Summary
Vi beskriver en metod för isolering av endokrina celler från embryon, neonatal och postnatal bukspottkörtlar följt av encelliga RNA-sekvensering. Denna metod tillåter analyser av pankreas endokrina härstamning utveckling, cell heterogenitet och transcriptomic dynamik.
Abstract
Pankreas endokrina celler, som är grupperade i små öar, reglerar blod glukos stabilitet och energiomsättning. De olika celltyper i holmar, inklusive insulin-utsöndrar β-celler, särskiljs från gemensamma endokrina föräldraparets under embryostadiet. Omogna endokrina celler expandera via cellförökning och mogna under en lång postnatal utvecklingstoxicitet. Mekanismerna bakom dessa processer är dock inte klart definierade. Encelliga RNA-sekvensering är en lovande metod för karakterisering av olika cellpopulationer och spåra cell härstamning differentiering vägar. Här, beskriver vi en metod för encelliga RNA-sekvensering av isolerade pankreas β-celler från embryonala, neonatal och postnatal bukspottkörtlar.
Introduction
Bukspottkörteln är ett viktigt metaboliska organ hos däggdjur. Bukspottkörteln består av endokrin och exokrin fack. Pankreas endokrina celler, inklusive insulinproducerande β och glukagon-producerande α celler, klustret tillsammans i de Langerhanska öar och reglerar coordinately systemisk glukoshomeostasen. Dysfunktion av endokrina celler resultaten vid diabetes mellitus, som har blivit en viktig folkhälsofråga i hela världen.
Bukspottkörtelns endokrina celler härleds från Ngn3+ stamfäder under embryogenes1. Senare, under den perinatala perioden föröka de endokrina cellerna till formuläret omogna holmar. Dessa omogna celler fortsätter att utveckla och gradvis bli mogen holmar, som blivit rikt vaskulariserad för att reglera blod glukos homeostas i vuxna2.
Även om en grupp av transkriptionell faktorer har identifierats som reglerar β celldifferentiering, är exakt mognad stigen av β-celler fortfarande oklart. Dessutom innebär de β-cellen mognadsprocessen också regleringen av cell nummer expansion3,4 och generering av cellulära heterogenitet5,6. Dock har regleringsmekanismer av dessa processer inte varit väl studerat.
Encelliga RNA-sekvensering är en kraftfull metod som kan profilera cell subpopulationer och spåra cell härstamning utvecklingsmässiga vägar7. Dra nytta av denna teknik, centrala händelser som inträffar under bukspottskörteln holme utveckling kan dechiffreras på enskild cell nivå8. Bland de encelliga RNA-sekvensering protokoll kan Smart-seq2 generering av fullängds cDNA med förbättrad känslighet och noggrannhet, och användningen av standardreagens på lägre kostnad9. Smart-seq2 tar ungefär två dagar att konstruera ett cDNA bibliotek för sekvensering10.
Här föreslår vi en metod för isolering av fluorescens-märkt β celler från bukspottkörtlar av foster till vuxen Ins1 Armeringsputs transgena möss11, med hjälp av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), och utförandet av transcriptomic analyser på den enskild cell nivå, med hjälp av Smart-seq2 teknik (figur 1). Detta protokoll kan utvidgas till att analysera transcriptomes av alla pankreas endokrina celltyper i normala och patologiska och åldrande staterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Peking University.
1. bukspottkörteln isolering
-
För E17.5 (embryonala dag 17,5) embryon:
- Uppskatta embryonala dygn 0,5 baserat på tidpunkten när vaginal kontakten visas.
- Offra de dräktiga möss av CO2 administration. Spraya den buk pälsen med 70% alkohol.
- Göra en V-formad snitt med sax från det genitala området sträcker sig till revbenen. Denna process kommer att helt öppna bukhålan.
- Dissekera livmodern ut ur bukhålan och placera den i en 10 cm maträtt som innehåller kall PBS.
- Dissekera embryon från livmodern med tunn-tipped pincett under ett stereomikroskop, ta bort andra vävnader, till exempel moderkakan och navelsträngen. Placera alla embryon i en 10 cm maträtt som innehåller kall PBS.
- Riv embryon bukhålan och gräva ut visceral vävnad med elbow pincett. Över den visceral vävnaden till en 6 cm svart-botten maträtt som innehåller kall PBS.
- Bukspottkörteln ligger i den övre vänstra delen av buken och fäster till magen, mjälte och tolvfingertarmen (gula streckade linjen i figur 2A)12. Lossa bukspottkörtlar från visceral vävnad med hjälp av pincetten och sammanföra de bukspottkörtelns vävnaden till en 20 mL injektionsflaska innehåller 5 mL 0,5 mg/mL kall kollagenas lösning: 0,5 mg/mL kollagenas P i isolering buffert (HBSS innehållande 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM glukos, pH 7,4).
