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Immunology and Infection

पूरे रक्त प्रवाह Cytometry विश्लेषण द्वारा मानव Monocyte सबसेट का लक्षण वर्णन

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/57941
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 4, *1,2, *1,2
1Department of Surgery, Vascular Biology Research Centre, Westmead Hospital, 2Westmead Clinical School, Department of Surgery, The University of Sydney, 3Westmead Research Hub, Westmead Institute for Medical Research, 4Institute for Clinical Pathology and Medical Research, Westmead Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम पूरे रक्त प्रवाह cytometry द्वारा निस्र्पक monocyte उपसमुच्चय के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह रूपरेखा कैसे गेट करने के लिए उपसमुच्चय और सतह मार्करों की उनकी अभिव्यक्ति का आकलन और एम 1 (भड़काऊ) और M2 मार्करों (विरोधी भड़काऊ) की अभिव्यक्ति के आकलन का एक उदाहरण दे शामिल है ।

Abstract

Monocytes इन कोशिकाओं को विभिंन भड़काऊ विकारों और परिवर्तन में महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं, उनके सबसेट अनुपात और कार्यों सहित, रोग महत्व हो सकता है । monocytes के लिए परिवर्तन की जांच के लिए एक आदर्श विधि पूरे रक्त प्रवाह cytometry के नमूनों की ंयूनतम हैंडलिंग के रूप में इस विधि द्वारा artifactual सेल सक्रियण सीमा है । हालांकि, कई अलग दृष्टिकोण monocyte सबसेट अध्ययन के बीच उपसमुच्चय की असंगत पहचान के लिए अग्रणी गेट करने के लिए ले रहे हैं । यहां हम एक पूरे रक्त प्रवाह cytometry का उपयोग करने की पहचान करने और मानव monocyte उपसमुच्चय (शास्त्रीय, मध्यवर्ती, और गैर शास्त्रीय) विशेषताएं की विधि का प्रदर्शन । हम कैसे प्रवाह cytometry के लिए रक्त के नमूनों को तैयार करने के लिए रूपरेखा, गेट उपसमुच्चय (सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को हटा दिया गया है), और सतह मार्करों के monocyte सबसेट अभिव्यक्ति का निर्धारण-इस उदाहरण में एम 1 और M2 मार्करों. इस प्रोटोकॉल अंय अध्ययनों कि monocyte सबसेट अनुपात और अंय कार्यात्मक मार्करों के monocyte सबसेट अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए एक मानक गेटिंग विधि की आवश्यकता के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।

Introduction

Monocytes सफेद रक्त कोशिकाओं का एक प्रकार है जो को बढ़ावा देने और सूजन को हल करने में एक प्रमुख भूमिका निभा रहे हैं । monocytes के तीन मुख्य सबसेट मांयता प्राप्त है, शास्त्रीय (~ ८५%), मध्यवर्ती (~ 5%), और गैर शास्त्रीय (~ 10%) monocytes, जो विभेदन (सीडी) 14 और CD16 अभिव्यक्ति1के क्लस्टर के अपने स्तर की विशेषता है । monocyte सबसेट के अनुपात रोग की उपस्थिति के साथ अलग कर सकते हैं, जैसे विभिन्न भड़काऊ राज्यों में मध्यवर्ती के अनुपात में वृद्धि हुई2,हृदय रोग सहित3 , जहां मध्यवर्ती के स्तर पर है नैदानिक घटनाओं के साथ जुड़े4,5. इसके अलावा, रोग की स्थिति में, monocytes भी कार्यात्मक परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं, कई सतह मार्कर अभिव्यक्ति6,7में एक अंतर से detectable परिवर्तन के साथ । ऐसा ही एक उदाहरण है monocyte m1-विषम, एम सी मैक्रोफेज, जो हृदय रोग, मधुमेह, मोटापा, और चयापचय सिंड्रोम7,8,9 में मनाया गया है के साथ जुड़े मार्करों में वृद्धि , 10.

