (DIPEA).
- Lös upp dem i en blandning av DCM och DMF (1:1, 15 mL) och Sonikera cocktail i 2 min (tills fullständig upplösning).
- Vänta en ytterligare 3-5 min för att säkerställa att aktivering av karboxylsyra på aminosyran.
- Lägga till reaktionsblandningen fartyget. Genomföra reaktionen för 2-4 h i rumstemperatur.
Obs: Vi har hittat följande som effektiva alternativ till HBTU (som oftast kräver lägre mängder av aminosyror och koppling agent): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima. - En Kaiser göra test för att bekräfta framgångsrik koppling.
- De skydda Fmoc-gruppen från aminosyran genom att lägga till en 20% lösning av 4-metyl Piperidin (10 mL) i DMF. Göra det två gånger, varje gång som skakar reaktionsblandningen för 15 min.
Obs: Ett effektivt alternativ för borttagning av Fmoc är piperazin/DBU12.- Utföra en DCM (15 mL) tvätt mellan tillägg.
- En Kaiser göra test för att bekräfta lyckade de skydd av aminosyran.
- Tvätta kådan noggrant för att avlägsna alla spår av 4-metyl. Tvätta hartsen två gånger med DMF (10 mL), varje tvätt som varar i 5 min, och slutligen med DCM (10 mL) i 10 min.
- Lägg till alla de återstående aminosyrorna genom att successivt upprepa kopplingen och avinstallation skydd steg.
-
Slutligen, efter koppling alla nödvändiga aminosyror, konjugat hydrofoba svansen till sista aminosyran av den polyamine-peptid bygga:
- Lägga till 10 motsvarigheter till önskad karboxylsyra funktionaliteten för 9,5 motsvarigheter till HBTU och 12 medel av DIPEA löses i DCM och DMF blandning (1:1, 20 mL).
Obs: Tänk på än några svansar kan behöva en annan del av vätska (oftast en större procent av DCM) eller tillägg eller en annan lösningsmedel såsom N-metylpyrrolidon (NMP). - Sonikera cocktail för 5 – 10 min tills upplösning (vi har sett att det tar längre tid för svansen att helt upplösa) och lägga till fartyget.
Obs: För svansar som innehåller flera reaktiva platser, de kommer att behöva skyddas innan koppling dem. - Genomföra denna reaktion (koppling hydrofoba svansen) för minst 5 h, även om det är lämpligt att genomföra det övernattning för högsta möjliga avkastning.
- Lägga till 10 motsvarigheter till önskad karboxylsyra funktionaliteten för 9,5 motsvarigheter till HBTU och 12 medel av DIPEA löses i DCM och DMF blandning (1:1, 20 mL).
2. PPA klyvning från fasta stöd
Syftet med detta steg är klyvning av PPA från kådan och ta bort de Boc skydda grupperna från aminosyror och polyamine rester.
- Tvätta kådan med DMF (8 mL i 2 min) och två gånger med DCM (8 mL, varje gång för 5 min). Innan varje tillägg, dränera lösningsmedel från fartyget. När den sista tvättningen utförs, torr kådan under vakuum i 15 min.
- Förbered om klyvning lösningen med följande blandning förhållandet: 28:1:1 trifluorättiksyra (TFA): H2O: Triisopropyl silan (TIPS). Att göra 15 mL klyvning cocktail lägga 14 mL TFA, till 0,5 mL H2O och 0,5 mL av TIPS.
- Tillsätt denna klyvning lösning till harts och skaka för 2 – 4 timmar i rumstemperatur.
- Samla in lösningen i en 25 eller 50 mL runda botten kolven.
- Koncentrat av transfettsyror i vakuum till 1 – 2 mL med en rotationsindunstare vid reducerat tryck medan värme blandningen vid 40 ° C (inte överträffa 55 ° C för att undvika nedbrytning av PPA).
- Efter indunstning, tillsätt den erhållna TFA-lösningen (droppvis) till en rund botten kolv som innehåller vattenfri kalla eter (15 mL). Detta kommer omedelbart fällningen PPA.
- Dessutom lägga till vattenfri kalla eter (5 mL) till original kolven där TFA var koncentrerad.