-
För P0-P15 (postnatal dag 0-15) möss:
- Offra och fixa musen genom att följa lemmar att en bit av bänkmonterade protector med tejp. Spraya den buk pälsen med 70% alkohol.
- Helt öppna bukhålan som beskrivs i steg 1.1.3. Dra ut tarmen ut och till vänster sida av musen. Detta förfarande kommer att utsätta den duodenal, magsäcken och mjälten loberna i bukspottkörteln. Noggrant dissekera alla lober av bukspottkörteln (figur 2B)12 och sammanföra de bukspottkörtelns vävnaden till en 20 mL injektionsflaska innehåller 5 mL 0,5 mg/mL kall kollagenas lösning.
-
För P18-P60 (postnatal dag 18-60) möss:
- Bered den kollagenas. Hålla på is tills klar för användning.
- Offra musen och öppna bukhålan som nämns ovan (steg 1.1.2 och 1.1.3).
Obs: Skadar inte levern, eventuella sår till levern kommer att minska flödet in i gallgången och perfusion effektiviteten i följande steg. - Ta bort xiphoid. Dra tarmen ut och till höger sida av musen och tryck vänster och höger mediala loberna i levern till varje sida att exponera gallblåsan (vita pilen i figur 2 c) och den gemensamma gallgången.
- Klämma tolvfingertarmen med ett par små fartyg klämmor på övre och nedre positionen, flankerande platsen där gallgången kommer in i tolvfingertarmen (figur 2D).
Obs: Inte klämma magsår eller mjälten loberna i bukspottkörteln. Kollagenas lösningen kommer inte att flöda in i magsäcken och mjälten LOB i bukspottkörteln i nästa steg om fastklämd. - Fyller en spruta med 5 mL 0,5 mg/mL kall kollagenas och infoga en 30 G nål i gallblåsan. Noggrant och smidigt, manipulera nålen genom gallgången.
- BEGJUTA bukspottkörteln genom att injicera 1 – 5 mL 0,5 mg/mL kall kollagenas lösning, beroende på storleken på musen. Injektionen ska vara långsam och konstant så att nålen glider ut ur kanalen och att förhindra att tarmen spricker under flytande högtryck. Injektionen är klar när bukspottskörteln är fullt expanderad.
- Dissekera bukspottkörteln (den gula streckade linjen i figur 2D) ur bukhålan med pincett omedelbart efter perfusion. Placera vävnaden i en 20 mL injektionsflaska innehållande 5 mL 0,5 mg/mL kall kollagenas lösning. Om manipulerar mer än en mus i taget, BEGJUTA mössen en efter en och poolen vävnader till kalla kollagenas lösning i en injektionsflaska 20 mL tills alla möss har varit dissekerade.
2. kollagenas matsmältningen och ö-isolering
- Placera den 20 mL injektionsflaska innehållande bukspottskörteln vävnad till 37 ° C vattenbad och Inkubera under 3 min temperera temperaturen.
- Skaka försiktigt röret för en annan 3-5 min. Om den bukspottkörtelns vävnaden är helt uppblåst, kommer det gradvis separera i små vävnad bitar tills det slutligen är spridd jämnt. Koktiden varierar beroende på storleken på bukspottkörteln och perfusion effektivitet.
- Filtrera den smälta produkten genom ett 0,25 mm nylon SIL i en ny 50 mL centrifugrör. Grundligt tvätta silen med en 20 mL spruta innehåller iskall PBS.
- För E17.5-P15 bukspottkörtlar, hoppa till steg 3.1.
- För P18-P60 bukspottkörtlar, Centrifugera vid 200 x g i 1 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendering vävnaden med kall PBS.
- Häll 5 mL av vävnad suspensionen i en 6 cm svart-botten maträtt. Langerhanska är små, kompakta, mjölkaktig vit strukturer och acinar vävnad är lös och genomskinlig vit. Plocka holmar med 200 μL pipett och överföra dem i en 1,5 mL tub som innehåller en liten mängd kall PBS.
3. trypsin rötning av bukspottkörtelns vävnad eller holmar
- Centrifugera röret som innehåller bukspottkörtelns vävnad eller holmar vid 200 x g för 1 minuter vid 4 ° C och kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten.
- Resuspendera pelleten med 0,25% trypsin-EDTA och inkubera i 37 ° C vattenbad. Efter 4 minuters inkubation, aspirera försiktigt och ibland (pipett) för 1 min med 200 μL tips.