प्रवाह cytometry की लोकप्रियता monocyte सबसेट अनुपात और समारोह का आकलन करने के बावजूद, वहां नमूना तैयारी में एक काफी परिवर्तनशीलता और अध्ययन जो यह मुश्किल ऐसे अध्ययनों के बीच निष्कर्षों की तुलना करने के लिए बनाता है के बीच गेटिंग है । महत्वपूर्ण बात, वहां monocyte उपसमुच्चय के सीमांकन में कोई आम सहमति है, अभी तक एक मानकीकृत दृष्टिकोण कई रोगों में सबसेट अनुपात में परिवर्तन के नैदानिक महत्व दिया आवश्यक है । गेटिंग में कठिनाई का हिस्सा तथ्य यह है कि monocytes शास्त्रीय से गैर-शास्त्रीय सबसेट11 के लिए और जैसे, monocytes एक सतत स्पेक्ट्रम के रूप में अस्तित्व के बजाय अलग आबादी 12 से अंतर से उठता है . दिलचस्प है, Zawada एट अल. दिखाया गया है कि या तो एक आयताकार या चतुर्भुज गेटिंग मध्यवर्ती सबसेट का उपयोग कर, दोनों एक हृदय समापन बिंदु13भविष्यवाणी की है कि एक उच्च मध्यवर्ती सबसेट के परिणामस्वरूप । इस पर प्रकाश डाला गया है कि, अनुपात कम करने की गणना के लिए, प्रमुख मुद्दा विभिंन नमूनों के बीच एक सुसंगत गेटिंग रणनीति लागू है (और अध्ययन), बजाय के बीच निश्चित भेदभाव करने का प्रयास । जबकि निश्चित गेटिंग अधिक महत्वपूर्ण जब समारोह का आकलन हो सकता है, सबसेट के बीच मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन वृद्धिशील12,14है, और इस प्रकार फिर से, गेटिंग में निरंतरता शायद महत्वपूर्ण है । जैसे, एक उद्देश्य गेटिंग तरीका है कि reproducibly अलग नमूनों के बीच monocyte उपसमुच्चय बांटता है की जरूरत है । यहां प्रस्तुत विधि का उद्देश्य एक स्पष्ट विवरण और गेटिंग कार्यरत तकनीक के लिए औचित्य के साथ गेट monocyte उपसमुच्चय है और सतह मार्कर अभिव्यक्ति के लिए उपसमुच्चय का आकलन, इस प्रकार एक विधि है जो शोधकर्ताओं की अनुमति देता है प्रदान करने के लिए है इस तकनीक के उपयोग में विश्वास जब विभिंन नमूनों का आकलन ।

Protocol

इस अध्ययन को WSLHD ह्यूमन रिसर्च एथिक्स कमेटी (HREC) (अनुमोदन AU RED HREC/15/WMEAD/289) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. पूरे रक्त प्रवाह Cytometry के लिए नमूना तैयारी

नोट: के रूप में मानव रक्त संक्रामक संभावित है, नमूना सेट अप एक खतरा डाकू में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

  1. प्रतिभागियों से रक्त के नमूनों को 3 मिलीलीटर ईथीलीन डायमाइन टेट्रा एसिटिक एसिड (EDTA) ट्यूबों में एकत्र करें ।
  2. एक रुधिर विश्लेषक या hemocytometer का उपयोग कर सफेद रक्त कोशिका (WBC) गिनती निर्धारित करें ।
  3. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) (पीएच ~ ७.४) के साथ पतला करने के लिए एकाग्रता को समायोजित करने के लिए ~ 5 x 106 WBC/एमएल ।
  4. ट्यूबों की संख्या के लिए पर्याप्त मास्टर मिश्रण तैयार (जैसे, 14 ट्यूबों के लिए, 16x मास्टर मिक्स तैयार) ५० µ एल रक्त, ०.७५ µ एल विरोधी CD14-V450, ०.५ µ एल विरोधी CD16-APC, और ०.६२५ µ एल विरोधी एचएलए-डॉ-PerCP के 16x संस्करणों के संयोजन के द्वारा । भंवर और पिपेट ५१.९ प्रत्येक ट्यूब (तालिका 1) में मिश्रण के µ एल ।
    नोट: एंटीबॉडी इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के लिए इष्टतम धुंधला सांद्रता निर्धारित करने के लिए titrated होना चाहिए ।
  5. सरफ़ेस मार्कर जोड़ें (M1 और M2 या isotype नियंत्रण, phycoerythrin (पीई) बला) एंटीबॉडी (उदाहरण के अनुसार तालिका 2) और टी कोशिकाओं के लिए पीई लेबल मार्करों (CD3), बी कोशिकाओं (CD19), न्यूट्रोफिल (CD66b), और प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं (CD56) (तालिका 3). भंवर और 30 मिनट, अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी ।
    नोट: लिम्फोसाइटों, न्यूट्रोफिल और NK कक्षों के लिए मार्कर केवल गेटिंग पद्धति की मांयता के लिए शामिल हैं ।
  6. जोड़ें २५० µ संयुक्त लाल रक्त कोशिका lysis के एल/WBC फिक्सिंग समाधान, भंवर धीरे तुरंत, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए मशीन ।
  7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २६० x g पर नीचे पंजाब और स्पिन कोशिकाओं के २५० µ एल जोड़ें ।
  8. supernatant निकालें, 1% formaldehyde के ३०० µ l में कक्ष पुन: निलंबित ।
    नोट: Formaldehyde विषाक्त है । nitrile दस्ताने का प्रयोग करें और धुएं डाकू में उपयोग करें ।
  9. 4 ° c पर स्टोर प्रकाश से संरक्षित जब तक विश्लेषण किया जाता है ।
    नोट: प्रवाह विश्लेषण नमूना तैयारी के ४८ ज के भीतर किया जा करने के लिए सिफारिश की है.

