Summary
Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.
Abstract
Monosit çeşitli inflamatuar hastalıklarda önemli katkıda bulunan ve onların alt oranlarını ve işlevler, dahil olmak üzere bu hücreler için değişiklik patolojik önemi olabilir. Örnekleri bu yöntem tarafından en az işlenmesi manipülasyonun Hücre aktivasyonu sınırları olarak monosit değişiklikleri incelemek için bir ideal tam kan akış sitometresi yöntemidir. Ancak, birçok farklı yaklaşımlar alt kümeleri tutarsız tanımlaması için çalışmalar arasında lider monosit alt kümeleri kapı için alınır. Burada biz tanımlamak ve insan monosit alt kümeleri (klasik, ara ve klasik olmayan) karakterize için tam kan akış sitometresi kullanarak bir yöntem göstermek. Akış Sitometresi için kan örnekleri hazırlamak, (sağlamak bulaşıcı hücreleri kaldırılmıştır) alt kümeleri kapı ve monosit alt ifade yüzey işaretlerinin belirlemek için izlenecek verilmiştir — Bu örnek M1 ve M2 işaretleri. Bu iletişim kuralı monosit alt oranlarını ve diğer işlev işaretçileri monosit alt ifade değerlendirmek için standart bir perdeleme yöntemini gerektirir diğer çalışmalar için genişletilebilir.
Introduction
Monosit teşvik ve inflamasyon çözmede önemli bir rol oynamaktadır beyaz kan hücreleri bir türüdür. Monosit tanınan, klasik (~ %85), Orta (~ %5) ve küme farklılaşma (CD) 14 ve CD16 ifade1onların seviyesine göre karakterize klasik olmayan (~ %10) monosit üç ana alt kümeleri vardır. Monosit alt kümeleri oranlarını ara ara ürün düzeyini nerede kalp-damar hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli inflamatuar Birleşik2,3 artan bir oranda gibi hastalık varlığı ile farklı olabilir klinik olaylar4,5ile ilişkili. Ayrıca, hastalık koşullarında, monosit de pek çok değişiklik tarafından yüzey marker ifade6,7bir fark tespit ile işlev değişiklikleri uygulayabilir. Böyle bir örnek monosit M1-eğriltme, kardiyovasküler hastalıklar, diyabet, obezite ve metabolik sendrom7,8,9 gözlenen M1 makrofajlar ile ilişkili işaretçileri artış olduğunu , 10.
Monosit alt oran ve işlev değerlendirmek için akış sitometresi popülerlik rağmen numune hazırlama ve alt bulgular bu tür çalışmalar arasında karşılaştırmak zorlaştırır çalışmalar arasında geçişi hatırı sayılır bir değişkenlik vardır. Önemlisi, monosit alt kümeleri sınır hiçbir fikir birliği yoktur henüz standart bir yaklaşım çeşitli hastalıklarda alt oranlarda değişiklikler klinik önemi göz önüne alındığında esastır. Monosit Klasik orta aracılığıyla klasik olmayan alt11 ' e ayırt ve bu nedenle, monosit ayrı nüfus12 yerine sürekli spektrum olarak var aslında çoğunluğuna zorluk parçası kaynaklanmaktadır . İlginçtir, Zawada vd ya bir dikdörtgen veya trapez orta alt kümesini geçişi kullanarak, her ikisi de bir kardiyovasküler bitiş noktası13tahmin daha yüksek bir ara alt kümede sonuçlandı gösterdi. Bu en az boyut oranını hesaplamak için önemli konu farklı örnekleri (ve çalışmaları), arasında tutarlı bir perdeleme stratejisi kesin olarak alt kümeleri arasında ayırımcılık girişiminde yerine uyguluyor, vurgular. Kesin çoğunluğuna işlevi değerlendirirken daha önemli olsa da, değişiklik işaretleyici ifade alt kümeleri arasında artımlı12,14, ve böylece tekrar, perdeleme tutarlılık belki anahtar. Bu nedenle, nesnel tekrarlanarak monosit alt kümeleri farklı örnekleri arasında apportions yöntemi çoğunluğuna gereklidir. Burada sunulan yöntemin amacı monosit alt kümeleri net bir açıklama ile kapı etmektir ve gating tekniği için gerekçe istihdam ve yüzey marker ifade, böylece araştırmacılar izin veren bir yöntem sağlamak için alt kümeleri değerlendirmek farklı örnekler değerlendirirken bu tekniğin kullanımı duyulan güven.
