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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad3 sinalização atividade usando um sistema de repórter de adenovírus. Este sistema controla a atividade transcricional em tempo real e pode ser aplicado para as duas células únicas em vitro e em animais vivosmodelos.

Abstract

Transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização regula muitas funções importantes, necessárias para a homeostase celular e é comumente encontrada overexpressed em muitas doenças, incluindo câncer. TGF-β está fortemente implicada na metástase durante a progressão de câncer estágio atrasado, ativando um subconjunto de células tumorais migratórias e invasivo. Métodos atuais para análise da via de sinalização focar em modelos de ponto de extremidade, que muitas vezes tentam medir sinalização post-hoc de evento biológico e não refletem a natureza progressiva da doença. Aqui, demonstramos um romance adenovírus repórter sistema específico para a via de sinalização do TGF-β/Smad3 que pode detectar a ativação transcricional de células vivas. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. O uso de um repórter fluorescente permite para a imagem latente de células únicas ao vivo em tempo real com a identificação directa das células transcricionalmente ativas. Estimulação de células infectadas com TGF-β exibe apenas um subconjunto de células que são transcricionalmente ativo e envolvido em funções biológicas específicas. Esta abordagem permite alta especificidade e sensibilidade em um nível de célula única para melhorar a compreensão das funções biológicas relacionadas com o TGF-β sinalização em vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 atividade transcricional de células implantados no vivo pode ser analisada através de imagens de IVIS convencional e monitorada ao vivo durante a progressão do tumor, proporcionando uma visão única a dinâmica da via de sinalização do TGF-β. Nosso protocolo descreve um sistema de entrega de repórter vantajoso permitindo rápida de imagem de alta produtividade de vias de sinalização de célula viva tanto in vitro e in vivo. Esse método pode ser expandido para uma gama de imagem com base em ensaios e presentes como uma abordagem sensível e reprodutível para biologia básica e desenvolvimento terapêutico.

Introduction

Fator de crescimento transformante β (TGF-β) é uma citocina essencial envolvida no desenvolvimento humano que sinaliza através uma heterodimérica complexa consistindo de tipo II e tipo I receptores1. Vinculação ao tipo do receptor II resultados no recrutamento e na fosforilação do tipo do receptor, que por sua vez, fosforila a jusante Smad2/3 proteínas2,3. Estas ativado Smad2/3 proteínas se ligam a Smad4, formando um complexo que translocates para o núcleo e regula a transcrição de gene4. Sob condições homeostáticas TGF-β/Smad sinalização é fortemente regulamentada; no entanto, em muitas doenças, a via de sinalização é desregulamentada e frequentemente overexpressed levando a progressão da doença5,6,7. Estudos recentes têm demonstrado que a resposta celular ao TGF-β é heterogênea e subpopulações de células ativas de TGF-β/Smad são responsáveis por uma função biológica em uma maneira tempo-dependente8,9. Análise de celular comuns de sinalização do TGF-β/Smad envolve o uso de ensaios de ponto de extremidade fixo que fornecem apenas um instantâneo da atividade celular e muitas vezes dosar a média de efeito de TGF-β/Smad10. Esses métodos, no entanto, podem não representar fielmente os comportamentos moleculares de TGF-β/Smad sinalização no estado fisiológico durante a progressão da doença. Análise baseada em imagem de captura células vivas a dinâmica dos processos celulares e biológicos com ambos uma compreensão espacial e temporal.

Nosso objetivo foi desenvolver um método sensível de alto rendimento para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad sinalização utilizando reagentes baseados em adenovírus. Aqui, estamos infectados a linha de celular de câncer de mama humano MDA-MB-231 com um adenovírus expressando a sequência de ligação CAGA de Smad3 do motivo e a luciferase (Luc) ou gene repórter de Td-tomate (Td-Tom). Adenovírus repórter sistemas fornecem um método rápido e barato para introdução de plasmídeo que pode resultar em uma taxa de 100% de infecção em linhas de células de câncer. Sistemas de adenovírus repórter também foram aplicados com sucesso ao linhas celulares que são difíceis de transfect com plasmídeo convencional11. Neste protocolo, descreveremos um processo não-invasivo e pode ser reproduzido para alcançar a imagem de célula viva da via de sinalização TGFβ/Smad tanto in vivo e in vitro.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Melbourne Comitê de ética Animal.