2. फ्लो Cytometry

  1. चेक फ्लो cytometer लॉग इन सुनिश्चित करने के लिए सुविधा कर्मचारियों ने गुणवत्ता नियंत्रण जांच की है ।
    नोट: विश्लेषण, साधन गुणवत्ता नियंत्रण और लगातार लक्ष्य को बनाए रखने के बीच निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण मोतियों का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता की सिफारिश कर रहे हैं.
  2. के लिए प्रवाह cytometry प्रयोग सेट, "पर नया प्रयोग तो नया नमूना" और "नई ट्यूब" ट्यूबों जोड़ने के लिए क्लिक करें । आइकन पर क्लिक करके bivariate भूखंडों का चयन करें और अक्ष पैरामीटर्स का चयन करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करें. एक CD16/CD14 भूखंड और समय के साथ एक डिटेक्टर को प्रदर्शित करने के अधिग्रहण की निगरानी भूखंड का समावेश सुनिश्चित करना ।
  3. ट्यूब डालें और "मोल" पर क्लिक करें । साधन वोल्टेज सेटिंग्स सुनिश्चित करना है कि डिटेक्टर संकेतों पैमाने पर बंद नहीं कर रहे हैं की जाँच करें ।
  4. CD14/CD16 प्लॉट के monocyte गेट में गिरने कोशिकाओं का निरीक्षण । रिकॉर्डिंग सीमा सेट करने के लिए ५,००० घटनाओं के लिए शास्त्रीय monocyte गेट और पर क्लिक करें "रिकॉर्ड".
  5. शेष ट्यूबों के लिए डेटा रिकॉर्ड करने के लिए जारी रखें । सभी ट्यूबों के लिए डेटा के बाद दर्ज किया गया है, विश्लेषण के लिए fcs फ़ाइलों के रूप में निर्यात प्रवाह डेटा ।
    नोट: सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, एकल रंग क्षतिपूर्ति नियंत्रण दर्ज किया जाना चाहिए. एक मुआवजा मैट्रिक्स की गणना और विश्लेषण से पहले डेटा के लिए लागू किया जा सकता है वर्णक्रमीय फैल पर15,16के लिए खाते ।

3. Monocyte गेटिंग

  1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में फ़ाइलें खोलें । डबल क्लिक करें ट्यूब नाम और चुनें पैरामीटर ड्रॉपडाउन मेनू से एक आगे तितर बितर क्षेत्र FSC (क)/forward तितर बितर ऊंचाई FSC (एच) भूखंड पर कोशिकाओं कल्पना । बहुभुज गेट उपकरण आइकन पर क्लिक करके और कोशिकाओं के रूप में (चित्रा 1a) संलग्न करके एक नक़ल अपवर्जन गेट बनाएँ ।
  2. gated कक्षों का चयन करें (gated क्षेत्र पर डबल क्लिक करके) और नए प्रदर्शन बॉक्स में एक FSC (a)/side स्कैटर एसएससी (a) प्लॉट पर कक्षों को प्रदर्शित करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू पैरामीटर्स को समायोजित करे । आयताकार गेट आइकन पर क्लिक करें और उदारता से आगे और पक्ष तितर बितर गुणों के आधार पर monocyte जनसंख्या का चयन करने के लिए लिम्फोसाइटों, NK कोशिकाओं के बहुमत के बाहर है, और granulocytes (आंकड़ा 1b) ।
  3. gated कक्षों का चयन करें और किसी CD14/CD16 प्लॉट पर, ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग कर पैरामीटर्स का चयन कर पुनर्प्रदर्शन । बहुभुज द्वार पर क्लिक करें monocytes का चयन करने के लिए उनकी विशेषता "┐" आकार (चित्रा 1C) के आधार पर ।
  4. gated कक्षों का चयन करें और पैरामीटर का चयन करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके एक CD16/एचएलए-DR प्लॉट पर monocytes प्रदर्शित । बहुभुज गेट पर क्लिक करें एचएलए-DR सकारात्मक कोशिकाओं का चयन करें और किसी भी शेष NK कोशिकाओं और17 न्यूट्रोफिल (1 d) के बाहर ।
  5. gated कक्षों का चयन करें और एचएलए-dr धनात्मक कक्षों पर एक CD14/एचएलए-dr प्लॉट ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग कर पैरामीटर्स का चयन करने के लिए प्रदर्शित । बहुभुज गेट पर क्लिक करें और एचएलए को बाहर करने के लिए एक गेट ड्रा-डॉ उच्च/CD14 कम कोशिकाओं (बी कोशिकाओं एचएलए के उच्च स्तर व्यक्त-dr लेकिन नहीं CD14) (चित्रा 1E) ।
    नोट: बी सेल संदूषण हो सकता है और इसलिए जांच की जानी चाहिए । यदि चित्रा 1C में गैर शास्त्रीय जनसंख्या अपनी बाईं करने के लिए कोशिकाओं से अलग नहीं है, तो संदूषण की संभावना है । यदि B कक्ष गैर-शास्त्रीय monocytes के साथ अधिव्याप्त नहीं हैं, तो चरण ३.५ को छोड़ दिया जा सकता है ।
  6. gated कक्षों का चयन करें और उंहें किसी CD16/CD14 प्लॉट पर प्रदर्शित करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करें । भूखंड विकल्पों में से चुनें "ज़ेबरा भूखंड" जो monocyte सबसेट गेट्स सबसेट अनुपात (चित्रा 1F) निर्धारित करने के लिए तैयार हो सकेंगे ।
    नोट: यदि ज़ेबरा प्लॉट विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर उपलब्ध नहीं है, छद्म रंग (चिकनी) या समोच्च भूखंड उपयुक्त हो सकता है ।
  7. आयताकार गेट आइकन पर क्लिक करें और CD14 उच्च/CD16 कम, शास्त्रीय monocyte जनसंख्या के आसपास एक लगभग आयताकार फाटक ड्राइंग द्वारा शास्त्रीय monocytes का चयन । के तहत "प्रदर्शन" चुनें "दिखाएं माध्य" शास्त्रीय monocytes के लिए औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित करने के लिए । गेट इस तरह समायोजित करें कि जनसंख्या बाईं और दाईं ओर औसत से एक बराबर वितरण किया है छोड़ दिया करने के लिए सभी कोशिकाओं को शामिल ।
  8. एक आयताकार गेट है कि शास्त्रीय गेट के अधिकार के लिए कोशिकाओं को शामिल ड्राइंग द्वारा मध्यवर्ती जनसंख्या का चयन करें । गेट के नीचे समायोजित गाढ़ा हलकों कि पूरी तरह से शास्त्रीय monocyte गेट, जो यह सुनिश्चित करता है कि मध्यवर्ती सबसेट एक CD14 अभिव्यक्ति है के भीतर है के नीचे के साथ गेट संरेखित द्वारा गैर शास्त्रीय कोशिकाओं को बाहर करने के लिए वर्तमान नामकरण के अनुरूप मुख्य शास्त्रीय जनसंख्या ।
  9. गैर-शास्त्रीय सबसेट मध्यवर्ती सबसेट के निचले किनारे से नीचे एक आयताकार बॉक्स ड्राइंग द्वारा, जनसंख्या (चित्रा 1F) के नीचे करने के लिए सभी कोशिकाओं का चयन ।
  10. "प्रदर्शन" के तहत प्रत्येक monocyte सबसेट का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए "दिखाएँ गेट आवृत्तियों" का चयन करें.