Protocol
Bu çalışmada WSLHD insan Araştırma Etik Komitesi (HREC) (onay AU kırmızı HREC/15/WMEAD/289) tarafından onaylanmıştır.
1. numune hazırlama için tam kan akış sitometresi
Not: insan kanı potansiyel bulaşıcı olduğu için örnek kurulum biohazard mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
- Kan örnekleri katılımcılardan 3 mL etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) tüpler içine toplamak.
- Hematoloji Analyzer'ı veya hemasitometre kullanan beyaz kan hücresi (WBC) sayısı belirler.
- Sulu fosfat tamponlu tuz (PBS) ~ 5 x 10 için toplama ayarlamak için (pH ~ 7,4) ile6 WBC/mL.
- 16 x 50 µL kan hacimleri, 0,75 µL CD14 V450 anti, CD16 APC anti 0.5 µL ve 0.625 µL birleştirerek (Örneğin, 14 tüpler için hazırlamak 16 x ana mix) tüpler sayısı yeterli ana karışımı hazırlanmak anti HLA-DR-PerCP. Girdap ve pipet 51.9 µL karıştırın içine her tüp (Tablo 1).
Not: Kullanılan floresan antikor için en uygun boyama konsantrasyonu belirlemek için antikor titre. - Yüzey işaretleyici (M1 ve M2 veya izotip kontrol, phycoerythrin (PE) etiketli) eklemek antikorlar (örnek Tablo 2başına) ve PE etiketli işaretleri T hücreleri (CD3), B hücreleri (CD19), nötrofil (CD66b) ve doğal öldürücü (NK) hücreleri (CD56) (Tablo 3). Girdap ve 30 dk, karanlıkta 4 ° C için kuluçkaya.
Not: Lenfositler, nötrofiller ve NK hücreleri için işaretleri yalnızca perdeleme yöntemini doğrulamak için dahil edilir. - Kombine kırmızı kan hücre lizis/WBC sabitleme çözüm, girdap yavaşça hemen 250 µL ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- PBS ve spin hücre 250 µL 260 x g oda sıcaklığında 10 dakika için ekleyin.
- Süpernatant kaldırmak için 300 µL % 1 formaldehit hücrelerde yeniden askıya alma.
Not: Formaldehit zehirlidir. Nitril eldiven ve duman mahallede kullanır. - Analiz gerçekleştirilene kadar ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
Not: Akışı analizi numune hazırlama 48 saat içinde yapılması önerilir.
2. akış sitometresi
- Kontrol akış sitometresi günlük tesis personel sağlamak için kalite kontrol denetimleri gerçekleştirdik.
Not: denetim boncuk kullanarak hedef floresans yoğunluklarda tutarlı analizleri, enstrüman kalite kontrol ve bakımını arasında tutarlılığı sağlamak için tavsiye edilir. - Akış Sitometresi deneme oluşturmak için tıklayın "yeni bir deneme sonra"yeni numune"ve"yeni tüp"tüpler eklemek için. Bivariate araziler simgesine tıklatarak seçin ve eksen parametreleri seçmek için aşağı açılan menüleri seçin. CD16/CD14 arsa ve satın izlemek için bir dedektör zaman yanında görünen bir arsa dahil olun.
- Tüp takın ve "Al" düğmesini tıklatın. Dedektör sinyalleri ölçek sağlayarak enstrüman voltaj ayarlarını denetleyin.
- CD14/CD16 Arsa monosit kapısı düşen hücreleri gözlemlemek. Klasik monosit gate için 5000 olaylar için kayıt eşik ayarlayın ve "Kaydet"'i tıklatın.
- Veri kalan tüpler için devam edin. Sonra kaydedilen tüm tüpler için veri akışı veri analiz için .fcs dosyaları olarak dışa aktarın.
Not: tek renk tazminat denetimleri doğruluğunu sağlamak için kaydedilmiş olmalıdır. Bir tazminat matrisi hesaplanır ve veri analizi için spektral sızıntısı15,16hesap önce uygulanır.