Note: The sequence, construction and generation protocol for the adenoviral vectors pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP and pAd-CAGA12-Luc/Td-Tom have been previously described11,12, 13. Todos os vetores estão disponíveis comercialmente.

1. vírus Titer determinação usando 50% Dose infecciosa de cultura de tecidos (TCID50)

  1. Prepare-se 1 x 106 células HEK293A em 10 mL de DMEM + 10% FBS mídia.
  2. Sementes de 100 µ l de suspensão de células em cada poço de uma placa de cultura de células 96 poços fundo plano.
  3. Prepare-se 1 mL de uma diluição de 1: 100 de estoque de vírus no meio completo. Adicione 11 µ l de vírus diluídos a cada poço da coluna 1.
  4. Realizar diluições em série 10 vezes diretamente na placa de 96 bem misturando 11 µ l de vírus diluído com 100 µ l de suspensão de células até uma diluição final de 1 x1012 é alcançado. Embora as células são não-aderente, nesta fase, o número de células transferidos entre poços permanece constante.
  5. Pipete 11 µ l de cada diluição em cada coluna, começando com a maior diluição de 104. Pontas de pipetas substitua cada diluição limite cruzado de partículas virais.
  6. Adicione 11 µ l de mídia livre de vírus completa a coluna 12 como controlo negativo.
  7. Incube a placa por 7-10 dias a 37 ° C, com 10% de CO2.
  8. Usando um microscópio, marca o número de poços em cada coluna mostrando sinais de efeito citopático ou citotóxico. Considere um bem positivo se houver qualquer sinal de infecção.
  9. Calcule a fração de poços positivos para cada diluição, usando o método estatístico (1938) de Reed e Muench14.
  10. Calcular a distância proporcional (PD) usando: (A-50)/(A-B), onde A é a resposta de percentagem acima ou igual a 50% e B é a resposta percentual inferior a 50%.
  11. Calcular TCID50 usando: 10X-PD, onde X é a diluição dando uma resposta maior que 50%.
  12. Calcular o título viral de usando o seguinte: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovírus MOI determinação

  1. Semente 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células com 500 μL de DMEM meios de cultura contendo 5% FBS em cada poço de um 12 bem placa (confluência de célula de 35%, 6 poços no total).
  2. Calcular os volumes de estoque Ad-CMV-Td-Tom exigido para 0, 250, 500, 2500 e 5000 MOI usando fórmula a seguir: MOI = (volume [μL] x PFU/μL) / número de células. Para Ad-CMV-Td-Tom com um título de 1 x 1010 (PFU/mL), os volumes de infecção pelo vírus MOIs necessários são 0, 3.75, 7.5, 37,5 e 75 µ l, respectivamente.
  3. Infectar as células com os volumes calculados de Ad-CMV-Td-Tom na seção 2.2 pipetando diretamente ações virais nos poços com mistura completa.
  4. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.
  5. Remova a mídia dos poços e corrigir imediatamente as células com 500 μL de formol a 10% por 5 min.
  6. Aspirar o formol de poços e lavar os poços com 500 µ l de PBS uma vez.
  7. Mancha o núcleo da célula com 500 μL de solução de Hoechst por 5 min.
  8. Remover a solução de Hoechst e lavar os poços com 500 µ l de PBS 3 vezes.
  9. Imagem da proteína Td-tomate e núcleo celular sinal usando 200 ampliação de X em um microscópio de fluorescência. Excitar a proteína Td-tomate em 554 nm e o corante Hoechst em 352 nm.
  10. Analise imagens usando o ImageJ para determinar o trabalho de que moi necessários para 100% de infecção de Td-tomate15.