4. गेटिंग विधि का सत्यापन

  1. यह निर्धारित करने के लिए कि संभावित रूप से प्रदूषित कोशिका प्रकार प्रभावी रूप से gated-आउट हैं, पहले टी कोशिकाओं (CD3), बी कोशिकाओं (CD19), न्यूट्रोफिल (CD66b), और NK कोशिकाओं (CD56) (चित्रा 2) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ विभिन्न कोशिका आबादी की पहचान ।
    नोट: यहां टी कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल monocytes के "┐" आकार के करीब नहीं बैठते हैं और चित्रा 1Cमें बाहर gated हैं.
  2. पुष्टि करें कि NK कक्ष चरण ३.४ (चित्र 1 d) में निकाल दिए जाते हैं, और B कक्ष चरण ३.५ (आरेख 1E) में आरेख 3में दिखाए गए के रूप में निकाल दिए जाते हैं । यदि NK कोशिकाओं या बी कोशिकाओं gated-आउट नहीं कर रहे हैं, फिर से फाटकों को समायोजित ।

5. Phenotypic Monocyte मार्कर अभिव्यक्ति

  1. प्रत्येक monocyte सबसेट से कक्षों का चयन करें । ड्रॉपडाउन पैरामीटर्स में परिवर्तन प्रत्येक monocyte सबसेट (चित्रा 1F) प्रत्येक मार्कर और उसके मिलान isotype (चित्रा 4) प्रदर्शित करने के लिए एक हिस्टोग्राम बनाने के लिए ।
  2. संबंधित isotype नियंत्रण की तुलना में प्रत्येक मार्कर (माध्य या ज्यामितीय माध्य) की अभिव्यक्ति की डिग्री की गणना करें ।

Representative Results

monocyte गेटिंग रणनीति और प्रवाह cytometry विश्लेषण यहां इस्तेमाल किया (चित्रा 1) सफलतापूर्वक monocyte उपसमुच्चय gated और उनके रिश्तेदार अनुपात से पता चला । (इस नमूने के लिए) अनुपात ८८.१% शास्त्रीय संगीत, ४.३३% मध्यवर्ती, और ७.४९% गैर शास्त्रीय के रूप में की गणना की गई । इन सबसेट गेट्स बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल या NK कोशिकाओं है, जो मार्करों CD19, CD3, CD56, और CD66b, क्रमशः के साथ पुष्टि की गई थी के साथ दूषित नहीं थे । अंय आबादी की सापेक्ष स्थिति का आकलन करके, यह स्पष्ट है कि टी कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल एक CD16/CD14 भूखंड पर monocyte "┐" आकार के बाहर अच्छी तरह से गिर (चित्रा 2a और 2d) । हालांकि, दोनों NK कोशिकाओं और बी सेल की आबादी गैर-शास्त्रीय monocyte जनसंख्या (चित्रा 2 बी और 2c) के साथ छा । गेटिंग रणनीति के कदम (चित्रा1 डी और 1E) NK कोशिकाओं (चित्रा 3ए) और बी कोशिकाओं को बाहर करने के लिए पुष्टि की गई (चित्रबी) । यद्यपि बी सेल की आबादी में गैर-शास्त्रीय monocytes का एक छोटा-सा भाग शामिल था, यह राशि नगण्य थी.

