Summary
نقدم هنا، بروتوكول خطوة بخطوة للتصوير محاور عصبية myelinated في شريحة الدماغ ثابت باستخدام النانو خالية من التسمية التصوير تقنية تستند إلى ريفليكتوميتري الطيفية.
Abstract
في الجهاز العصبي الثدييات، يوفر المايلين عزل كهربائي التي انورابينج الألياف إكسون في دوامة متعدد الطبقات. مستوحاة من هندسته المعمارية سوبسيلولار نظم عالية، وضعنا مؤخرا طريقة جديدة لتصوير، المسمى ريفليكتوميتري الطيفية (صبري)، الذي يتيح التصوير النانوي خالية من التسمية لم يسبق لها مثيل من محاور عصبية myelinated يعيش في الموقع. والمبدأ الأساسي الحصول على معلومات نانوستروكتورال عن طريق تحليل الطيف الانعكاس لهيكل سوبسيلولار متعدد الطبقات. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة للقيام تصوير صبري أساسية من أنسجة عصبية باستخدام نظام مجهرية [كنفوكل] تجارية، مزودة بليزر الضوء الأبيض وعامل تصفية الانضباطي. نحن تغطي إجراءات إعداد عينة، اقتناء البيانات الطيفية، ومعالجة للحصول على معلومات نانوستروكتورال الصور.
Introduction
في الجهاز العصبي الثدييات، يوفر المايلين التوصيل السريع العصب وسلامة محواري قبل انورابينج الألياف إكسون مع مانعات الغشائي متعدد الطبقات. يتكون هيكلها المتعدد الطبقات من النانو رقيقة-أفلام تتألف من أغشية البلازما بالتناوب (~ 5 نانومتر)، سيتوسول (~ 3 نانومتر)، والأماكن خارج الخلية (~ 7 نانومتر)1،2. مجهرية البصرية، بما في ذلك مجهرية فائقة القرار الأخير، ليست مناسبة لمراقبة ديناميات النانو المايلين بسبب القرار غير كاف بسبب الحيود الضوئية3،،من45. على الرغم من أن المجهر الإلكتروني يمكن أن توفر التفاصيل الدقيقة ل nanostructure المايلين، أنها لا تتوافق مع النظم البيولوجية الحية بسبب العينة الغازية عاليا الأعمال التحضيرية المتعلقة بالتثبيت الكيميائي وأولتراسيكتيونينج6،7 . حتى وقت قريب، كان هناك لا تقنية تنطبق على مراقبة ديناميات النانو من محاور عصبية ميليناتيد في الموقع.
سبق ذكر شين et al. أن محاور عصبية myelinated المعرض الانعكاس الخفيفة الملونة8. باعتماد التحليل سبيكتروسكوبيك في الضوء المنعكس، وضعنا طريقة تصوير جديدة للتصوير بالنانو لمحاور عصبية myelinated، المسمى ريفليكتوميتري الطيفية (صبري)9. ويستند صبري تدخل الأغشية الرقيقة التي تحدث في بنية متعددة الطبقات من غمد المايلين (الشكل 1). بالألياف البصرية والمحاكاة على مختلف محاور عصبية، أننا قد كشفت أن الطيف الانعكاس دالة دورية وافينومبير وعن تواتر (
) تناسبا عكسيا مع قطر إكسون (د). هذه العلاقة البسيطة (
) ويقدم سهلة التحديد الكمي لقطر إكسون من البيانات صبري. الاستفادة من هذا، يمكننا كشف إكسون انتشارا انتفاخ تحت إصابات الدماغ الرضية معتدل في تقريرنا السابق.