Obs: För E17.5-P3 bukspottkörtlar, lägga till 1 mL trypsin-EDTA. För P4-P15 bukspottkörtlar, lägga till 3 mL trypsin-EDTA. För 100-300 holmar, tillsätt 1 mL trypsin-EDTA. Volymen av trypsin-EDTA enligt mängden vävnad. - Stoppa matsmältningen genom att lägga till 0.4 x volym kalla fetalt bovint serum (FBS) och blanda genom varsam vortexing.
- Centrifugera vid 250 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten.
- Slamma upp cellerna med 200 μl kallt FACS buffert (HBSS innehållande 1% FBS, pH 7,4). Överföra celler till en 5 mL FACS tub.
- Snabbt spinna FACS röret för att tillåta cellsuspensionen passera genom filtret för att ta bort osmält stor vävnad skräp. Den enda cellsuspensionen i röret är nu redo för FACS sortering.
4. single-cell Lysis
-
Förbereda cell lyseringsbuffert.
Obs: Utför alla experiment under en UV-steriliseras huva med laminärt flöde. Alla rör, plattor och pipettspetsar bör RNase- / DNAS-gratis. Sanera huven och pipetter med RNase bort lösning före användning.- Tina reagenserna på is: dNTP (10 mM), oligo-dT primer (10 μM) och ERCC stamlösning (1:20).
- Späd ERCC till 1:5 x 105 med nuclease-gratis vatten.
- Beräkna volymen av cell lyseringsbuffert behövs. Tillsätt 0.1 μl av RNase inhibitor (40 U/μL), 1,9 μL av 0,2% (vol/vol) Triton x-100, 1 μL av dNTP, 1 μL av oligo-dT primer och 0,05 μL utspätt ERCC till en slutlig volym av 4,05 μL för varje cell.
- Alikvot cell lysis bufferten i 0,2 mL tunnväggiga 8-stripe PCR-rör eller 96 brunnar. Centrifugera det rör eller plattor för 30 s vid 4 ° C.
Obs: Centrifugera 0,2 mL tunnväggiga 8-stripe PCR-rören vid 7500 x g och 96 brunnar vid 800 x g i följande steg.
-
Encelliga plockning och Lys.
- Manuellt plocka FACS sorterade Ins1-RFP+ enstaka celler i FACS buffert i 8-strip PCR-rör med 30 – 40 µm kapillär pipett eller direkt sortera Ins1-RFP+ enstaka celler i 96 brunnar. Volymen som innehåller en enda cell anses vara mindre än 0.3 μL.
Obs: Använd framåt scatter höjd (FSC-H) vs vidarebefordra scatter område (FSC-A) Usenets strategi för doublet diskriminering, FSC-H vs sida scatter område (SSC-A) för skräp och fluorescens gating för Ins1-RFP+ cellen (figur 3A-3C) sortering. För metoden med plockning, sortera målceller i en 1,5 mL tub som innehåller 300 μL FACS buffert. Lämpliga slutliga koncentration är 5 – 10 celler/μL. Justera volymen buffert. För den platta insamlingsmetoden, sortera en enskild cell i varje brunn av en plattan med 96 brunnar efter handboken till instrument. 7 , 13 - Vortex den rör eller plattor att lysera celler och släppa RNA. Centrifugera det rör eller plattor för 30 s vid 4 ° C och omedelbart placera dem på isen.
Obs: Cellerna kan lagras vid-80 ° C för en vecka.
- Manuellt plocka FACS sorterade Ins1-RFP+ enstaka celler i FACS buffert i 8-strip PCR-rör med 30 – 40 µm kapillär pipett eller direkt sortera Ins1-RFP+ enstaka celler i 96 brunnar. Volymen som innehåller en enda cell anses vara mindre än 0.3 μL.
5. single-cell cDNA förstärkning
-
Omvänd Transkription (RT).
- Tina de RT reagenserna (tabell 1) på is.
- Inkubera proverna vid 72 ° C under 3 minuter och omedelbart sätta den rör eller plattor på is för minst 1 min. kort Centrifugera det rör eller plattor för 30 s vid 4 ° C.
Obs: Använd en termocykel med 105 ° C värms lock för alla inkubationer. - Förbereda den RT-mix för alla reaktioner, som beskrivs i tabell 1.
- Dosera 5,7 μL av RT mix till varje prov att få volymen till sammanlagt 10 μL. Försiktigt vortex mixen och Centrifugera i 30 s vid 4 ° C.
- Placera proverna i en termocykel och starta programmet RT enligt följande: 42 ° C i 90 min, 10 cykler (50 ° C i 2 min, 42 ° C i 2 min), 70 ° C i 15 min och håll vid 4 ° C.
-
PCR-före amplifiering.
- Tina de PCR reagenserna (tabell 2) på is.
- Förbered PCR-mixen för alla reaktioner, som beskrivs i tabell 2.