सबसेट gated कर रहा है, जो करने के लिए वे विभिंन सतह मार्करों व्यक्त की डिग्री, M1 (CD64, CD86, और CD120b) और M2 (CD163, CD11b, और CD93) का आकलन किया गया था । मार्क्स ने उनके संगत isotype नियंत्रणों की तुलना में सकारात्मक अभिव्यक्ति दिखाई, जैसा कि हिस्टोग्राम की शिफ्ट (चित्रा 4) द्वारा देखा गया है । मार्करों का औसत isotype नियंत्रण की तुलना में अधिक था ।

एक रक्त का नमूना है, जो चार ट्यूबों में विभाजित किया गया था करने के लिए इस गेटिंग रणनीति के आवेदन, सना हुआ और अलग से विश्लेषण, ट्यूबों (तालिका 4) के बीच तुलनीय परिणाम पैदावार ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि monocyte गेटिंग रणनीति पूरे मानव रक्त में । (क) FSC (क) बनाम FSC (ज) भूखंड: गेटिंग कोशिकाओं है कि एक बराबर क्षेत्र और ऊंचाई है, इस प्रकार के झुरमुट को हटाने (ग्रेटर FSC (ए) FSC के सापेक्ष (एच)) और मलबे (बहुत कम FSC) K = १००० । (ख) FSC (क) बनाम एसएससी (क) भूखंड: monocytes का व्यापक चयन उनके एसएससी/FSC संपत्तियों के आधार पर. (C) CD16 vs CD14 plot: गेटिंग को उनकी विशेषता "┐" शेप के आधार पर monocytes का चयन करना है । (D) CD16 vs एचएलए-डॉ प्लॉट: गेटिंग का चयन करने के लिए एचएलए-dr सकारात्मक कोशिकाओं और NK कोशिकाओं को हटा दें । (ङ) CD14 बनाम एचएलए-डॉ: गेटिंग बी कोशिकाओं को बाहर करने के लिए (एचएलए-डा० उच्च/CD14 कम) से monocytes. (च) चयनित monocytes CD16 बनाम CD14 भूखंड पर monocyte उपसमुच्चय के गेट को प्रदर्शित किया । के लिए एक एफ रंग नीला और हरा का संकेत कम घनत्व, लाल और नारंगी उच्च घनत्व का संकेत है, और मध्य दूरी घनत्व का संकेत नारंगी के साथ सेल घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: संभावित प्रदूषित कोशिकाओं की पहचान के द्वारा गेटिंग रणनीति के सत्यापन । संभावित प्रदूषित कक्षों को मार्करों (A) T कक्षों (CD3), (b) b कक्षों (CD19), (C) NK कक्षों (CD56), और (D) न्यूट्रोफिल (CD66b) द्वारा पहचाना जाता है । बाईं ओर पैनलों आंकड़ा 1a और 1bके अनुसार गेटिंग के बाद प्रत्येक जनसंख्या की पहचान दिखाने के रंग के साथ उच्च (लाल) से सेल घनत्व का प्रतिनिधित्व करने के लिए कम (नीला) । दाईं ओर पैनलों प्रत्येक कोशिका जनसंख्या (नीला) आरोपित अंतिम monocyte CD16 पर दिखाने के लिए/CD14 साजिश monocytes (लाल) के लिए इन आबादियों की निकटता प्रकट करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: पुष्टिकरण कि गेटिंग चरण दूषित कक्षों को निकालें । उच्च (लाल) से अभिव्यक्ति की डिग्री दिखाने के लिए हीट मैप्स (A) CD56 और (B) CD19 के कम (नीला) । गेटिंग चरणों को सफलतापूर्वक उच्च CD56 (NK कक्षों) और उच्च CD19 (B कक्षों) के साथ कक्षों को बाहर निकालें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: M1 (CD120b) और M2 (CD93) मार्करों की Monocyte अभिव्यक्ति । monocyte M1 और M2 मार्कर अभिव्यक्ति (नीला) isotype (एक) शास्त्रीय, (ख) मध्यवर्ती, और (ग) गैर शास्त्रीय के लिए (लाल) से स्पष्ट बदलाव दिखा के चिकनी हिस्टोग्राम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एंटीबॉडी मात्रा (५० µ l blood) मात्रा (16x) ८०० µ l लड
CD14-V450 ०.७५ µ l 12 µ l
CD16-APC ०.५ µ l 8 µ l
एचएलए-DR-PerCP ०.६२५ µ l 10 µ l