- Sonikera denna kolv för att återställa ytterligare fasta ämnen och kombinera med eter lösningen från steg 2,6.
Obs: Överlåtande pipetten kan tvättas med en liten volym av DCM. Undvika att införa DMF under processen eftersom det tenderar att bilda en gel-liknande substans. - Placera kolven (täckt) i kylen och låt den stå över natten för att maximera nederbörd.
- Samla det utfällda materialet genom dammsugarfilter använder en sinterlamell filter tratt. De idealiska porstorlek är fina eller medium.
- Tvätta fällningen två gånger med kallt eter (5 – 10 mL) att ta bort eventuella kvarvarande organics.
3. identifiering av rå produkten med MALDI torkade-släpp-metoden
-
Matrix förberedelse för analys i positivt läge:
- För att starta molekylvikt analys med Matrix Assisted Laser Desorption/jonisering (MALDI) masspektrometri, lägga till 10-20 mg α-cyano-4-hydroxycinnamic acid i en mikrocentrifug rör.
- Lägga till en lösning av vatten/acetonitril (1:1, 1,0 mL) med 0,1% trifluorättiksyra (TFA). Blanda omsorgsfullt genom vortexa.
Obs: Denna matris bör användas för positivt laddade peptider. MALDI negativa läge är liknande men kräver en matris som innehåller 9-aminoacridine med 0,1% ammoniak som lösningsmedel additiv. - Tillsätt 1 – 2 µL av provet i den rostfria målplatta för MALDI och torka provet i luften. Tillsätt 1 – 2 µL av matrisen och torka den igen.
Obs: Plattorna har cirkulära markeringarna inrutade längs måltavlan för att hitta en viss plats.
- Analysera proverna i MALDI instrument att verifiera sin identitet. Elektrospray jonisering (ESI) är ett alternativ att bekräfta identiteten av energiköpsavtalen.
4. rening av inköpsavtalen med preparativ omvänd-fas högpresterande vätskekromatografi (HPLC) rening
-
Lös upp utfällningen PPA i ett minimum av acetonitril och vatten.
- Som en tumregel, Lös 100 mg torr rå PPA i mindre än 5 mL acetonitril och vatten. Mer hydrofoba energiköpsavtalen kan kräva en större andel av acetonitril att upplösa och kan också kräva en större volym spädningsvätska i allmänhet beroende på netto laddningen av energiköpsavtalen (tabell 1).
- Om fullständig upplösning inte äger rum, tillsätt 1% TFA (ACN eller H2O). Det är också möjligt att lägga till spårmängder av andra kompatibla lösningsmedel inklusive dimetylsulfoxid, metanol eller isopropanol (begränsa deras innehåll till 5%).
| Lösningsmedel | Positivt laddade energiköpsavtalen | Negativt laddade energiköpsavtalen | ||
| 0,1% transfettsyror i vatten | 0,1% NH3 i vatten | |||
| 0,1% transfettsyror i ACN | 0,1% NH3 i ACN | |||
Tabell 1: lösningsmedel system. Föreslog lösningsmedel system för positivt och negativt laddade energiköpsavtalen.
- Sonikera PPA i ett horn någon sonikator för 20 min på 10 s pulser med Amp1 48% eller 2-3 h i ultraljudsbad.
-
Sedan filtrera med 0,45 μm spruta filter följt av filtrering med 0,20 μm av polytetrafluoreten (PTFE) spruta filter. PPA lösningen bör vara klar och fri från alla partikelformiga material.
- Om filtrering är för svårt, Sonikera under en längre tid. Det rekommenderas starkt att PPA lösningen är renat omedelbart efter sprutan filtrering, som långvarig lagring kan orsaka att aggregera eller gelate, som kommer att kräva förnyad ultraljudsbehandling och, kanske, ny filtrering.
- Under och efter rening, använda HPLC grade lösningsmedel eller sådana som filtreras genom en 0,25 μm spruta/filtermembranet.