نظام صبري يرتكز على الفحص المجهري [كنفوكل] ويتكون من مصدر الليزر المتخصصة ومرشحات (الشكل 2). مصدر الإدخال ليزر الضوء الأبيض، توفير النطاق العريض الإخراج الطيفية المرئية إلى مناطق الأشعة تحت الحمراء. لمسح طيفي، مجهزة النظام مع اثنين من الأجهزة البصرية أكوستو: أكوستو البصرية الانضباطي مرشح (أوتف) لإيصال طول موجي محدد من مصدر الإدخال النطاق العريض والخائن شعاع أكوستو البصرية (أوبس) لتوجيه المحدد ينعكس الطول الموجي للجهاز. البرنامج للفحص المجهري [كنفوكل] الفائقة الطيفية (انظر الجدول للمواد) يوفر خيار مسح طيفية لتخصيص للتتابع الحصول على صور الانعكاس في مختلف الأطوال الموجية الإدخال. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتداخل زيغ حاسمة في القياس الطيفي؛ ولذلك، يوصي باستخدام عدسة الهدف أبوتشرومات.
ملاحظة، الليزر الضوء الأبيض تنتج ناتج طيفية متفاوتة والمكونات الضوئية تؤثر أيضا على الشخصية الطيفية. ولذلك، يحتاج الأطياف المكتسبة للمعايرة للتحليل الكمي اللاحقة. مرآة فضة محمية يستخدم عادة كمرجع، التي تنص انعكاس ثابتة تقريبا (> 97 في المائة) على مدى المنطقة المرئية الكاملة. ثم تنقسم أطياف المكتسبة من الأطياف المرجعية من النسخة المتطابقة.
يحدد حجم الخطوة الطيفية لمسح طيفي سرعة اقتناء؛ وبالتالي، ينبغي أن يكون الأمثل. كما إكسون أكبر فترة طيفية أعلى، فهو يتطلب الطيفية العينات الدقيقة. على سبيل المثال، قد إكسون التي يبلغ قطرها 10 ميكرون، واحدة من أكبر محاور الفسيولوجية عصبية، فترة طيفية ~ 8 نانومتر. عن طريق تطبيق معايير العينات نايكست، استخدمنا الفاصل الزمني أخذ العينات الطيفية 4 نانومتر لتغطية جميع محاور عصبية الفسيولوجية في أنسجة عصبية الماوس. هذا النهج يأخذ عادة خلال عدة ثوان لمسح كامل طيفية وهكذا ليست مناسبة للتطبيقات في فيفو ، حيث يتداخل الحركة الفسيولوجية (مثل التنفس وضربات القلب) اقتناء الطيفية مستقرة. ونحن سابقا حل هذه المسألة خلال تحرير مجهر تستقيم مخصصة، مصممة للحصول على الطيف الكامل لكل نقطة باستخدام مطياف صفيف (اكتساب السرعة ≈ 30 مللي كل بكسل).
في هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مفصل على تصوير صبري على شريحة الدماغ ثابتة، التي يمكن أن يؤديها في مجهر الطيفي تجارية (انظر الجدول للمواد). وهكذا، يمكن إكمال البروتوكول من المجربون دون خبرة في الأجهزة البصرية. ونحن أيضا تغطية المشاكل المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على البيانات وتحليلها صبري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بموافقة جميع العمليات الجراحية "العناية بالحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة سونغكيونكوان.
1. إعداد نموذج
ملاحظة: اﻷوتوكﻻف جميع الأدوات الجراحية قبل التعامل مع الحيوانات. القيام بأداء جميع العمليات الجراحية في غرفة مخصصة للعمليات الجراحية. يجب أن تلبس العباءات الجراحية المعقمة وقفازات من جميع الموظفين في غرفة العمليات الجراحية في جميع الأوقات.
-
تثبيت الأنسجة
- إعداد اثنين من الحقن 10 مل كل مليئة بالفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وبارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني.
- تخدير العمر 7-12 أسبوع ماوس (C57BL/6J أو أي خطوط الماوس مع أي من الجنسين) بإدارة خليط من زوليتيل وإكسيلازيني (1:1، 20 مغ/كغ كل) أو نظام بديل مناسب تخدير (مثلاً، مزيج من الكيتامين 80 ملغ/كغ و 10 مغ/كغ xylazine) مع حقن داخل.