तालिका 1: पूरे रक्त प्रवाह और मास्टर मिश्रण के लिए एंटीबॉडी ।

ट्यूब पीई एंटीबॉडी कोड Isotype मैच शेयर एकाग्रता कार्य की मात्रा
1 IgG1 BD (५५५७४९) ना १.० µ g/20 µ l ०.६२५ µ l
2 CD163 BD (५५६०१८) BD IgG1 ०.१२५ µ g/20 µ l 5 µ l
3 CD64 BD (५५८५९२) BD IgG1 ०.०६ µ g/20 µ l 10 µ l
4 IgG1 BD (५५५७४९) ना १.० µ g/20 µ l १.२५ µ l
5 CD86 BD (५५५६५८) BD IgG1 १.० µ g/20 µ l १.२५ µ l
6 CD11b BD (५६१००१) BD IgG1 १.० µ g/20 µ l १.२५ µ l
7 IgG2a अनुसंधान एवं विकास (IC003P) ना 25 µ g/mL 5 µ l
8 CD120b (TNFRII) अनुसंधान एवं विकास (FAB226P) अनुसंधान एवं विकास IgG2a 25 µ g/mL 5 µ l
9 IgG1 बीएल (४००११२) ना ०.२ मिलीग्राम/एमएल २.५ µ l
10 CD93 बीएल (३३६१०८) बीएल IgG1 ५० µ g/mL १.२५ µ l

तालिका 2: M1/M2-PE Fluorochrome पूरे रक्त प्रवाह के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी लेबल ।

ट्यूब एंटीबॉडी कार्य की मात्रा
11 CD3 5 µ l
12 CD19 5 µ l
13 CD66b १.२५ µ l
14 CD56 5 µ l

तालिका 3: PE Fluorochrome लिम्फोसाइटों (टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं), न्यूट्रोफिल, और NK कोशिकाओं के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी लेबल ।

ट्यूब % शास्त्रीय % मध्यवर्ती % गैर शास्त्रीय
1 ८४.३ ५.११ १०.१
2 ८४.२ ५.०५ १०.५
3 ८४.३ ५.०३ १०.७
4 ८१.६ ५.०३ १२.१

तालिका 4: Monocyte सबसेट अनुपात एक रक्त नमूना से सना हुआ और अलग से विश्लेषण किया ।

Discussion

पूरे रक्त प्रवाह cytometry monocytes अध्ययन करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है के रूप में कोशिकाओं को उनके शारीरिक microenvironment संक्रमण और भड़काऊ स्थितियों में अपनी भूमिकाओं में एक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए करीब शर्तों में जांच कर रहे हैं । इसके अलावा, ताजा का उपयोग करें (यानी, unprocessed) रक्त के नमूने परिवर्तन या सेल परिवर्तनों कि भंडारण या हैंडलिंग18,19, के कारण हो सकता है, जैसे उन जाना जाता है के साथ फ्रीज-गल monocytes के साथ घटित करने के लिए ंयूनतम 20. नमूना तैयारी की सिफारिश की है के रूप में कुछ मार्करों विनियमित रहे हैं, तो नमूनों कमरे के तापमान से पहले19प्रसंस्करण के लिए रखा जाता है । M1 और M2 मार्करों के इष्टतम सांद्रता अनुमापन द्वारा निर्धारित किया गया है, और यह किसी भी नए एंटीबॉडी के लिए किया जाना चाहिए सुनिश्चित करना है कि बदलाव की डिग्री प्रतिजन अभिव्यक्ति की वजह से है और एंटीबॉडी की कमी से प्रतिबंधित नहीं whilst गैर विशेष बाध्यकारी सीमित करने के लिए । लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने और lysis समाधान के साथ सफेद रक्त कोशिकाओं के निर्धारण के रूप में इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति के प्रवाह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं cytometry21,22. ध्यान दें कि कुछ lysis समाधान नहीं-धोने धुंधला के साथ संगत कर रहे हैं, स्पष्ट आबादी हमारे हाथ में स्पष्ट कर रहे है जब एक धोने कदम का प्रयोग किया जाता है ।

प्रवाह cytometer का सही सेटअप भी महत्वपूर्ण है जब monocyte मार्करों की अभिव्यक्ति की तुलना । हम अनुशंसा करते है कि शोधकर्ताओं ने नियंत्रण मोतियों की लगातार लक्ष्य प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाए रखने और अलग अलग दिनों पर चलाने के विभिंन नमूनों में सुसंगत परिणाम प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए साधन पर गुणवत्ता नियंत्रण करते हैं । इस के अलावा, isotype नियंत्रण गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग द्वारा उत्पंन किसी भी गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत की व्याख्या करने में सहायता करने के लिए उपयोग किया जाता है । Monocytes एफसी रिसेप्टर्स के उच्च स्तर11 है और इसलिए गैर विशेष बाध्यकारी करने के लिए प्रवण हैं । नोट, गैर-विशिष्ट बाइंडिंग का स्तर भिन्न सबसेट के लिए भिन्न होता है, और इस प्रकार एक isotype नियंत्रण का उपयोग उप-सेट्स के बीच मार्कर व्यंजक की डिग्री की तुलना करते समय महत्वपूर्ण हो जाता है ।