3. dual-adenovírus transdução em células únicas ao vivo

  1. Semente 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células com 500 μL de DMEM meios de cultura contendo 5% FBS em cada poço de um 12 bem placa (confluência de célula de 35%, 2 poços no total).
  2. Infect cells with 75 μL of Ad-CMV-GFP (titer = 5 x 109 PFU/mL) and 7.5 μL of Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL) to obtain a 2,500 MOI, which can achieve 100% infection positivity.
  3. Trate as células com ou sem 0.25 μL de TGF-β por alvéolo (10 mg/mL em estoque, 5 ng / µ l como a concentração final) imediatamente após a infecção do vírus adenoide.
  4. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.
  5. Imagem ao vivo as células com o microscópio de fluorescência de contraste de fase. Excitar a GFP a 470 nm e proteína Td-tomate em 554 nm.
  6. Consertar as células e manchar o núcleo celular, conforme descrito em etapas 1.6 - 1.9.
  7. Imagem da proteína Td-tomate e Hoechst mancham usando um microscópio de fluorescência. Excitar o corante Hoechst em 352 nm.
  8. Usando o ImageJ, calcule que a porcentagem de GFP e tomate-Td positivo células15.

4. ao vivo única célula sinalização na cicatrização de feridas ensaio

  1. Sementes de 4-5 x 105 MDA-MB-231 células com 1 mL de DMEM meios de cultura contendo 5% FBS em cada poço de um 6 placa bem (confluência de célula de 50%, 2 poços no total).
  2. Infect the cells with 22.5 μL of Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).
  3. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.
  4. Risque duas linhas cruzadas sobre a camada de células de cada poço usando uma ponta de pipeta P200.
  5. Remover a velha mídia de poços e substituir com 2 mL de fresco 5% a FBS mídia com ou sem 0,5 μL de TGF-β por alvéolo (10 mg/mL em estoque, 5 ng/μL, concentração final).
  6. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 5 min e leve as imagens das áreas selecionadas ferida usando 100 ampliação de X em um microscópio de contraste de fase.
  7. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.
  8. Com imagens do encerramento da ferida para as mesmas áreas como antes.
  9. Corrigir as células, manchar o núcleo da célula, conforme descrito em etapas 1.6 - 1.9 e visualizar o sinal Td-tomate na área ferida e área não-ferida usando 200 ampliação de X em um microscópio de fluorescência.
  10. Quantificar a porcentagem de células positivas Td-tomate na área de não-ferida usando o ImageJ software15e ferida.

5. in Vitro Luciferase ensaio

  1. Preparar uma suspensão de células de 3-5 x 104 MDA-MB-231 células em 1 mL de mídia DMEM contendo 5% FBS.
  2. Infect cell suspension with 2.5 μL of Ad-CAGA12-Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).
  3. Semente as células infectadas em 96 uma placa bem no 3.000 células/100 µ l/poço.
  4. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.
  5. Remover a velha mídia de poços e substituir com 100 µ l de frescos 5% FBS meios de comunicação com ou sem 0,1 μL de TGF-β por alvéolo (1 mg/mL em estoque, 1 ng / µ l como a concentração final) e na presença ou ausência de 0.17 μL de inibidor de TGF-β por alvéolo (7 mg/mL em estoque 12 ng/μL, concentração final) (uma romance proteína de armadilha ligante TGF-β, Chen et al, trabalho não publicado).
  6. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.
  7. Descongelar o substrato de sistema de ensaio de luciferase e preparar 1 x celular cultura reagente de Lise em água bidestilada (DDW).
  8. Remova a mídia de 96 poços e lyse poços com 50 μL de 1 x celular cultura lise no gelo usando um agitador orbital com agitação suave durante 30 min.
  9. Transferir 30 μL de lisado de cada poço em um prato de luciferase opaco e deixar a placa aquecer a temperatura ambiente.
  10. O luminómetro, crie um novo protocolo. Selecione para 1 injector com medições antes e após a injeção. Definir medidas antes da injeção em 1 s para tanto atraso na medição e o Tempo de integração. Para depois da medição da injeção, definir o Volume da injeção a 40 µ l, com um atraso na medição de 1 s após a injeção e 5 s Tempo de integração. Confirme as configurações selecionando Okey.
  11. Colocar o tubo injector DDW e clique no botão de 1 Injector sob as configurações Prime para limpar o tubo injetor antes do uso. Em seguida, remova o tubo injector da DDW e coloque no ar, seguido de mais dois primos do injector 1 para lavar toda a solução do tubo. Coloca o tubo injector em substrato de Firefly e novo Prime duas vezes para preparar o substrato.
  12. Coloque a placa de luciferase opaco com as amostras para o luminómetro e selecione as opções do software. Destaque os poços de interesse e clique em aplicar. Pressione Iniciar para medir o sinal do luciferase.
  13. Uma vez concluídas as medições, remova e lave a placa com água. Recupere qualquer substrato restante no tubo injector, colocando o tubo de ar e injetor Prime 1 volta no tubo de substrato de vaga-lume. Colocar o tubo injector DDW e realizar mais dois primos para limpar o tubo injetor de qualquer substrato restante.