Obs: De vanligaste lösningsmedel villkor att rena energiköpsavtalen består i en gradient av H2O och ACN. - Använd en omvänd-phase HPLC standardinstrument för detta protokoll. Den bör omfatta en eluering gradient programmerare, ett binärt lösningsmedel leveranssystem, en UV-detektor kan upptäcka på 220 och 254 nm och en programmerbar bråkdel samlare. Det maximala flödet bör vara 50 mL/min.
- Använd en C-18 omvänd fas kolumn för separation. Kolumner i följande dimensioner kan användas beroende på massa fast att vara renat och nätet debitera i PPA (tabell 2).
| PPA kostnad | Partikelstorlek | Kolumnen storlek | Massan av rå PPA |
| + ve laddade | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| -ve laddade | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| + ve laddade | 5 μm | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
| -ve laddade | 5 μm | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
Tabell 2: föreslog kolumner: Kolumndimensioner, partikelstorlek och den maximala lastkapaciteten per injektion för C18 reverse phase HPLC kolonner
- Injicera PPA med en volym som bestäms av både kapaciteten av kolumnen och av volymen av injektion slingan av HPLC. Kör metoden HPLC gradient enligt de inställningar som ses i tabell 3 (eluering tid 40 min).
| Tid | Lösningsmedlet en (acetonitril) | Lösningsmedel B (vatten) | Flödeshastighet (mL/min) |
| 0 | 5% | 95% | Flödeshastighet beror på kolumnen förpackning och dess storlek. |
| 2 | 5% | 95% | |
| 35 | 95% | 5% | |
| 38 | 100% | 0% | |
| 40 | 5% | 95% |
Tabell 3: föreslagna lutning: Föreslagna omvänd fas lutning visar relativa sammansättningen av vatten vs acetonitril över en tidsperiod. Flödet klassar beror på kolumnen specifikationerna.
-
Analysera de fraktioner som samlas in på olika provrören med MALDI och avgöra vilka tube (eller rören) innehåller PPA. Detta bedöms genom att studera den molekylära vikten i varje rör.
- Kontrollera renheten av fraktioner på en analytiska HPLC. Använda en HPLC-gradient system utrustade med UV-detektor på 220 nm.
- Om det finns smuts, göra en extra cykel av rening genom HPLC. Ovan toningen som används för preparativ HPLC kan skalas till använda med den analytiska HPLC med programvaran kolumn omvandlare online. Varje fraktion vara mycket ≥ 95% ren för fysiska karakterisering eller biologisk utvärdering.
- Samla fraktionerna i ett stort rundkolv eller avdunstning kolv och ta bort alla acetonitril och det mesta av vattnet. Den slutliga PPA-lösningen bör vara mer än 10 mL.
- Överför detta koncentrat till en 50 mL centrifugrör. Observera att inköpsavtalen tvättmedel-liknande ämnen. Således kommer bubblor genereras under avdunstning av lösningsmedlet. Vi har funnit att tillägg av etanol minskar bubbla bildandet.
- Vakuum koncentrat koncentrat. Under vakuum avdunstningen, kanske en stor mängd PPA följer väggarna i behållaren. Återställa detta genom att upprepade gånger skölja kolven väggen med HPLC vatten. Den kombinera mängden koncentrerad PPA och den rinsate bör vara högst 30 mL.
- Placera en vattenlösning inne i en 50 mL tub.
-
Blixt frysa denna PPA lösning i flytande kväve:
Obs: Flash frysning resultat i mindre iskristaller som kommer sublima snabbare i lyophilizer. Dessutom får långsammare frysning tillåta bildandet av själv monterade supramolekylär strukturer. Ett annat alternativ (men mindre önskvärt) är att gradvis frysa i-80 ° C frys eller att frysa med en torris + aceton blandning- Innan du placerar centrifugröret i lyophilizer, perforera eller lossa locket på röret så att fukt fly provet och få samlas i kylaggregatet. Ställa in frystorka den enheten ange till-54 ° C och 0,016 mbar.
Obs: Ett annat alternativ är att ta bort locket och placera en torka (med en gummisnodd) ovanpå öppningen. Dessutom har vi funnit att frysa prover i en vinkel eller bryta isen i små portioner möjliggör en snabbare och bättre frystorka den på grund av en ökning av ytan. - Om fast börjar smälta, kan det indikera spår av ett organiskt lösningsmedel (vanligtvis acetonitril) är närvarande. Upprepa steget frysning och bedöma skicket på frystorka den.