एक अंय महत्वपूर्ण कसौटी पर विचार किया जाना गेटिंग कदम कार्यरत है । कुछ अध्ययनों से सुझाव है कि यह FSC में monocyte आबादी के आसपास एक तंग फाटक आकर्षित महत्वपूर्ण है (एक)/SSC (ए) भूखंड के लिए गैर के अधिकांश monocytic CD16 सकारात्मक कोशिकाओं23,24,25से छुटकारा पाने के लिए, लेकिन यह कुछ के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते है गैर-monocyte कक्षों के रूप में monocytes FSC/एसएससी भूखंडों पर monocytes के साथ ओवरलैप कर सकते हैं26. बल्कि, monocytes दूषित हो सकता है कि किसी भी अन्य रक्त कोशिकाओं को बाहर करने के लिए, CD14 और CD16 के अलावा एक तीसरे monocyte मार्कर के शामिल किए जाने, आवश्यक है26,27. इस कारण से, एचएलए-DR अक्सर उपयोग किया जाता है और यह NK कोशिकाओं या न्यूट्रोफिल17,28द्वारा व्यक्त नहीं है के रूप में आदर्श है । हालांकि लिम्फोसाइटों (बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं) एचएलए व्यक्त कर सकते हैं-डॉ, वे CD14 अभिव्यक्ति के संबंध में monocytes से अलग. जबकि एचएलए-डॉ एक आदर्श तीसरे मार्कर है, CD86 भी5,27,29 की सिफारिश की गई है, लेकिन यहां इस्तेमाल नहीं किया गया है के रूप में यह भी एक M1 मार्कर और इस प्रकार monocyte उपसमुच्चय पर अभिव्यक्ति की अपनी डिग्री का आकलन किया गया था ।

गेटिंग का इस्तेमाल किया रणनीति का सत्यापन महत्वपूर्ण महत्व का है । जबकि NK कोशिकाओं गैर शास्त्रीय के साथ ओवरलैप करने के लिए जाना जाता है अगर वे बाहर28gated नहीं कर रहे हैं, हम नोटिस कि बी कोशिकाओं को भी गैर शास्त्रीय (चित्रा बी14) के साथ ओवरलैप कर सकते हैं; क्या यह अंय अध्ययनों में मामला है fluorochrome विकल्प पर निर्भर हो सकता है, उपकरण विंयास, डिटेक्टर संवेदनशीलता, या यहां तक कि रोग की स्थिति की जांच की जा रही है । यहां, अतिव्यापी बी कोशिकाओं एचएलए की उच्च अभिव्यक्ति दिखाई-डॉ और चित्र 1 डीमें एचएलए-डॉ सकारात्मक कोशिकाओं के चयन से बाहर gated नहीं थे । बल्कि, बी कोशिकाओं को हटाने के लिए हम CD14 के एक अतिरिक्त भूखंड/एचएलए-डॉ, जहां बी कोशिकाओं गैर से अलग अपने उच्च एचएलए के कारण शास्त्रीय-डॉ और कम CD14 अभिव्यक्ति ।

इसके अलावा भी कई अलग तरीके हैं जिनमें monocytes के लिए खुद के द्वार साहित्य में खींचे गए हैं; इन चक्रों में शामिल हैं (उपसमुच्चय चक्र मार्करों द्वारा अलग कर रहे हैं), और आयताकार या चतुर्भुज बक्से13 (अलग बक्से के साथ प्रत्येक सबसेट के लिए तैयार) जो इसके अलावा उनके प्लेसमेंट delineating में अलग जहां एक सबसेट समाप्त होता है और एक और शुरू होता है । इन मतभेदों की संभावना तथ्य यह है कि monocytes कोशिकाओं की एक सातत्य के रूप में मौजूद प्रतिबिंबित, शास्त्रीय से गैर शास्त्रीय, बजाय के रूप में स्पष्ट रूप से अलग आबादी से अलग । हालांकि, क्योंकि उपसमुच्चय की पहचान करने के लिए तकनीकों में भिंनता स्वयं परिकलित monocyte सबसेट अनुपात में अंतर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यह महत्वपूर्ण हो जाता है कि गेटिंग विधि यथोचित उद्देश्य है, के बजाय व्यक्तिपरक, के रूप में यह होगा विधि को और अधिक मजबूत और reproducible बनाएं । कुछ अध्ययनों CD16 के लिए एक isotype नियंत्रण का उपयोग करने के लिए शास्त्रीय और मध्यवर्ती उपसमुच्चय30के बीच सीमा निर्धारित करते हैं । दूसरी ओर, मध्यवर्ती और गैर शास्त्रीय के बीच जुदाई को परिभाषित करने के लिए, यह प्रस्तावित किया गया है कि कट लाइन ऊर्ध्वाधर या टेढ़ा हो सकता है, जांचकर्ताओं को पसंद के साथ, यह जा रहा है याच्या reproducible होना चाहिए, लेकिन एक आयताकार गेट 13,30,31को पढ़ाई के बीच तुलना की सुविधा देने की सिफारिश की गई है । यहां, वृद्धि की वस्तुस्थिति एक ज़ेबरा भूखंड पर डेटा की साजिश रचने और उद्देश्य दृश्य नियमों को लागू करने के द्वारा प्राप्त किया गया था, क्योंकि ज़ेबरा भूखंडों एक पारंपरिक समोच्च भूखंड पर प्रत्येक समान संभावना बिन के लिए रंग ढाल मिश्रण से एक अतिरिक्त दृश्य क्यू प्रदान करते हैं । शास्त्रीय सबसेट की सही सीमा ऐसी है कि जनसंख्या औसत आबादी के आसपास समान रूप से वितरित किया गया था तैयार किया गया था । मध्यवर्ती और गैर शास्त्रीय के बीच विभाजन भी मध्यवर्ती के आधार होने से मानकीकृत किया गया शास्त्रीय आबादी के भीतर गाढ़ा हलकों के नीचे के साथ संरेखितकरें (यानी, मध्यवर्ती जनसंख्या स्पष्ट रूप से CD14 के उच्च स्तर को व्यक्त करता है, मानक नामकरण1के अनुसार) ।