6. célula preparação para viver sinalização Imaging In Vivo

  1. 48 h antes da implantação do tumor, 2-3 x 106 MDA-MB-231 células de sementes em frascos de2 175 cm (10 frascos no total). Cultura de células em 20 mL de mídia DMEM contendo 5% FBS a 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 h later, add 300 μL of Ad-CAGA12-Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500) into each flask. Manter as células em cultura para outro 24h.
  3. No dia da implantação, remova a mídia velha e lavar as células de adenovírus infectado uma vez com 20 mL de PBS, pH 7,4. Adicionar 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA para o frasco e agitar o frasco ligeiramente para permitir que a tripsina cobrir toda a superfície do balão. Coloque o frasco em para a incubadora 37 ° C, 10% de CO2 por 3 min.
  4. Saciar a tripsina, adicionando 8 mL de mídia contendo FBS DMEM balões. Transferi todas as suspensões celulares em um frasco de reagente de vidro.
  5. Contar o número de células usando um hemocytometer e transferir a 4,8 x 107 células em dois tubos de centrífuga de 50 ml.
  6. Centrifugar as células a 400 x g durante 5 min à RT para remover tripsina e ressuspender as células em 720 mL de mídia de FBS-DMEM fresca.
  7. Transferir as suspensões celulares em um tubo estéril 5 mL e adicionar 160 μL Matrigel (suspensão total matrigel 10%).
  8. Manter as células no gelo até a implantação.

7. ortotópico implantação

  1. Pesa 12 ratos SCID e aleatoriamente, alocar os ratos em grupos controle e tratamento (6 ratos/grupo).
  2. Execute a implantação em um bio-armário estéril para manter um ambiente estéril. Anestesiar o mouse utilizando isoflurano 2,5-4,5%, com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min. Coloque o mouse sobre uma almofada de calor e dispensar uma gota de lubrificante pomada em ambos os olhos para evitar danos da córnea. Corrigi o mouse para a almofada do calor em uma posição supina enquanto mantendo a anestesia, colocando o focinho em um cone de nariz ligado para o isoflurano.
  3. Confirme o sucesso da anestesia pela falta de reação aos pés pitada. Reduza o isoflurano para uma dose de manutenção de 1,5-2,5% 1 L/min de oxigênio para o lembrete de implantação.
  4. Limpe a pele do mamilo quarta em ambos os lados da linha mediana usando o cotonete embebido em etanol a 80%.
  5. Encontrar 4th do tecido mamário através da palpação e aperte a gordura almofada para expor ainda mais o tecido.
  6. Misture a suspensão de células bem pipetando para cima e para baixo. Delicadamente, Aspire 50 µ l de mistura de célula em uma seringa de insulina de 27G e injetar do tecido mamário em ambos os lados do rato.
  7. Confirme uma injeção bem sucedida pela sensação de inchaço da almofada gorda. Liberar a gordura almofada delicadamente e coloque o mouse volta para a jaula.
  8. Deixe as gaiolas na rampa pelo menos 30 min permitir que os ratos ganhar consciência e em seguida, coloque as gaiolas de volta na sala de espera de 3 dias de calor.