- Fördela 15 μL PCR-mix till varje prov, vilket innehåller de första-strand reaktionerna. Försiktigt vortex mixen och Centrifugera i 30 s vid 4 ° C.
- Placera proverna i en termocykel och starta programmet följande PCR: 98 ° C för 3 min, 18 cykler (98 ° C för 20 s, 67 ° C för 15 s, 72 ° C i 6 min), 72 ° C i 5 min och håll vid 4 ° C.
Obs: PCR-produkten kan lagras vid 4 ° C för mindre än en vecka eller vid-20 ° C /-80 ° C i upp till 6 månader.
-
PCR-rening.
- Tillsätt 25 μL av nytt svävande DNA rening pärlor (1 x) till varje prov från föregående steg och blanda väl genom vortex. Sedan snabbt spinna de rör eller plattor i rumstemperatur att samla vätska men undvika bosättningen av pärlor.
Obs: Temperera DNA rening pärlor till rumstemperatur för 15 min och vortex noggrant innan användning. - Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Plats röret eller platta på ett lämpligt magnetiska stå tills lösningen är klar, sedan försiktigt bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μl av nylagade 80% etanol att tvätta pärlorna i den magnetisk stå, inkubera i 30 s, sedan försiktigt bort och kassera etanol lösningen.
Obs: 80% (vol/vol) etanol lösningen bör vara nyberedd varje gång. - Upprepa steg 5.3.4 för sammanlagt två tvättar.
- Ta försiktigt bort och kassera resterande etanol lösningen och torka pärlor medan röret eller plattan är på magnetiska stativet.
Obs: Undvik uttorkning pärlorna för att säkerställa maximal eluering effektivitet. - Tillsätt 11 μl nuclease-fritt vatten för att eluera DNA målet från pärlor och blanda väl genom vortex. Sedan snabbt snurra på röret eller platta och placera den på en magnetisk stå tills lösningen är klar. Överför 10 μL av provet till en ny PCR-röret.
Obs: Om dimerer finns efter en enda runda för rening, baserat på cDNA storlek distribution upptäckt, rena igen för att ta bort dimerer helt. Dimerer kan påverka beräkningen cDNA avkastning om får kvarstanna i provet.
- Tillsätt 25 μL av nytt svävande DNA rening pärlor (1 x) till varje prov från föregående steg och blanda väl genom vortex. Sedan snabbt spinna de rör eller plattor i rumstemperatur att samla vätska men undvika bosättningen av pärlor.
-
Kvalitetskontroll av cDNA.
- Slumpmässigt välja prover för att upptäcka den cDNA totala avkastningen använder en fluorometer.
- Utvärdera markör gen uttrycksnivåerna av realtids-PCR (qPCR) (figur 4E). Ta bort 1 μL av provet med utspädd 40 gånger och utföra qPCR med en plattan med 384 brunnar. Förbereda qPCR blandningen enligt beskrivningen i tabell 3. Cykling villkor: 95 ° C i 10 min, 45 cykler (95 ° C under 10 s, 60 ° C under 15 s, 72 ° C under 15 s).
- Slumpmässigt välja prover att upptäcka storleksfördelning med ett parallellt kapillärelektrofores instrument.
6. cDNA bibliotek konstruktion
-
Tagmentation reaktion av den Tn5 transposase.
- Upptäcka den cDNA totala avkastningen av qPCR-markerade celler från steg 5.4.2 använda en fluorometer. Använd 2 ng av cDNA som utgångsmaterial.
- Tina tagmentation reaktion reagenserna (tabell 4) på is.
- Förbered tagmentation reaktionen i en 0,2 mL tunnväggiga 8-stripe PCR-röret, som beskrivs i tabell 4, och blanda försiktigt av virvel. Sedan snabbt spinna ner lösningen i rumstemperatur.
- Inkubera proverna vid 55 ° C i 10 min och håll vid 4 ° C.
- Tillsätt omedelbart 2 μL av 5 x TS i varje prov som innehåller tagmented DNA för att stoppa reaktionen. Blanda försiktigt av virvel, och sedan snabbt spinna ner lösningen i rumstemperatur.
- Inkubera blandningen 5 minuter i rumstemperatur. DNA bör behandlas för slutliga anrikningen PCR omedelbart.
-
Förstärkning av adapter-sammanskrivna fragment.
- Tina de PCR reagenserna (tabell 5) på is.
- Förbereda anrikning PCR-mixen, som beskrivs i tabell 5, och blanda noga av virvel. Sedan snabbt spinna ner lösningen i rumstemperatur.