- وبمجرد الماوس وصلت طائرة جراحية التخدير (استخدام الأسلوب استجابة قرصه تو)، فضح القلب بقطع الجلد والقفص الصدري مع المقص.
- قص الاذين الأيمن مع مقص صغير نزيف الدم ونتخلل الحل برنامج تلفزيوني ومنهاج عمل بيجين تسلسلياً من خلال البطين الأيسر بإبرة (معدل التروية = 4 مل/دقيقة، الحجم = 10 مل لكل حل).
ملاحظة: يصبح الماوس قاسية إذا تم إكمال هذا الإجراء بنجاح. استخدام مرهم العين أو التعقيم ليس من الضروري كما الإجراء المحطة الطرفية. قد يتم تخطي هذا الإجراء التثبيت. ومع ذلك، يوصي بهذه الخطوة تقليل التشوهات الهيكلية بما في ذلك تلف الأنسجة الميكانيكية وتورم محواري الدماغية. لمزيد من التفاصيل حول تثبيت الأنسجة، الرجوع إلى المقالة بسبر، ج. غ. et al. 10
-
إعداد شريحة الدماغ
- قطع رأس الماوس مع المقص الجراحي عن طريق البطني الصدر والبطن.
- إزالة فروة الرأس والسمحاق استخدام مقصات صغيرة تأهيلاً مناسباً حتى فضح تماما في الجمجمة.
- كسر في عظم جبهي وقطع الجمجمة على طول خياطة السهمي من عظم قذالي استخدام مقص صغير مع الرعاية لا لتلف الدماغ.
- إزالة بلطف الجمجمة والأم الجافية التتابع باستخدام الملقط غرامة.
- استخراج الدماغ باستخدام ملعقة بلاستيكية لينة، مع الحرص على عدم الأضرار الأنسجة.
- شطف ونقع في الدماغ المستخرجة في حل منهاج عمل 4% لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- شريحة الدماغ ثابت إلى 100-150 ميكرومتر أقسام استخدام فيبرتوم.
ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول إعداد الأنسجة، الرجوع إلى المقالة التي سيغيف et al. 11-الإجراءات اللاحقة، الأنسجة ينبغي أن تكون شرائح إلى أقسام أرق من سمك الفاصلة.
-
تركيب شريحة الدماغ
- إعداد الشرائح الزجاجية 1 والنظارات غطاء مربع 2 (22 × 22 × 0.17 ملم) لكل شريحة الأنسجة.
- يقتطع من نظارات تغطي مساحة نصف (قطعتين مستطيلة) باستخدام قاطع زجاج.
- إرفاق اثنين نظارات تغطي النصف استخدام غراء سوبر على شريحة الزجاج.
ملاحظة: يجب أن تكون المسافة بين النظارات النصف الثاني أكبر قليلاً من حجم الشريحة الأنسجة. - حصاد شريحة الدماغ باستخدام فرشاة أو ماصة وإرساء الأنسجة على زجاج الشريحة بين فاصل. الحرص على عدم إضعاف الأنسجة.
- الاستغناء عن 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني على سطح النسيج.
- مكان الزجاج مربعة أخرى غطاء رأس الأنسجة. تجنب إدراج فقاعات الهواء خلال هذه المرحلة.
- ختم حول تغطية الزجاج تستخدم طلاء الأظافر (أو المواد اللاصقة كبديل مناسب) لمنع التبخر من برنامج تلفزيوني والتلوث بالغبار خلال الدورة اللاحقة التصوير.
ملاحظة: يمكن وقفه المجرب في هذه المرحلة.
2-المعايرة
- التبديل في المجهر على الأقل 1 ساعة قبل التصوير للسماح بتحقيق الاستقرار الحراري الليزر مصدر (انظر الجدول للمواد). ثم، قم بتشغيل برنامج المسح الطيفي (انظر الجدول للمواد) وانقر فوق الزر الحصول على الجزء العلوي من واجهة المستخدم الرسومية (الشكل 3a).