8. IVIS Imaging

  1. Abra o software de Imagem de viver .
  2. Inicialize o sistema IVIS clicando no botão Inicializar IVIS sistema no painel de controle. Espere até que o sinal de temperatura fica verde.
  3. Selecione o modo de imagem Luminescent no painel de controle.
  4. Ligue o isoflurano anestesia para a câmara e o sistema IVIS.
  5. Anestesiar os ratos usando 2,5-4,5% de isoflurano com oxigênio de 1 L/min. Uma vez anestesiado, conjunto isoflurano de 1,5-2,5% para manutenção. Injete 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferina em ratos pela injeção intraperitoneal (i.p.).
  6. Transfira imediatamente ratos no sistema IVIS, colocá-los na plataforma de imagem com temperatura controlada e seu nariz para dentro do cone de nariz.
  7. Clique no botão Configuração de sequência no painel de controle e selecione Médio Binning.
  8. Configurar o tempo de exposição da imagem latente da seguinte forma: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s e 120 s. início de imagem aproximadamente 3 min após a injeção de luciferina e continuar a imagem até que o sinal começa a cair (normalmente isto levará cerca de 20 min).
  9. Remover os ratos de IVIS mantendo isoflurano anestésico através de um cone de nariz e tratar os ratos com 50 µ l PBS ou 50 µ l TGF-β sinalização inibidor (50 μg/tumor) através da injeção intra-tumor.
  10. Ponha os ratos na gaiola e deixá-los sobre a almofada do calor pelo menos 30 min. Em seguida, coloque a gaiola de volta na sala de espera.
  11. Repita IVIS procedimento de imagem, como descrito acima no dia seguinte ao tratamento.

9. análise de dados

  1. Abrir arquivos salvo em software de Imagem de viver .
  2. Encontrar as informações de imagem usando o modo de exibição | Informações da imagem.
  3. Selecione fotos tiradas em um ponto de tempo semelhante com o mesmo tempo de exposição. Carregar fotos como um grupo.
  4. Desmarque a caixa Individual em Ajustar a imagem para normalizar a intensidade.
  5. Selecione o modo de fóton para analisar a intensidade. Quantificar a intensidade do sinal, selecionando o botão de Região de interesse (ROI) em Ferramentas de ROI.
  6. Arraste o círculo ROI para a região que contém o sinal bioluminescente e clique no botão de medida para adquirir a intensidade do sinal.

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Representative Results

Viver a única célula de imagem em vitro

Para avaliar com precisão a ativação de TGF-β/Smad sinalização em células únicas usando reagentes adenovírus com base, é importante determinar primeiro a multiplicidade ideal de infecção (MOI) para cada linha de celular. O MOI ideal é determinado quando 100% das células são positivas para infecção adenovírus com nenhum efeito citopático ou citotóxica presente. Para determinar isso, usamos um repórter Ad-CMV-Td-Tom constitutivamente ativo que agia como um marcador de infecção positiva. A percentagem de células de adenovírus infectado foi aumentada de forma dependente MOI de 0 a 5.000 MOI. Em 2.500 MOI, observamos a expressão de Td-Tom 100% nas células MDA-MB-231 (figura 1A, 1B). Intensidade do pixel/célula também aumentou com MOI, proporcionando maior sensibilidade e detecção de saída transcriptional (Figura 1). Therefore, a working MOI of 2,500 was used to perform a dual infection where cells were infected with Ad-CMV-GFP (served as positive control for cell infection) and Ad-CAGA12-Td-Tom simultaneously. Células únicas apresentaram níveis variados de expressão Td-Tom indicando heterogênea ativação de TGF-β/Smad3 transcrição em células em células vivas e fixas. (Figura 2A, 2B). 100% de células MDA-MB-231 apresentadas com expressão de GFP, enquanto apenas cerca 26% de células exibido detectável atividade transcricional de TGF-β/Smad3 24 h após a estimulação de TGF-β, em comparação com 0% de positividade sem tratamento de TGF-β (Figura 2). To use the adenovirus based reagent to investigate the TGF-β/Smad3 transcriptional activity during biological processes, MDA-MB-231 cells were infected with Ad-CAGA12-Td-Tom at 2500 MOI and subjected to a wound healing assay. Células infectadas do MDA-MB-231 exibiram comportamento normal de migração e células tratadas com 5 ng/mL TGF-β mostrou encerramento de ferida melhorada em comparação com não-TGF-β células tratadas (Figura 3A). Notavelmente, cerca de 62% células na área ferida apresentaram atividade transcricional positiva TGF-β/Smad3, que é significativamente maior do que o observado na área não-ferida (32%) após tratamento de TGF-β (Figura3B). Como tal, os reagentes baseados em adenovírus validado sua aplicação para a imagem latente da via de sinalização do TGF-β em célula única viva em vitro.