3. monosit geçişi
- Açık dosyaları analiz yazılımı. Çift tıkırtı tüp adı ve bir ileri dağılım alanına FSC (A) hücreleri görselleştirmek / dağılım yükseklik FSC(H) çizim iletmek için aşağı açılan menüleri seçin parametreleri. Çokgen gate aracı simgesini tıklatıp (Şekil 1A) olduğu gibi hücreleri kapsayan bir gelir dışlama kapı oluşturun.
- (Geçişli bölgenin yanında çift tıkırtı) geçişli hücreleri seçin ve yeni görüntü kutusunu ayarlamak hücreleri bir FSC (A) görüntülemek için aşağı açılan menü parametre / yan dağılım SSC(A) arsa. Dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve cömertçe monosit nüfus lenfositler, NK hücreleri ve granülosit (Şekil 1B) çoğunluğu dışlamak için ön ve yan dağılım özelliklerine göre seçin.
- Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve açılan menüleri kullanarak parametreleri seçmek bir CD14/CD16 arsa üzerinde yeniden görüntülemek. Çokgen kapısı onların karakteristik "┐" şekil (Şekil 1 c) dayalı monosit seçmek için tıklatın.
- Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve monosit CD16/HLA-DR arsa üzerinde parametreleri seçmek için aşağı açılan menüleri kullanarak görüntüler. HLA-DR pozitif hücreleri seçin ve herhangi bir geri kalan NK hücreleri ve nötrofil17 (Şekil 1 d) dışlamak için Çokgen geçit üzerinde'yi tıklatın.
- Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve HLA-DR pozitif hücreler parametreleri seçmek için açılan menüleri kullanarak bir CD14/HLA-DR arsa üzerinde görüntüler. Çokgen geçit üzerinde tıklatın ve (B hücreleri ifade HLA-DR ama değil CD14 yüksek düzeyde) HLA-DR yüksek/CD14 düşük hücreleri dışlamak için bir kapı çizin (Şekil 1E).
Not: B hücre kontaminasyon oluşabilir ve bu nedenle araştırılmalıdır. Şekil 1 c klasik olmayan nüfus için sol hücrelerden farklı değilse, kirlenme olasıdır. B hücreleri ile klasik olmayan monosit üst üste gelen değil eğer adım 3.5-ebilmek var olmak kaptan. - Geçişli iade yapısı hücreleri seçin ve bunları CD16/CD14 arsa üzerinde görüntülemek için aşağı açılan menüleri kullanın. Çizim Seçenekleri "alt oranlarını (Şekil 1F) belirlemek için çizilecek monosit alt gates sağlayacak Zebra komplo" seçin.
Not: zebra Arsa analiz yazılımı, sözde renk (düz) kullanılamıyor veya kontur Arsa uygun olabilir. - Dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve CD14 yüksek/CD16 düşük, klasik monosit nüfus çevresinde yaklaşık bir dikdörtgen kapısı çizerek klasik monosit seçin. "Görüntüle'nin altında" "medians göster" seçeneğini klasik monosit medyan floresan yoğunluğu görüntülemek için. Öyle ki eşit bir dağıtıma karşı medyan sola ve sağa sola tüm hücreleri kapsayan üzerinde nüfusa sahip geçit ayarlayın.
- Ara nüfus klasik kapısının sağındaki hücreleri kapsayan dikdörtgen bir kapı çizerek seçin. Tamamen ara alt CD14 ifade karşılaştırılabilir olmasını sağlar klasik monosit geçidi uzaklıktadır çemberler alt geçitte hizalayarak klasik olmayan hücreleri dışlamak için kapı alt ayarlamak Ana klasik nüfus geçerli adlandırma ile tutarlı.
- Klasik olmayan alt çizerek bir dikdörtgen kutu nüfus (Şekil 1F) altına tüm hücreleri seçerek orta alt alt kenarından kapı.
- "Gate frekansları Show" "Görüntüle'nin altında" seçin her monosit alt yüzdesini belirlemek için.
4. doğrulama yöntemi perdeleme
- Potansiyel bulaşıcı hücre tipleri etkili kapı out olup olmadığını belirlemek için farklı hücre popülasyonlarının T hücreleri (CD3), B hücreleri (CD19), nötrofil (CD66b) ve NK hücreleri (CD56) karşı antikor ile tanımlar (Şekil 2).