- قم بتشغيل مصراع البرمجيات لليزر الضوء الأبيض (ذ) وأنبوب ضوئي (PMT) (الشكل 3a).
- حدد وضع xyΛ في القائمة المنسدلة في اكتساب وضع، ثم وضع الإدخال الليزر تتغير تلقائياً من المئة المستمر القوة الثابتة. قم بإلغاء تحديد خانة الاختيار تلقائي SPالحركة. وثم تعيين الإطار الطيفي لليزر الإدخال إلى 470 – 670 نانومتر وحجم الخطوة الطيفية إلى 4 نانومتر على Λ-"المسح الضوئي لامدا الإثارة" إعدادات (الشكل 3b).
- تعيين النطاق الطيفي من PMT إلى 450-690 بالنقر المزدوج فوق أو تحريك الشريط التكيف للنطاق الطيفي (الشكل 3 ج).
ملاحظة: ينبغي أن يشمل هذا النطاق الطيفي في عرض النطاق الترددي كامل من مصدر الإدخال. - حدد عدسة هدف غمر مياه، تأهيلاً مناسباً مع فتحه عددية عالية (NA > 0.7) وإعطاء أي قيمة للسلطة PMT والليزر لتنشيط الزر تكوين أوبس و يعيش المسح الضوئي . تبديل مسار بصري عن طريق التحقق من التفكير في تكوين أوبس (3d الشكل).
- جبل مرآة مرجعية (انظر الجدول للمواد) على المسرح المجهر. وينبغي أن تواجه سطح مرآة ضد العدسة الهدف. إذا ليس من السهل وضع المرأة على مرحلة مجهر، السندات مرآة على لوحة مسطحة (مثل الشرائح الزجاجية).
- مراقبة مرحلة مجهر لمحاذاة المستوى البؤري لسطح مرآة.
- ضبط كسب PMT والليزر سلطة النظر في النطاق الديناميكي للجهاز وقم بتغيير وضع الإدخال الليزر من المستمر في المئة إلى القوة الثابتة.
ملاحظة: كما هي الحال، الحصول PMT 500 (V) وتستخدم قوة ليزر نسبي من 0.1% في 570 نانومتر. - تأكيد في وضع ألوان الزائفة للتحقق من أنه لا يوجد أي التشبع في كامل نطاق الطول الموجي. إذا كان من الملاحظ التشبع، أقل قوة الليزر (الشكل 3a).
- تشغيل الحصول على المسح الضوئي لامدا .
- إزالة النسخة المتطابقة من المرحلة وتكرار اقتناء نفس دون عينة من أجل الحصول على مرجع الظلام (أي، إزاحة الظلام).
- حفظ البيانات في تنسيق TIF مولتيستاكيد .
3-الحصول على الصور صبري
- مكان الأنسجة المركبة على المسرح المجهر. لمحاذاة الأنسجة إلى المستوى البؤري للعدسة الهدف تقريبا، استخدم وضع الأسفار واسع المجال عن طريق قطعة عين.
- مع يعيش المسح الضوئي على، التحكم في مرحلة مجهر لمحاذاة المستوى البؤري لمنطقة الفائدة في الأنسجة. لتجنب الضوضاء الخلفية من كشف الغطاء، حدد المنطقة المستهدفة على الأقل 15 ميكرومترات عمق من الواجهة الزجاجية-الأنسجة.
- الحصول على المكدس صورة طيفية للمنطقة المستهدفة باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوات 2.1 – 2.10.
- حفظ البيانات للأنسجة وإزاحة الظلام في تنسيق TIF مولتيستاكيد .
ملاحظة: يمكن وقفه المجرب في هذه المرحلة.
4-تجهيز وتحليل الصور
- فتح البيانات الطيفية (مولتيستاكيد TIF) للمرأة إشارة وأنسجة المخ في إيماجيج.
- حدد رويس (المناطق ذات الاهتمام) رصات الصور المفتوحة – المنطقة الوسطى لمرآة المرجع والجزء المتعلق الألياف إكسون لانسجة المخ.