Viver o TGF-β sinalização de imagem na vivo

The sensitivity of the Ad-CAGA12- Luc reporter was first tested in vitro in response to TGF-β stimulation and the presence of a TGF-β inhibitor. Quando células infectadas do MDA-MB-231 foram estimuladas com 1 ng/mL TGF-β, atividade de repórter do luciferase aumentou 1,200-fold em comparação com níveis basais de MDA-MB-231 não tratados. Esta resposta foi notavelmente bloqueada por 12 µ g/mL de inibidor de TGF-β (Figura 4A). The Ad-CAGA12-Luc reagent was subsequently tested in a breast tumor orthotopic implantation animal model. Tanto o controle e o inibidor de TGF-β trataram grupos demonstrou actividade semelhante do luciferase repórter: antes do tratamento. No entanto, para o grupo de controle, o sinal do luciferase não mudou após o tratamento de PBS, Considerando que, em camundongos tratadocom com o inibidor de TGF-β mostrou redução de cerca de 3 vezes sinal (Figura 4B, 4C). Coletivamente, estes resultados demonstram o potencial para monitoramento ao vivo e em tempo real de TGF-β sinalização atividade na vivo sem a necessidade de sacrifício de animais.

Figure 1
Figura 1. Determinação do MOI de reagente baseados em adenovírus. MDA-MB-231 células foram infectadas com Ad-CMV-Td-Tom no MOI diferente e semeadas em uma placa de 12 poços. 24 h após a infecção, as células foram fixadas e nuclear manchadas pela Hoechst. Imagens do (A) foram para visualizar células positivas Td-Tom (vermelhas) e núcleo (azul) e quantificado pelo ImageJ. (B) células positivas percentual de Td-Tom. (C) Td-Tom pixel celular/intensidade normalizada para o fundo. Estes números são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes. Dados mostrados são meios de triplica ± SD. escala barra = 50 µm (200x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Imagem de célula única para infecção dupla. MDA-MB-231 cells were dual infected with Ad-CMV-GFP and Ad-CAGA12-Td-Tom at MOI (2,500) and seeded into a 12 wells plate. 24 h após a infecção, as células foram tratadas com ou sem 5 ng/mL TGF-β. () 24 h após o tratamento, as células foram ao vivo fotografada para visualizar GFP positivo (verde) e Td-Tom positivo (vermelhas) células. As células foram então corrigidas e nuclear manchadas pela Hoechst para quantificação. (B) imagens foram tiradas para visualizar GFP positivo (verde), células (vermelhas) positivas de Td-Tom e núcleo (azul). (C) o GFP ou Td-Tom células positivas foram quantificadas pelo ImageJ e calculou-se a porcentagem de células positivas. Estes números são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes. Dados mostrados são meios de ± triplica significância estatística de SD. foi determinada pelo teste t de Student (* * * p ≤0.0001). Barra de escala = 50 µm (200x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Célula viva TGF-β sinalização promove a migração celular. MDA-MB-231 cells were infected with Ad-CAGA12-Td-Tom at MOI (2,500) and seeded onto a 6 wells plate. 24 h após a infecção, as células foram riscadas usando uma ponta de pipeta P200 para criar uma ferida e mídia substituído com ou sem 5 ng/mL TGF-β. Após outro 24 h, as células foram fixadas e nuclear manchadas pela Hoechst para representação visual. (A) fase de contraste de fechamento da ferida, escala barra = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positivo (vermelhas) células e núcleo (azul). Barra de escala = 50 µm (200 X) células positivas (C) Td-Tom foram quantificadas pelo ImageJ e calculou-se a porcentagem de células positivas. Estes números são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes. Dados mostrados são meios de ± triplica significância estatística de SD. foi determinada pelo teste t de Student (* * * p ≤0.0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Na vivo viver de imagem sinalização do TGF-β. (A) MDA-MB-231 cells were infected with Ad-CAGA12-Luc and then seeded into 96 wells plate for 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com ou sem 1 ng/mL TGF-β na presença ou ausência de inibidor de TGF-β 12 µ g/mL durante a noite. A atividade do luciferase foi medida com base no lisado celular. Atividades do luciferase foram apresentadas como a dobra de indução normalizada para a sem controle de tratamento. Data shown are means of triplicates ± SD. (B) MDA-MB-231 cells were infected with Ad-CAGA12-Luc 24 h before implantation. As células foram implantadas do tecido mamário em ambos os lados dos ratos SCID. 72 h depois, IVIS imagem foi realizada antes e após o tratamento de 24 h (PBS para o grupo de controle) e inibidor de TGF-β 50 µ g/tumor por grupo de tratamento. (C) Photon flux foi quantificada pelo software de imagem de viver. Dados mostrados são meios de cada grupo de tratamento (n = 12) ± SD. estatística significado foi determinada pelo teste t de Student (* * p ≤0.01, * * * p ≤0.0001). p/s se refere a fótons/s. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós desenvolvemos uma técnica para permitir a imagem em tempo real de TGF-β/Smad3 sinalização em células únicas ao vivo. Usando este método novo, anteriormente identificamos uma subpopulação de células com atividade transcricional TGF-β/Smad3 dinâmica que estava associada com invasão reforçada e migração8. Esse método melhora na tradicionais ensaios para sinalização do TGF-β, tais como borrões ocidentais de fosforilação Smad3 e TGF-β direcionados a expressão gênica, capturando a heterogeneidade de TGF-β/Smad3 sinalização dentro da população de tumor e destacando o importância da biologia celular único. Além disso, métodos alternativos de célula única imagem tais como translocação nuclear pode ser demorado e caro de se realizada em células vivem e não podem sempre traduzir a transcrição de gene16,17. Enquanto esses métodos são importantes para examinar as montante vias de transdução de sinal, o sistema de repórter de adenovírus fornece uma perspectiva única sobre TGF-β/Smad3 sinalização em células individuais em relação à função biológica.