- Utföra PCR med följande program: 72 ° C i 10 min, 98 ° C i 30 s, 8 cykler (98 ° C under 15 s, 60 ° C under 30 s, 72 ° C under 3 min), 72 ° C i 5 min och håll vid 4 ° C.
Anmärkning: Antalet cykler beror på det beräknade bibliotek DNA beloppet.
-
PCR-rening med storlek urval.
- Tillsätt 14 μL av nytt svävande DNA rening pärlor (0,7 x) till varje prov från föregående steg och blanda väl genom vortex. Sedan snabbt spinna röret vid rumstemperatur att samla vätska men undvika bosättningen av pärlor.
Obs: Temperera DNA rening pärlor till rumstemperatur för 15 min och vortex noggrant innan användning. - Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Placera röret på en lämplig magnetisk stå tills lösningen är klar, noggrant överför supernatanten till en ny tube-remsa och kassera den tidigare tube-randen.
- Tillsätt 3 μL av nytt svävande DNA rening pärlor (0,15 x) på varje prov i tube stripe och blanda väl genom vortex. Sedan snabbt spinna röret vid rumstemperatur.
- Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Plats röret eller platta på ett lämpligt magnetiska stå tills lösningen är klar, sedan försiktigt bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μl av nylagade 80% etanol att tvätta pärlorna i den magnetisk stå, inkubera i 30 s, sedan försiktigt bort och kassera etanol lösningen.
Obs: 80% (vol/vol) etanol lösningen bör vara nyberedd varje gång. - Upprepa steg 6.3.7 för sammanlagt två tvättar.
- Ta försiktigt bort och kassera resterande etanol lösningen och torka pärlor medan röret eller plattan är på magnetiska stativet.
Obs: Undvik uttorkning pärlorna för att säkerställa maximal eluering effektivitet. - Tillsätt 11 μl nuclease-fritt vatten för att eluera DNA målet från pärlor och blanda väl genom vortex. Sedan snabbt snurra på röret eller platta och placera den på en magnetisk stå tills lösningen är klar. Överför 10 μL av provet till en ny tube-rand.
- Tillsätt 14 μL av nytt svävande DNA rening pärlor (0,7 x) till varje prov från föregående steg och blanda väl genom vortex. Sedan snabbt spinna röret vid rumstemperatur att samla vätska men undvika bosättningen av pärlor.
-
Kvalitetskontroll av slutliga cDNA bibliotek.
- Mätning av koncentrationen av varje bibliotek som använder en fluorometer och kontrollera fördelningen av storlek med ett parallellt kapillärelektrofores instrument.
Obs: DNA avkastningen är vanligtvis mellan 15 – 25 ng för varje bibliotek. Fragment från 250 bp till 450 bp kommer att iakttas. Om dimerer finns kvar efter rening, vilket bekräftas av storlek distribution checken, rena med 1 x DNA rening pärlor en gång.
- Mätning av koncentrationen av varje bibliotek som använder en fluorometer och kontrollera fördelningen av storlek med ett parallellt kapillärelektrofores instrument.
-
Bibliotek sammanslagning
- Baserat på ungefärliga fragment storlek, pool lika mängder DNA från varje prov, att säkerställa att ingen av dem innehåller samma kombination av N6XX och N8XX adaptrar.
7. DNA-sekvensering
- Angående barcoded bibliotek till 51 bp single-end sekvensering med ett högt dataflöde sekvensering system. Utföra den sekvensering efter tillverkarens protokollet. Sekvensering djupet av varje cell är ca 1 miljon läser i genomsnitt8, minst 0,5 miljoner läser per cell14.
8. bioinformatik analyser
-
Ordningsföljd för kvalitetsbedömning och justering.
- Utvärdera kvaliteten på sekvenserade läsningar med FastQC (v0.11.3)15 med följande parametrar: ”fastqc--extrakt -o output_dir input_fastq”.
- Sammanfoga mus genomet med ERCC sekvenser med kommandot ”cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa”.
- Bygga bowtie2 (v2.2.5)16 index med följande parametrar: ”bowtie2-bygga mm10_ERCC.fa mm10_ERCC”.
- Justera läsningar med tophat2 (v2.1.0)17 med följande parametrar: ”tophat2 -o output_dir -G gene.gtf--transkriptom-index trans_index mm10_ERCC input_fastq”.
-
Kvantifiera gen uttryck nivåer.
- Antal mappade läser för varje gen med HTSeq (v 0.6.0)18 med följande parametrar: '' htseq-count - f bam - r pos -s ingen - en 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
- Normalisera gen uttryck nivåer att utskrifter per miljon (TPM)19.
-
Kvalitetskontroll av celler.
- Utesluta celler med färre än 0,5 miljoner mappade läsningar eller färre än 4 000 gener (TPM > 1).