- الحصول على الأطياف الخام رويس المحدد بتشغيل الصورة ← ← مكدسات الشخصية "محور ع الأرض" في القائمة إيماجيج.
- فتح البيانات إزاحة الظلام، واحدة لمرآة الإشارة وغيرها المتخذة لانسجة المخ.
- الحصول على الأطياف لإزاحة الظلام بتشغيل الصورة ← ← مكدسات الشخصية "محور ع الأرض" في القائمة إيماجيج.
- حفظ كافة الأطياف المكتسبة باستخدام خيارات النسخ واللصق .
ملاحظة: لتصوير صبري، ينصح استخدام حقل التصوير المركزية لتقليل الانحرافات البصرية خارج المحور. ألياف إكسون قد تكون غير متجانسة هيكلياً على طول. ومن ثم تحديد العائد على الاستثمار على قطعة صغيرة من محور عصبي، عادة < 5 ميكرومتر، التقليل إلى أدنى حد جزئي-حجم قطعة أثرية المستحسن.
5-الأساس تصحيح وتحليل الإشارات صبري
- طرح الأطياف الإزاحة من الأطياف مرآة المرجعية وأنسجة الدماغ.
- تطبيع كل طيف بقسمة شدة الحد الأقصى من الطيف.
- تقسيم الطيف تطبيع إكسون بالطيف تطبيع مرآة مرجع وطرح الإزاحة DC من الطيف تم تسويتها.
- قياس التردد وافينومبير باحتواء الطيف المكتسبة إلى جيبية منحنى (انظر الجدول للمواد)، ثم قم بتحويل وافينومبير المكتسبة لتواترها بالمعاملة بالمثل مع أخذ.
- تحويل دورية وافينومبير إلى قطر إكسون باستخدام المعادلة في الشكل 4 ج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفقا للبروتوكول، وقد أعدت شريحة الدماغ ثابت مع تلطيخ خارجية، استهداف المايلين فلوروفوري (انظر الجدول للمواد). تصوير صبري أجرى على شريحة الدماغ باستخدام مجهر الطيفي تجارية [كنفوكل] بالتزامن مع الأسفار [كنفوكل] التصوير (الشكل 4 أ). لصبري، تم تعيين الكثافة البصرية الإدخال إلى 5 ميكرومتر µW/2 مع وقت يسكن بكسل المايكروثانيه ~ 1. هذه الجرعة الخفيفة على أمر من حجم أقل من الأسفار التقليدية مجهرية [كنفوكل]12. يستغرق ~ 17 s للمسح الطيفي فوق 470-670 نانومتر في فاصل زمني 4 نانومتر (الصور 51).
وكان مترجمة إشارة صبري على طول وسط محاور عصبية myelinated كما هو متوقع بهندسة الانعكاس الضوئي. من طيف الانعكاس قطعة إكسون، تم الحصول على دورية وافينومبير، التي تم تحويلها فيما بعد إلى قطر إكسون (الشكل 4 باء، وجيم). تم العثور على القطر يقاس صبري في اتفاق جيد مع القياس القائم على الأسفار (الشكل 4 د). خطأ بسيط المتبقية يمكن أن تكون قد نشأت أما من القرار حيود محدودة للأسلوب القائم على الأسفار أو غير مكتملة هندسية نموذجية لصبري.
تصوير صبري يستند إلى الانعكاس الضوئي، وبالتالي يمكن أن يعرض ساترة على أساس والسليكا ضجيج خلفية كبيرة. في الإعداد لدينا الألياف البصرية، كان ضجيج الخلفية كبيرة عند عمق التصوير من ساترة أقل من 5 ميكرومتر ولكن تم تجنبها عند عمق التصوير أكبر من 15 ميكرون (الشكل 5).