- Om smältande kvarstår, finns det två möjliga lösningar:
- Split provet i två delar (för att placeras i rör), späd med vatten och frysa igen. Använd inte denna lösning ofta eftersom stora mängder organiska lösningsmedel kan skada utrustningen.
- Alternativt placera provet i en kolv och ytterligare avdunsta i organiskt lösningsmedel under vakuum. Frystorkning ett prov som är i flytande form oftast leder till stöta och förlust av PPA föreningen.
- Innan du placerar centrifugröret i lyophilizer, perforera eller lossa locket på röret så att fukt fly provet och få samlas i kylaggregatet. Ställa in frystorka den enheten ange till-54 ° C och 0,016 mbar.
5. förvaring av energiköpsavtalen
- Lagra energiköpsavtalen i en-20 ° C med mössor åtdragna och förseglad med Parafilm på ett rör med en korrekt etikett.
- Före användning, ta PPA tillbaka till rumstemperatur i en vakuumkammare att undvika kondensering av vattenånga på energiköpsavtalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter syntes och rening och innan utvärdering av fysikalisk-kemiska eller biologiska rekommenderas massorna av energiköpsavtalen är åter kontrolleras och renhet konstaterat använder analytiska HPLC. För materialkarakterisering eller biologisk utvärdering, inköpsavtalen behöver ha en renhetsgrad på > 95%. Figur 2 visar HPLC trace (överst) och MALDI spectra (nederst) bekräftar förekomsten av produkten. HPLC analytiska system kommer att integrera området under kurvan (AUC) och ett AUC > 95% kan relateras till produkt renhet. I UV-baserade HPLC system, räkna med att se en enda, skarp topp. MALDI spectra bör motsvara till det av PPA inom ±1 Da (beroende på läget av analys av MALDI) beräknade molekylvikt.
Den självmontering av energiköpsavtalen kan visualiseras och analyseras med hjälp av otaliga tekniker, inklusive överföring elektronmikroskopi (TEM) (figur 3A, B), Atomic Force Microscopy (AFM) (figur 3 c, D), liten vinkel röntgen Spridning (SAXS), Scanning Electron Microscopy (SEM), och dynamiskt ljus spridning (DLS). Framgångsrika medför självmontering väldefinierade nanostrukturer i både AFM och TEM. Underlåtenhet att själv montera kommer antingen resultera i bildandet av oregelbundna aggregat som är flera hundra nanometer i storlek.
Figur 2: Representant analytisk HPLC kromatogrammet (överst) och MALDI spektrum (nederst) av PPA C16V22Spermine. Denna siffra har ändrats från Samad et al. 20176; återanvändas med tillåtelse av John Wiley & Sons, 2018. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa överföring elektronmikroskop (TEM) Mikrograf. (A), TEM bilden visar bildandet av nanofiber och smält nu, (B) förstorad infälld visar bildandet av medföljande nano-ark, (C) Atomic force microscopy (AFM) Mikrograf, (D) och höjd karta härrör från den Mikrograf för C16V2en2KDiethyelenetriamine. X och Y-axeln av (D) representerar nano-blad bredd och nano-blad höjd respektive. Denna siffra har ändrats från Samad et al. 20176; återanvändas med tillåtelse av John Wiley & Sons, 2018. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoll som beskrivs här kan användas för att syntetisera energiköpsavtalen brunnar som PAs och relaterad peptid-baserad molekyler (såsom hybrid PA-peptoids). Även om syntesen av peptider med SPPS är en enkel procedur, kan syntesen av peptider som innehåller biologiska målsökande molekyler vara särskilt utmanande. Polyaminer som spermine, spermidine, diethyelenetriamine, etc., kan fungera som målsökande molekyler för inriktning cancer celler13. Energiköpsavtalen kan själv sätta ihop till nanostrukturer med olika morfologier6. Deras positiva laddning kan också stöd med längre omsättning tid (på grund av endosomal fly) och olika metaboliska profil (jämfört med traditionella PA). Dock kan syntetisera energiköpsavtalen och deras analoger vara en särskild utmaning på grund av förekomsten av primära och sekundära aminer. Strategin presenteras syntetiska övervinner denna utmaning genom en rationell användning av ortogonala skydda