Obs: kriteriet av utslagning beror på celltyper och sekvens djup. - Behålla celler som uttrycker endokrina markörer (t.ex. Ins1 för β-celler, Gcg för α celler) och utesluta celler som uttrycker icke-endokrina markörer (t.ex. Spi1 för leukocyter).
- Utesluta celler med färre än 0,5 miljoner mappade läsningar eller färre än 4 000 gener (TPM > 1).
-
Principalkomponentanalys (PCA)
- Identifiera mycket varierande gener enligt ERCC spike-ins, som tidigare beskrivits20.
- Utföra PCA med hjälp av funktionen ”PCA” i R-paket FactoMineR (v1.31.4)21, med log2(TPM + 0.1) av mycket varierande gener.
- Visualisera PCA resultaten med ggplot2 (v2.0.0)22.
-
Hierarkiska klustring.
- Identifiera gener med den högsta huvudkomponenten (PC) belastning med funktionen ”dimdesc” FactoMineR (v1.31.4)21.
- Utföra hierarkisk klustring med hjälp av funktionen ”heatmap.2” i den R paket gplots (v3.0.1)23, med log2 (TPM + 1) relativa värden av hög PC lastning gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bukspottkörtlar var dissekeras från embryonala, neonatal och postnatal möss (figur 2A och 2B). För möss äldre än postnatal dag 18 beror mag effekten på graden av perfusion; injektionen är därför det viktigaste steget för ö-isolering (figur 2 c-2E samt tabell 6). Så mycket kollagenas injicerades som var möjligt att fylla bukspottkörteln under detta steg. Fullt uppblåst bukspottkörteln visas i figur 2D. Om perfusionen är inte framgångsrik (figur 2E), men provet är dyrbar, kan bukspottkörteln rivas i små bitar för tillräcklig matsmältningen senare.
Efter perfusion, har bukspottskörteln vävnad smält i små bitar att släppa holmar (figur 2F). För att förkorta FACS sortering, berikad vi de endokrina cellerna genom att plocka holmarna i förväg. Storleken på holmarna kan variera beroende på mus ålder och matsmältningen intensiteten. Ibland, är kobbar och skär inte runda. Holmar bör väljas enligt färg och kompakt skick (figur 2 g och tabell 6). Om transgena möss stam har en reporter gen, till exempel GFP eller RFP för endokrina celler, kunde holmarna också plockas i fluorescens Mikroskop.
Ins1-RFP+ celler var renas av FACS sortering (figur 3A-3 C), och sedan enstaka celler plockades med kapillär pipett för encelliga RNA-seq (figur 3D). Framgångsrikt förstärkt cDNA bör ha en full längd över 500 bp och berikas från 1,5 kb till 2 kb. Dessutom finns det oftast en 500-600 bp berikning av cDNA som observerats i de Ins1-RFP+ celler, som kan representera insulin avskrifter (figur 4A). Det har dock några onormala situationer observerade10 (tabell 6). Till exempel cDNA fragment nära 100 bp är primer dimerer (figur 4B), som vanligen orsakas av överdriven primers, som måste tas bort genom att upprepa steget för DNA-rening. Förekomsten av primer dimerer kan påverka beräkningarna av totala cDNA avkastningarna, vilka används för följande bibliotek byggande. CDNA fragment mellan 100 bp och 500 bp vanligtvis representerar degraderad cDNA (figur 4 c), som orsakas av dålig cell status eller reagens problem, såsom RNase kontaminering. Under detta tillstånd, bör vi identifiera orsaken till DNA nedbrytning och utesluta störningar. Exempelvis för att säkerställa bra cellen, vävnader ska smältas och celler ska sorteras snabbt och skonsamt, och åtgärder bör utföras försiktigt för att undvika någon typ av föroreningar.
Efter rening av cDNA biblioteken för sekvensering erhöll vi cDNA fragment av olika storlekar genom att följa instruktionerna för att lägga till olika nyckeltal av DNA rening pärlor till provet. Exempelvis kan vi få cDNA som sträcker sig från 250 bp till 450 bp genom att lägga till 0.7 x och 0,15 x DNA rening pärlor till första och andra rundor av rening, respektive (figur 4 d). Detta steg har en hög framgång. Dock om det finns fragment av ungefärligt 100 bp, föreslås det för att rena biblioteken igen med 1 x DNA rening pärlor att ta bort dimerer (tabell 6). Unremoved dimerer kommer snedställa DNA kvantifiering och kommer att påverka provet samla resultat, vilket resulterar i ojämn dataförvärvet från varje prov.