Not: Burada T hücreleri ve nötrofil monosit "┐" şeklinde yakın oturmak yok ve Şekil 1 ciçinde dışarı kapı. - NK hücreleri adım 3,4 (Şekil 1 d) kaldırılır ve B hücreleri adım 3.5 (1E rakam) Şekil 3' te gösterilen kaldırılır onaylayın. NK hücreleri veya B hücrelere geçişli-out değilseniz, kapıları yeniden ayarlayın.
5. fenotipik monosit Marker ifade
- Hücreleri her monosit alt seçin. Her işareti ve onun eşleşen izotip (Şekil 4) gösteren bir çubuk grafik her monosit alt (Şekil 1F) için oluşturmak için açılan parametreleri değiştirin.
- İlgili izotip denetimine göre her işaretçisi (median veya geometrik ortalama) ifade derecesini hesaplamak.
Representative Results
Monosit gating strateji ve burada kullanılan Akış Sitometresi Analizi (Şekil 1) başarıyla monosit alt kümeleri geçişli ve onların göreli oranlarını ortaya koydu. Oranlar (için bu örnek) %88.1 classicals, %4,33 ara ürün ve %7,49 non-classicals hesaplanmıştır. Bu alt küme küme küme kapılardan B hücreleri, T hücreleri, nötrofiller veya işaretçileri olan CD19, CD3, CD56 ve CD66b, sırasıyla doğrulandı NK hücreleri ile kontamine değil. Diğer nüfus göreli konumunu değerlendirme tarafından bu T hücreleri ve nötrofil de monosit "┐" şeklin dışını CD16/CD14 Arsa (Şekil 2A ve 2B) düşmek açıktır. Ancak, NK hücreleri ve B hücre popülasyonlarının klasik olmayan monosit nüfus (Şekil 2B ve 2 C) ile üst üste. Perdeleme strateji (Şekil 1 d ve 1E) adımlardan NK hücreleri (Şekil 3A) ve B hücreleri (Şekil 3B) dışlamak için teyit edildi. B hücre nüfus klasik olmayan monosit içerdiği halde tutar ihmal edilebilir.
Alt kümeleri için onlar farklı yüzey işaretleyicileri, M1 ifade derecesi geçişli (CD64, CD86 ve CD120b) ve M2 (CD163, CD11b ve CD93) değerlendirildi. Veri işaretleyicilerini olumlu ifade karşılık gelen izotip kontrollere göre çubuk grafikler (Şekil 4) shift tarafından görüldüğü gibi gösterdi. Veri işaretleyicilerini sayılarının izotip denetimleri daha büyük.
Bu perdeleme stratejinin uygulamaya dört tüpler içine bölünmüş oldu, bir kan örneği lekeli ve ayrı ayrı, verimleri tüpler (Tablo 4) arasında karşılaştırılabilir sonuçları analiz.
Şekil 1: temsilcisi monosit bütün insan kan stratejisinde geçişi. (A) FSC(A) vs FSC(H) Arsa: bir eşit alan ve yükseklik içeren hücreleri geçişi, böylece kümeleri kaldırma (FSC(H)) ve enkaz (çok düşük FSC) göre daha büyük FSC(A) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) Arsa: monosit geniş seçim SSC/FSC özelliklerine dayalı. (C) CD16 vs CD14 Arsa: monosit seçmek için çoğunluğuna dayanarak onların karakteristik "┐" şekil. (D) CD16 vs HLA-DR Arsa: Gating HLA-DR pozitif hücreleri seçin ve NK hücreleri kaldırmak için. (E) CD14 vs HLA-DR: Gating B hücreleri (HLA-DR yüksek/CD14 düşük) monosit dışlamak için. (F) seçili monosit monosit alt kümeleri kapı için CD16 vs CD14 arsa üzerinde gibi görünürler. A-F için renk mavi ve yeşil düşük yoğunluklu, kırmızı ve turuncu yüksek yoğunluklu gösteren ve orta sınıf yoğunluğu gösteren turuncu gösteren hücre yoğunluk temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: doğrulama stratejisi potansiyel kirletici hücreleri tarafından teşhis kodu perdeleme. Potansiyel bulaşıcı hücreleri işaretleri tarafından tanımlanır (A) T hücreleri (CD3), (B) B hücreleri (CD19), (C) NK hücreleri (CD56) ve (D) nötrofil (CD66b). Sol yan paneller Şekil 1A ve 1B, başı olarak hücre yoğunluğu yüksek temsil eden renk geçişi sonra her nüfus tanımlaması (kırmızı) (mavi) düşük göstermek. Sağ yan paneller her hücre popülasyon (mavi) yakınlık monosit (kırmızı) için bu örneğin alınma olasılığını ortaya çıkarmak için son monosit CD16/CD14 arsa üzerinde üst üste göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: gating adımları bulaşıcı hücre kaldırma onayı. Isı derecesi düşük yüksek (kırmızı) gelen ifadenin (mavi)(a)CD56 ve (B) CD19 gösterilen eşleştirir. Perdeleme adımları başarıyla yüksek CD56 hücrelerle hariç (NK hücreleri) ve yüksek CD19 (B hücreleri). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: M1 monosit ifade (CD120b) ve M2 (CD93) işaretleri. Histogramlar monosit M1 ve M2 marker ifade (izotip açısından net değişimi(a)classicals, (B) ara ürün ve (C) Sigara-classicals (kırmızı) gösteren mavi) düzeltti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Antikor | Birim (50 µL kan) | Birim (16 x) 800 µL kan |
| CD14 - V450 | 0,75 ΜL | 12 ΜL |
| CD16 - APC | 0.5 ΜL | 8 ΜL |
| HLA-DR-PerCP | 0.625 ΜL | 10 ΜL |
Tablo 1: Antikor tam kan akışı ve ana karışımı için.
| Tüp | PE antikorlar | Kodu | İzotip maç | Hisse senedi toplama | Çalışma birimi |
| 1 | Igg1 | BD (555749) | NA | 1.0 µg/20 µL | 0.625 ΜL |
| 2 | CD163 | BD (556018) | BD Igg1 | 0,125 µg/20 µL | 5 ΜL |
| 3 | CD64 | BD (558592) | BD Igg1 | 0,06 µg/20µL | 10 ΜL |
| 4 | Igg1 | BD (555749) | NA | 1.0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 5 | CD86 | BD (555658) | BD Igg1 | 1.0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 6 | CD11b | BD (561001) | BD Igg1 | 1.0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 7 | Igg2a | Ar- Ge (IC003P) | NA | 25 µg/mL | 5 ΜL |
| 8 | CD120b (TNFRII) | Ar- Ge (FAB226P) | R & D Igg2a | 25 µg/mL | 5 ΜL |
| 9 | Igg1 | BL (400112) | NA | 0.2 mg/mL | 2.5 ΜL |
| 10 | CD93 | BL (336108) | BL Igg1 | 50 µg/mL | 1,25 ΜL |
Tablo 2: M1/M2-PE Fluorochrome monoklonal antikorlar tam kan akışı için etiketli.
| Tüp | Antikor | Çalışma birimi |
| 11 | CD3 | 5 ΜL |
| 12 | CD19 | 5 ΜL |
| 13 | CD66b | 1,25 ΜL |
| 14 | CD56 | 5 ΜL |
Tablo 3: PE Fluorochrome (T hücreleri, B hücreleri) lenfositler, nötrofiller ve NK hücreleri monoklonal antikor etiketli.
| Tüp | % Klasik | % Orta | % Klasik olmayan |
| 1 | 84.3 | 5.11 | 10.1 |
| 2 | 84.2 | 5,05 | 10,5 |
| 3 | 84.3 | 5,03 | 10,7 |
| 4 | 81.6 | 5,03 | 12,1 |
Tablo 4: Monosit alt oranlarda lekeli ve ayrı ayrı analiz bir kan örneği.
Discussion
Tam kan akış sitometresi monosit hücreleri enfeksiyon ve inflamatuar koşullar onların rol içine bir bakış açısı sağlayan kendi fizyolojik microenvironment yakın koşullarda incelenir olarak eğitim için ideal bir yaklaşımdır. Ayrıca, taze (işlenmemişyani ) kullanımı kan örnekleri en aza indirir değişiklikler veya depolama veya18,19, bu dondurma çözdürülen monosit ile gerçekleşmesi için bilinen gibi işleme nedeniyle oluşabilir hücre dönüşümleri 20. komut istemi numune hazırlama örnekleri19işleme önce oda sıcaklığında tutulur Eğer upregulated bazı işaretler olduğu gibi tavsiye edilir. M1 ve M2 işaretleri en uygun konsantrasyonlarda titrasyon tarafından tespit edildi ve bu belirsiz bağlama shift derecesi nedeniyle antijen ifadesidir ve antikor eksikliği tarafından sınırlı değildir sağlanması iken sınırlamak herhangi bir yeni antikor için yapılmalıdır. Kırmızı kan hücrelerinin varlığı ile akış sitometresi21,22engelleyebilir gibi kırmızı kan hücreleri kaldırılması ve beyaz kan hücreleri ile lizis çözüm fiksasyonu bu protokol içinde önemli bir adımdır. Bazı lizis çözümler no-yıkama boyama ile uyumlu olsa da, bir yıkama adım kullanıldığında daha net nüfus bizim ellerimizde belirgin olduğunu unutmayın.