हालांकि कुछ अध्ययनों में अतिरिक्त मार्कर के उपयोग का सुझाव दिया है, जैसे सी-सी chemokine रिसेप्टर टाइप 2 (CCR2) या 6-sulfo LacNAc (SLAN) monocytes के सफल गणन प्राप्त करने के लिए और उनके नैदानिक महत्व को प्रकट करने के लिए३२,३३ , हमारे हाथ में कई monocyte कार्यात्मक मार्करों की अभिव्यक्ति का स्तर व्यापक रूप से14व्यक्तियों के बीच बदलता है । इस तरह की भिन्नता उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर सबसेट को परिभाषित करने के लिए इन मार्कर की उपयोगिता सीमित कर सकते हैं. स्वचालित गणना दृष्टिकोण भी दृश्य इंटरएक्टिव stochastic पड़ोसी embedding (वइसने), टी वितरित stochastic पड़ोसी embedding (tSNE), या फैले-पेड़ प्रगति सहित कल्पना और क्लस्टर monocyte सबसेट के लिए इस्तेमाल किया गया है घनत्व का विश्लेषण-सामान्यीकृत घटनाओं (कुदाल)३४,३५, जो कई मार्करों के सेट के आधार पर कोशिकाओं के दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान कर सकते हैं । हालांकि यह monocyte सबसेट वर्गीकरण में गेटिंग रणनीति की सटीकता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, यह मांयता प्राप्त है कि एक खामी एंटीबॉडी की संख्या (और इसी fluorophore चैनल) की आवश्यकता है । इसकी उपयोगिता पूछे जाने वाले प्रश्नों पर निर्भर करेगी; अतिरिक्त जटिलता, उदाहरण के लिए, गणन अध्ययन में वारंट नहीं किया जा सकता है ।

हमारे तकनीक के साथ Monocytes gated साहित्य के साथ कतार में अनुपात और तीन उपसमुच्चय द्वारा सतह मार्करों की अभिव्यक्ति दिखाने के आसानी से निर्धारित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, तकनीक और पद्धति यहां समझाया monocyte सबसेट अनुपात की गणना और सतह मार्कर अभिव्यक्ति है, जो अंय मार्करों के रूप में अच्छी तरह से शामिल बढ़ाया जा सकता है आकलन की एक मानकीकृत और सरल विधि प्रदान करता है, जिससे विभिन्न अन्य स्थितियों में उनके कार्यात्मक भूमिकाओं को मान्य.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

फ्लो cytometry फ्लो cytometry कोर सुविधा में किया गया था जो Westmead इंस्टिट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च, Westmead रिसर्च हब, कैंसर इंस्टिट्यूट न्यू साउथ वेल्स, और नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल द्वारा समर्थित है । इस अध्ययन में क्लीनिकल केमिस्ट्री रिसर्च और एजुकेशन फंड का समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer blood collection set Becton Dickinson 367286
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mL Becton Dickinson 7128959
Phospahate Buffered Saline (PBS) Lonza 17-516F
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style) Invitro technologies 352054
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] BD Biosciences 560349
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] Abcam Australia ab140477
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] BioLegend 307628
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] BD Biosciences 555749 Lot # 4283901
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] BD Biosciences 556018 Lot # 2335626
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] BD Biosciences 558592 Lot # 36768
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] BD Biosciences 555658 Lot # 3109766
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] BD Biosciences 561001 Lot # 3228959
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] R&D Systems IC003P Lot # 1212031
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] R&D Systems FAB226P Lot # 612051
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] BioLegend 400112 Lot # B220359
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] BioLegend 336107 Lot # B143544
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] BD Biosciences 347347 Lot # 3010929
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] BD Biosciences 561741 Lot # 2307721
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] BD Biosciences 561903 Lot # 3011796
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] BioLegend 305105 Lot # B154037
OptiLyse C Beckman Coulter A11895
Formaldehyde solution 37% Sigma F1635
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD Biosciences
Automatic haematology analyser, XT-1800i Sysmex
Centrifuge GS-6R Beckman
Flowjo software v10.0.7 Tree Star Inc

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Marimuthu, R., Francis, H., Dervish, S., Li, S. C. H., Medbury, H., Williams, H. Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (140), e57941, doi:10.3791/57941 (2018).

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