Significativamente, nosso método fornece um método sensível e reprodutível na vivo detecção da via de sinalização do TGF-β/Smad3 em tempo real durante a progressão do tumor e tratamento. Semelhante ao tradicional do luciferase estável na vivo de imagem, detecção de TGF-β/Smad3 sinalização dentro do mouse é dependente do número de células e o nível de promotor atividade18. Enquanto o tecido subcutâneo fornece pouca interferência para análise, maior profundidade de células irá reduzir a sensibilidade da detecção do sinal. É possível expandir o método para uso em outros órgãos, como pulmão e osso e outros tipos de câncer; no entanto, otimização de sinal ou ex vivo imagem é recomendada para alcançar a sensibilidade necessária para o modelo de câncer de interesse.

Um benefício adicional do uso do sistema de repórter de adenovírus é que sua aplicação é susceptível de expandir a análise de múltiplas vias de sinalização simultaneamente em células vivas. Na Figura 2A, temos demonstrado que células MDA-MB-231 poderiam ser transfectadas com 2 vetores adenovírus separado, CMV-GFP e CAGA-TOM. Este sistema de dual-infecção pode ser expandido ainda mais para relatar duas diferentes vias de sinalização via tanto proteínas repórter de fluorescência e repórteres do luciferase (usando proteínas de repórter de luciferase de vaga-lume e Guassia). Nosso laboratório alcançou sinalização simultânea das vias de sinalização BMP/Smad1 e TGF-β/Smad3 em um número de linhas de células de câncer ao vivo (dados não mostrados).