الشكل 1 : مبدأ صبري- إكسون myelinated لديها هيكل غشاء رقيق الطبقات. ضوء الحوادث جزئيا ينعكس قبالة في الواجهات، كما وصفها القانون فريسنل. وتنعكس هذه الموجات الخفيفة تتداخل مع بعضها البعض؛ ولذلك، الضوء المنعكس الناتج بترميز المعلومات نانوستروكتورال. ريفليكتوميتري الطيفية (صبري) يحصل على المعلومات التي نانوستروكتورال بفك الضوء المنعكس من محور عصبي ميليناتيد. وقد أعيد طبع هذا الرقم من كوون، J. et al. 9 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تصميم نظام صبري- ويستند نظام صبري مجهر انعكاس [كنفوكل]. للمسح الضوئي الطيفي، هناك حاجة إلى ثلاثة عناصر إضافية على طول طريق الإثارة: شعاع الليزر سوبيركونتينووم وتصفية الانضباطي (2) أكوستو البصرية (أوتف) (3) أكوستو البصرية (1) التقسيم (أوبس). يتم تصفية مصدر الليزر ذات النطاق العريض طيفيا بواسطة أوتف أحيل الطول موجي محدد مع عرض النطاق ترددي ضيق. أوبس تعمل كشعاع الخائن للطول الموجي المحدد لتوجيه الإثارة الخفيفة للعينة. ومن ثم على ضوء الحادث على العينة من خلال الماسح ضوئي جالفانوميتريك وعدسة الهدف. ديسكانيد الضوء المنعكس من العينة، وتصفية مكانياً بثقب [كنفوكل]، وتجمعها أنبوب ضوئي (PMT). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : برنامج الإعداد. () واجهة المستخدم الرسومية (GUI). في الإطار الرئيسي، وهناك أساسا خمسة أفرقة فرعية: التصوير الإعداد والإعداد الليزر والألياف البصرية الإعداد، الإعداد الكشف عن وعارض الصور. (ب) القائمة المنسدلة لتحديد وضع التصوير. لصبري، يتم تحديد xyλ. (ج) الفريق لضبط الإطار الطيفية للجهاز. (د) الفريق لإعداد التقسيم شعاع أكوستو البصرية (أوبس). 'الانعكاس' محدداً لتوجيه الضوء المنعكس على الجهاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : صبري على أنسجة المخ. () "صبري" الصورة أنسجة المخ مورين ملطخة كونتيرستينينج نيون من المايلين (فلوروميلين). طيف الانعكاس الممثل (ب) التي تم الحصول عليها من مربع منقط أبيض في (أ). (ج) منحنى إشارة محاكاة لتقدير قطر إكسون من تواتر الطيفية. النجمة الزرقاء هو نقطة البيانات التي تم الحصول عليها من (ب). (د) الشخصية مستعرضة من شدة الأسفار من منطقة محاصر في (أ). هو القطر الخارجي المايلين المقدرة باستخدام إشارة الأسفار ~ 760 نانومتر، الذي يتفق تماما مع قياس صبري. الخطأ المتبقي تصور من خطأ حيود القياس القائم على الأسفار. سكليبر، 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تأثير كشف الغطاء- (، ب) يتم الحصول على صور الانعكاس أنسجة المخ في نفس الموضع الأفقي في أعماق مختلفة من واجهة ساترة الأنسجة: في 3 ميكرومتر (أ) و 15 ميكرون (ب). سكليبر، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
صبري هو خال من تسمية تصوير أسلوباً جديداً يستند إلى قياس التداخل الطيفي، الذي يقدم معلومات نانوية في محاور عصبية myelinated لايف للمرة الأولى،. في اقتناء البروتوكول الحالي، القرار المكانية لقطر إكسون وسام 10 نانومتر. وعلاوة على ذلك، يستخدم سبيري أوامر من حجم أقل جرعة خفيفة مقارنة بغيرها ميكروسكوبيس القرار فائقة؛ ومن ثم، فحر من الضيائية وفوتوبليتشينج. صبري ستوفر سبيلاً جديداً لدراسة ديناميات النانو من محاور عصبية ميليناتيد.