Vi analyserade sekvensering data med bioinformatik metoder (figur 5A). De sekvensering kvalitetsresultat bör vara större än 30 under sekvensering kvalitetsbedömning (figur 5B). Efter justering förväntas 80-90% av läser mappas till referens genomet. För att få hög kvalitet celler för nedströms analyser, vi exkluderade celler med färre än 0,5 miljoner mappade läser eller med färre än 4 000 upptäckta gener (figur 5 c och 5 D). Efter PCA och hierarkisk klustring, vi kännetecknas olika grupper av celler och identifierade gener som uttrycktes heterogeneously i olika grupper8.
Figur 1: Schematisk översikt för encelliga RNA-seq mus pankreas endokrina celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bukspottkörteln dissektion, perfusion och holme plockning. (A) dissektion i embryonala bukspottkörtelns vävnad (nedre) från ett E17.5 embryo (övre). Den gula streckade linjen avgränsas av bukspottkörtelns vävnad. Skalstapeln = 1000 µm. (B) dissekering av postnatal bukspottkörtelns vävnad (höger) från en P10-mus (vänster). Skalstapeln = 1000 µm. (C-D), bukspottskörteln vävnad av en P60 mus innan (C) och efter (D) perfusion. Den gula streckade linjen avgränsas av bukspottkörtelns vävnad. Vit pil anger gallblåsan. (E) den delvis perfunderade bukspottkörtelns vävnaden P60 musklick. Röd pil anger området väl perfunderade i bukspottkörteln. Blå pilar indikerar dåligt perfunderade områdena i bukspottkörteln. (F) i bukspottskörteln vävnad innan (övre) och efter (lägre) kollagenas matsmältningen. (G) pilarna pekar till holmar som gavs ut från kollagenas rötas bukspottkörtelns vävnad. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: manuellt plocka celler med 30 – 40 µm kapillär pipett i Mikroskop. (A-C) Stegvis FACS gating för sortering Ins1-RFP+ celler. (D) de ljusa cirklar visar celler och röret är en kapillär pipett. Plocka cellerna med bättre morfologi (pil) och ignorera de klustrade cellerna (pilspets). Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvalitet upptäckt av cDNA och bibliotek storleksfördelningen för Ins1-RFP+ celler genom en parallell kapillärelektrofores instrument. (A), företrädaren till följd av framgångsrikt pre förstärkta cDNA. Normalt, den cDNA-profilen bör vara över 500 bp med en ~1.5–2 kb topp. (B) de representativa resultatet av pre förstärkta cDNA med en primer dimer topp. Primer dimer toppen är cirka 100 bp. (C), profilen på förhand förstärkta cDNA fragment mellan 100 bp och 500 bp anger möjligheten av cDNA nedbrytning. (D) fördelningen av storlek av cDNA bibliotek mellan 250 bp och 450 bp efter rening stegen som nämns i detta protokoll. (E), uttrycket nivåer av Ins2 i cDNA bibliotek av qPCR (vänster) och relativ sekvensering data (höger). X-axes utgör distinkta 8 enda cellprover. Y-axeln (vänster) representerar normaliserade ΔCt i förhållande till Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) och y-axeln (höger) normaliserad uttryck nivå av Ins2 i förhållande till Gapdh (log2(TPM- Ins2 / TPMGapdh)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bioinformatik analyser av encelliga transkriptom data. (A) rörledningen av bioinformatik analyser. (B) sekvensering kvalitetsresultat över alla baser läsningar. (C) fördelning av mappade Läs räkningen. (D) fördelningen av identifierade genen räknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Volym (µL) |
| Omvänt transkriptas (200 U/µL) | 0,5 |
| RNase inhibitor | 0,25 |
| Första-strand buffert (5 x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0,5 |
| Betain (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0,06 |
| TSO (100 ΜM) | 0,1 |
| Nuclease-gratis vatten | 0,29 |
| Totalt | 5.7 |
Tabell 1: RT reagens blanda komponenter i en 5,7 µL reaktion för varje prov.
| Komponent | Volym (µL) |
| Första-strand reaktion | 10 |
| DNA-polymeras (2 x färdigblandat) | 12.5 |
| ÄR PCR primers (10 µM) | 0,25 |
| Nuclease-gratis vatten | 2,25 |
| Totalt | 25 |
Tabell 2: PCR före förstärkning reagens blanda komponenter i en 25 µL reaktion för varje prov
| Komponent | Volym (µL) |
| SYBR Green Master Mix | 5 |
| Grundfärger (5 µM) | 0,5 |
| Nuclease-gratis vatten | 2.5 |
| cDNA | 2 |
| Totalt | 10 |
Tabell 3: qPCR reagens blanda komponenter i en 10 µL reaktion med en standard plattan med 384 brunnar.