Adenovírus repórter sistemas fornecem um método fácil e conveniente para a imagem latente de célula viva da via de sinalização do TGF-β/Smad ambos em vitro e em vivo. Este sistema tem vantagens distintas sobre outros sistemas de repórter comumente usados. Em primeiro lugar, vetores adenovírus são relatados para ter entre a mais alta eficácia de transdução viral, tornando-os um sistema ideal para linhas de celulares que são difíceis de transduce19,20,21,22. Além com os atuais avanços em tecnologias de virais, vetores adenovírus 'covarde' podem ser gerados, removendo a maior parte do genoma viral, permitindo aumento exógeno DNA capacidade23. Em comparação com sistemas de entrega não-virais, vetores adenovírus representam uma aplicação de baixo custo, rápida e fácil para transdução de célula que resulta em maior entrega eficiência19,20,21 ,22.

Este protocolo utiliza um sistema de expressão de segunda geração adenovírus, que é incompetente de replicação em células de mamíferos que não expressam as proteínas E1a e E1b, minimizando o risco de biossegurança24. No entanto, apesar de estes recursos de biossegurança, adenovírus partículas ainda podem aprimorados transduce células humanas primárias com eficácia elevada25,26. E.U. nível de biossegurança 2 e contenção de vetores adenovírus é recomendado quando manipulação e eliminação de adenovírus materiais contaminados. Amplificação em grande escala de adenovírus em células HEK293A pode resultar em uma geração rara de replicação "wild-type" adenovírus27. Rastreio de PCR deve ser realizado para identificar a contaminação do selvagem-tipo27.

Vetores de replicação-incompetente adenovírus são transitórios na expressão e não integrar com o anfitrião DNA20,21. É recomendável que o experimentador identificar a estabilidade na expressão de sua proteína de repórter, quando se utiliza o sistema de repórter de adenovírus para confirmar a validade das experiências a longo prazo. O tempo de expressão do vetor adenovírus dentro de uma célula é proporcional ao tempo de divisão da célula e MOI viral. Para garantir resultados reprodutíveis, é fundamental que a titulação viral com precisão é determinado para cada lote de viral. Além disso, excessivamente elevados volumes do adenovírus podem resultar em efeitos citotóxicos ou citopático e é importante que um ideal MOI é empiricamente determinada para cada célula forrada usado para garantir melhores resultados. Além disso, na vivo uso de vetores adenovírus pode induzir respostas imunes; onde a resposta imune não é a principal observação do experimento, imunológico comprometido animais são recomendados20,21. Adicionais de controle de qualidade é necessário ao usar os vetores adenovírus a respostas imunes de alvo, embora o uso do adenovírus foi validado como um adjuvante para terapias de vacina28,29.

O sistema de repórter de adenovírus pode ser usado em uma ampla gama de linhas de células primárias e culta de divisão e não dividindo natureza20,22. Usando o sistema de repórter de adenovírus, conseguimos 100% as taxas de infecção em um número de linhas de células de câncer incluindo o cérebro, mama, colorretal como células primárias Mouse embriológico fibroblasto (MEF) e Canine renal epitelial (MDCK) bem. Além disso, vetores adenovírus podem ser modificados ainda mais para aumentar a afinidade por receptores específicos do tipo de célula, fornecendo o órgão melhor direcionamento e eficácia para transdução30,31.

Aplicações desse método podem ser expandidas para outras vias de sinalização e anfitriões de células. As principais vantagens do sistema de adenovírus repórter incluem a eficácia de transdução barato, alta, rápida instalação experimental e falta de integração com o host DNA21,32. Esse método pode ser aplicado a muitos ensaios atuais e na vivo modelos, incluindo na avaliação de novas terapêuticas alvo33. Esperamos que o uso desta técnica irá aumentar a nossa compreensão da relação entre a sinalização de caminhos e processos biológicos, levando a novas descobertas biológicas e o desenvolvimento de novas terapias.

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Disclosures

Os autores relatam que não há conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para H-JZ. TMBW é um destinatário de um prêmio de pós-graduação de Austrália do governo australiano e a bolsa de Top-Up Ann Henderson do Australian Rotary Health em parceira com o Rotary de Templestowe e jante por uma cura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

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References

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Pesquisa sobre o câncer edição 137 TGF-β live imagem latente da pilha adenovírus celular sinalização ativação transcricional de mama câncer Smad3,
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Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

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