البروتوكول الموضحة هنا يستند المسح الطيفي بوساطة أكوستو والبصريات وكاشف نقطة (أي، PMT). هذا النهج مفيد لاقتناء الصور الطيفية للحقل كامل من العرض. ومع ذلك، يقتصر القرار الوقت بالمسح الطيفي، وهو عادة s > 15 في أن التكوين الحالي. وكبديل لذلك، يمكن إدراجها من مطياف عالي السرعة لتمكين المراقبة في الوقت الحقيقي من حقل من عرض الصغيرة9. يمكن بناء هذا النظام ببساطة من نظام [كنفوكل] تقليدية بتبديل PMT طريق من مطياف وإضافة ليزر الضوء الأبيض. لشراء البرمجيات، يحتاج موقف جلفانومتر أن تكون متزامنة مع تشغيل المطياف. في حالة قياس نقطة واحدة، تتحدد في الأزمنة بمعدل الإطار من المطياف، التي يمكن أن تكون > 10 كيلوهرتز للأخيرة سبيكتروسكوبيس فائق السرعة. هذه الأزمنة ميلي ثانية الفرعية ينبغي أن يكون كافياً لمراقبة معظم ديناميات الفسيولوجية لمحاور عصبية myelinated فيفو. ويستند صبري على انعكاس الضوء؛ ولذلك، قد على ضوء الكشف عن الطول الموجي نفسه كإدخال النور. على العكس من ذلك، يشمل الأسفار التحول الطيفية (أي، تحول ستوكس)؛ وهكذا، ضوء الكشف عن طيفيا يمكن فصله عن الضوء الإدخال. تعتبر هذه الميزة مفيدة لاكتساب متزامنة من صبري والأسفار في العينة نفسها (كما هو موضح في الشكل 4). يمكن أن تؤثر على امتصاص الضوء الإدخال بواسطة fluorophore قياس صبري، ولكن الامتصاص من تلطيخ الفلورسنت نموذجي ماما منخفضة (< 1%).
من المذكرة، صبري قد كشف محدودة زاوي النطاق فقط ويمكن الكشف عن محاور عصبية مواز تقريبا لتصوير الطائرة. هذا الحد الزاوي لصبري حوالي 13.5° ± 9. للحصول على اتجاه محدد للفائدة، قد يميل العينة. في حالة العينات شفافة مثل الجنين الزرد، يمكن الحصول على كامل الحجمي بتدوير العينة. حد عملي إضافي أن ساترة شنت على عينة تنتج قوي التفكير مرة أخرى مما يؤدي إلى توليد إشارة خلفية عالية كما هو موضح في الشكل 5؛ يوصي بأنه ينبغي تجنب هذه المنطقة السطحية. صبري استناداً إلى الضوء المرئي بطول التوهين 1/ه ~ 20 ميكرومتر في أنسجة الدماغ. عمق اختراق الأنسجة نموذجية للحصول على معلومات موثوقة الطيفية ويقتصر على ~ 100 ميكرومتر. أعمق تصوير قد يكون ممكناً إذا كان يتم استخدام لم يعد مصدر إدخال. وفي النهاية، يرد المصادقة على صبري بمقارنته مع الفحص المجهري fluorescence حيود محدودة. لقد كان هذا على ما يبدو غير كاف لتقييم دقة النانو (الشكل 4). تقنيات الأخيرة، مثل الميكروسكوب الضوء-الإلكتروني ستتحقق والتوسع في الفحص المجهري، أن توفر وسيلة للتحقق من صحة صبري في النانو نظام13،14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن تضارب المصالح المالية: J. كوون وتشوي م. مخترعين تكنولوجيا براءات الاختراع في انتظار الموضحة في هذه المقالة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بمعهد العلوم الأساسية (IBS-R015-D1) ومن "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تمولها وزارة التعليم (2017R1A6A1A03015642).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cutter | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | - |
| Matlab | MathWorks | - | - |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | - |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | - |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | - |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
References
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C.
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Chang, J. B., et al.
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