Akış Sitometresi doğru kurulumu da ifade monosit işaretlerinin karşılaştırırken önemlidir. Araştırmacılar tutarlı hedef floresans yoğunluklarda denetim boncuk korumak ve farklı günlerde farklı örnekleri arasında tutarlı sonuçlar çalıştırmak sağlamak için kullanılacak cihazda kalite kontrol gerçekleştirmeniz önerilir. Buna ek olarak, izotip denetimleri non-spesifik antikor bağlama tarafından oluşturulan herhangi bir spesifik olmayan arka plan sinyal yorumlanmasında yardımcı olmak için kullanılır. Monosit Fc reseptörü11 yüksek düzeyine sahip ve bu nedenle non-spesifik bağlamaya yatkındır. Dikkat, non-spesifik bağlama düzeyini farklı alt kümeleri için farklıdır, ve böylece bir izotip denetiminin kullanımını marker ifade alt kümeleri arasında derecesi karşılaştırıldığında önemli hale gelir.
Dikkate alınması gereken bir başka önemli istihdam gating adımları kriterdir. Bazı çalışmalarda monosit çevresinde sıkı bir kapı çizmek için FSC(A)/SSC(A) nüfus Arsa Monositik sigara CD16 pozitif hücrelerinin23,24,25çoğunu kurtulmak, ama bu bazı kaybına yol açabilir çok önemli olduğunu göstermektedir monosit gibi sigara monosit hücreleri monosit FSC/SSC Tarih ile çakışabilir26çizer. Daha ziyade, monosit kontamine diğer kan hücreleri dışlamak için bir üçüncü monosit marker CD14 ve CD16, ek olarak dahil olduğunu temel26,27. Bu nedenle, HLA-DR kez kullanılır ve NK hücreleri veya nötrofil17,tarafından28ifade değil olarak idealdir. Lenfositler (B hücreleri ve T hücreleri) HLA-DR ifade olabilir rağmen onlar monosit CD14 ifade açısından farklıdır. HLA-DR ideal bir üçüncü işaret olsa da, CD86 da5,27,29 tavsiye etti ama burada kullanılmıyor gibi aynı zamanda bir M1 marker ve böylece onun derecesini ifade monosit alt kümeleri üzerinde değerlendirildi.
Doğrulama kullanılan gating stratejisinin önemli önemlidir. NK hücreleri onlar28geçişli değil eğer sigara classicals ile üst üste bilinmektedir iken, B hücreleri de sigara-classicals ile (Şekil 2B); çakışabilir fark Bu durumda diğer çalışmalarda da olup fluorochrome seçim, araç yapılandırma, dedektör hassasiyeti veya bile muayene ediliyor hastalık durumu üzerinde bağlı olabilir. Burada, HLA-DR gösterdi yüksek ifadesi örtüşen B hücreleri ve dışarı rakam 1 dHLA-DR pozitif hücrelerinin seçime göre kapı değil. Daha doğrusu, B hücreleri kaldırmak için biz CD14 ek bir arsa kullanılan / HLA-DR, nerede B hücreleri sigara classicals nedeniyle onların daha yüksek HLA-DR dan ayırmayı ve CD14 ifade düşük.