gruppen. DDE-molekylen genomgår selektivt reaktion bara med primära aminer11. BOC, däremot, reagerar urskillningslöst med både primära och sekundära aminer och kan därför endast läggas efter den primära aminen är skyddad. Vi skulle vilja nämna att andra skydda grupper kan användas i stället för Boc. Reaktion med ättiksyraanhydrid kommer exempelvis permanent acetylate de sekundära aminer (denna grupp inte kommer tas bort under klyvning). Jämväl, användning av trifluoacetic bauxit ger en base-känsliga skydd medan benzylcarbamate kommer att ge en grupp som kan avlägsnas genom H2/Ni14. När polyaminer skyddas som behövs, kan syntesen av PPA fortsätta använda standard SPPS. Kopplingen hydrofoba svansen till resten av den polyamine-peptid bygga inte bara tar en längre tidsperiod till par, men också kräver två gånger molar mängden aminosyror. Några av de hydrofoba svansar kanske inte löser sig väl vid rumstemperatur i vissa traditionella lösningsmedel eller kan utlösa även efter ursprungliga upplösning. Sådana reaktioner är bäst utförs under mild värme (40 ° C) genom att överföra alla reaktanterna för att runda botten kolven. Alternativt kan ett mantelskyddat synthesizer fartyg användas att hålla reaktanterna varm hela reaktionen. Om tillgängligt, kan en mikrovågsugn synt stöd med koppling15.
Även om många former av massa spektroskopi är tillgängliga för att avgöra den stora massan av energiköpsavtalen, använde vi MALDI-spektroskopi för våra identifiering. Vi har hittat MALDI för att vara mer effektiva på att producera de molekylära Jon topparna, vilket minimerar fragmentering och addukt bildandet. MALDI ska programmeras att generera en Jon som motsvarar den mest sannolika jonisering i PPA. Utöver programmering instrumentet att producera ion av en särskild avgift, behöver vi också att kombinera proverna med lämplig matris som är lämplig för det läget som vi kommer att använda.
PAs har ofta en tendens att bilda salt addukter på MALDI plattan. Problemet ses oftare med negativt laddade molekyler. De mest vanliga salter är de av natrium (Na+ = 23 Da) och kalium (K+ = 39 Da). Dessa addukter maj undertryckas genom att lägga till 1 – 2 µL av ättiksyra. Inköpsavtalen ger oftast H+ addukt. Det rekommenderas att endast använda nanopore vatten eller HPLC vatten hela syntetiskt och reningsprocessen för att undvika införandet av ytterligare joner. Borosilikatglas behållare och reaktionskärl kan innehålla betydande mängder natriumjoner som kommer att läcka ut i den slutliga produkten. Skölj de glas som omsorgsfullt med nanopurewater för den sista tvättningen.
Att identifiera de molekylära Jon topparna också blir svårt om modellösning inte är fullt mättad med fasta matrisen. För att säkerställa mättnad, bör det alltid finnas en liten mängd av den solida matris som inte har solubilized.
Som en sista anmärkning, vänligen överväg att vissa energiköpsavtalen eller PAs inte kan bilda eventuell fällning vid tillägg av eter. Detta observerades huvudsakligen i mer hydrofil energiköpsavtalen. I sådana händelser, kommer vi först avdunsta alla eter, neutralisera den överskjutande TFA med NH4OH och tillsätt vatten och acetonitril (med 0,1% TFA eller NH4OH) för att fullt ut solubilize det och fortsätt sedan att rena som vanligt.
Protokollet beskrivs här kan användas för att syntetisera högt rena varianter av självmonterande polyamine baserade peptid amphiphiles (energiköpsavtalen) och också PAs. Ortogonala skydd/deprotection stegen kan användas i andra situationer som kräver selektivt maskering av primära och sekundära aminen grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera
Acknowledgments
Projektet finansierades av University of Nebraska Medical Center (nystartade fonder, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) och American Chemical Society, PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R.
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , Springer. 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