Kapıları monosit kendileri için literatürde çizilmiştir birçok farklı yolları da vardır; Bu kadranın (alt kümeleri tarafından çeyrek işaretleri ayrılır) ve ayrıca farklı bir alt kümesi bittiği yerde ve başka bir başlar operasyona onların yerleşim dikdörtgen veya trapez kutusu13 (ile ayrı kutuları her alt için çizilmiş) içerir. Bu farklılıkların büyük olasılıkla monosit hücreleri, klasik-klasik olmayan için ayırt bir süreklilik yerine açıkça farklı nüfus olarak mevcut gerçeği yansıtır. Çünkü alt kümeleri kendilerini tanımlamak için teknikleri değişimler farklılıklar hesaplanan monosit alt oranlarda yol açabilir, ancak, bu gibi gating yöntemi oldukça objektif yerine öznel, önemli hale gelir Yöntem daha sağlam ve tekrarlanabilir olun. Bazı çalışmalarda bir izotip kontrol CD16 için klasik ve orta düzey alt kümeleri30arasındaki sınır belirlemek için kullanın. Öte yandan, ara ürün ile sigara classicals arasındaki mesafeyi tanımlamak için bu kesme hat dikey veya eğik, müfettişler, tekrarlanabilir olmalıdır olmak şart ama dikdörtgen bir kapı seçim olabilir teklif edildi çalışmalar13,30,31arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için tavsiye edilmiştir. Burada, Zebra araziler üzerinde geleneksel bir dağılım komplo renkli gradyan eşit olasılık her depo gözü için karıştırarak bir ek görselleştirme işaret sağladığından artan tarafsızlığı bir zebra arsa üzerinde veri çizme ve objektif görsel kuralları uygulayarak elde edildi. Öyle ki nüfus nüfus medyan eşit olarak dağıtılan klasik alt sağ kenarlığını çizilmiştir. Ara ürün ve sigara classicals arasında bölünme de çemberler klasik nüfus içinde alt ile hizalamak ara ürün temel alarak standart (Yani, ara nüfus açıkça ««ifade eder) CD14, yüksek düzeyde standart adlandırma1göre.
Bazı çalışmalarda kullanımı C-C kemokin reseptör tip 2 gibi ek işaretleri (CCR2) veya 6-sulfo LacNAc (SLAN) başarılı numaralandırma monosit ve onların klinik önemi32,33 ortaya çıkarmak için almak için düşündürmektedir iken , bizim ellerimizde ifade işaretlerinin birçok monosit işlevsel düzeyini yaygın bireyler14arasında değişir. Böyle değişim onların ifade üzerinde temel alan alt kümeleri tanımlamak için bu işaretleri kullanışlılığını kısıtlayabilir. Otomatik hesaplama yaklaşımlar da görselleştirmek ve monosit alt kümeleri katıştırma visual etkileşimli Stokastik komşu (viSNE), gömme t dağıtılmış Stokastik komşu (tSNE) veya genişleme ağacı ilerleme dahil olmak üzere küme için kullanılmıştır Hücreleri birden çok işaretleri kullanılan kümesini temel alarak görsel temsilini sağlayan yoğunluk normalleştirilmiş Olaylar (kürek)34,35, analizi. Ise bu monosit alt sınıflandırma gating stratejisinde doğruluğunu artırmak için gösterilmiştir, bir dezavantajı antikorlar (ve karşılık gelen fluorophore kanalları) gerekli olduğunu kabul edilmektedir. Onun usefulness soruluyor soru bağlıdır; ekstra karmaşıklığı, örneğin, numaralandırma çalışmalarda garanti kapsamında değil.
Bizim tekniği ile geçişli monosit literatür doğrultusunda oranlarını göstermek ve üç alt kümeleri tarafından yüzey işaretlerinin ifade kolayca belirlenebilir. Genel olarak, teknik ve burada açıklandığı metodolojisi, monosit alt oranlarını numaralandırma ve de, böylece diğer işaretleri eklemek için genişletilmiş yüzey marker ifade değerlendirirken standart ve basit bir yöntem sağlar fonksiyonel rolleri çeşitli koşullarda doğrulanıyor.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Akış Sitometresi akış sitometresi çekirdek tıbbi araştırma, Westmead Araştırma Merkezi, Kanser Enstitüsü New South Wales ve Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi Westmead Enstitüsü tarafından desteklenen tesiste gerçekleştirildi. Bu çalışmada klinik kimya araştırma ve eğitim fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mL | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
References
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
- Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483 (2016).
- Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
- Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
- Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).
- Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
- Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).
- Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
- Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
- Szaloki, G., Goda, K.
- Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
- Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886 (2015).
- Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
- Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
- Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
- Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
- Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
- Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
- Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
- Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).
- Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
- Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
- Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).
- Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).