| Komponent | Volym (µL) |
| 5 x TTBL | 1.6 |
| 2 ng cDNA | Variabel |
| ddH2O | Variabel |
| TTE Mix V5 | 2 |
| Totalt | 8 |
Tabell 4: Tagmentation reagens blanda komponenter i en 8 µL reaktion för varje prov.
| Komponent | Volym (µL) |
| ddH2O | 1.6 |
| Produkt av föregående steg | 10 |
| 5 x fliken | 4 |
| N6XX | 2 |
| N8XX | 2 |
| TAE | 0,4 |
| Totalt | 20 |
Tabell 5: Anrikning PCR reagens mix komponenter i en 20 µL reaktion för varje prov.
| Steg | Problemet | Möjligheten | Lösning |
| 1.3.4 | Glider av klämmorna | Den yttre ytan av tarmen är våt orsakas av förekomsten av den lilla mängden interstitiell vätska och collegenase leakness | Försiktigt byta tolvfingertarmen väggen och andra orgel väggar i bukhålan med bomullspinnar |
| 1.3.6 | Inälvan burst | Flytande trycket är för högt i tarmen | Långsammare injektion |
| 2.6 | Holmar fastnar exokrin vävnad när plocka holmar | Otillräcklig matsmältningen | Förlänga hela matsmältningen och skaka styrka |
| 5.3 | CDNA avkastningen är låg efter PCR-amplifiering | Cellerna är i dåligt skick | Hålla celler frisk och i bra skick |
| 5.4 eller 6,4 | Primer dimerer kan ses | Överdriven grundfärger | Rena cDNA en gång med DNA rening pärlor (0.8:1 eller förhållandet 1:1) |
| 5.4 | Försämrade cDNA efter PCR-amplifiering | Dålig kvalitet på celler eller förorenade reagenser | Hålla celler i bra skick eller ändra reagenser |
| 6.3 | Mängden DNA är låg efter bibliotek konstruktion | Alltför få PCR cykler eller kvaliteten på cDNA är inte bra | Öka antalet cykler eller säkerställa cDNA kvalitet innan biblioteket konstruktion |
Tabell 6: Felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll visade vi en effektiv och lätt-till-använda metod för att studera de encelliga uttryck profilerna av pankreas β-celler. Denna metod kan användas att isolera endokrina celler från embryon, neonatal och postnatal bukspottkörtlar och utföra encelliga transcriptomic analyser.
Det mest kritiska steget är isoleringen av enda β-celler i bra skick. Fullt perfunderade bukspottkörtlar svarar bättre på efterföljande matsmältningen. Otillräcklig perfusion, som vanligtvis förekommer i dorsala bukspottkörteln, kommer att resultera i en låg holme avkastning. Efter perfusion kräver koktiden och skakar intensitet särskild uppmärksamhet. Överdriven matsmältningen, resulterande från långa inkubationstider och kraftig kan skakning, bryta kobbar och skär i bitar. Otillräcklig matsmältningen kommer inte helt separata kobbar och skär från intilliggande vävnader. Efter matsmältningen i bukspottkörteln, var holmarna renas genom hand plockning i stället för täthet lutning centrifugering. Även om täthet lutning centrifugering kan berika holmar, ignoreras av misstag många små holmar eller holmar ansluten med acinar vävnad. Försök att undvika att plocka acinar vävnad, vilket kan orsaka ineffektiv trypsin matsmältningen och minska renheten hos de β-cellerna.
Oberoende biologiska replikat är nödvändiga för att skilja biologiska variationer och batch effekter. Om två biologiska replikerar har ett liknande mönster i PCA och inkludera liknande undergrupper i kluster resultat, dessa prover kan avslöja pålitlig biologisk variabilitet. Annars måste ytterligare biologiska replikat bekräfta resultaten. För ett metaboliska organ såsom bukspottkörteln, kan cell staten är associerad med den dygnsrytm klocka24 redogöra för batch skillnader. För att lösa detta problem, rekommenderar vi att samla alla prov vid samma tid på dagen.
Begränsning av detta tillvägagångssätt är låg genomströmning eftersom vi har att bygga ett bibliotek för varje cell. På grund av överdriven primers i reaktionen, cDNA före och efter bibliotek konstruktion generellt bör renas två gånger för att helt ta bort de primer dimerer. Dessa processer är tidskrävande. Nyligen, en modifierad protokoll25 rapporterades som kunde lösa problemet i viss utsträckning. I detta protokoll etiketter-specifika streckkoden cDNA fragment under omvänd Transkription steg. Därför cDNA i varje cell kan poolas tillsammans och sedan renas, följt av bibliotek konstruktion. Denna ändring ökar markant genomströmning av bibliotek konstruktion. Dock ändrade metoden är mindre känslig och upptäcker färre gener per cell. Denna metod är dessutom en 3' räknande metod med nedsatt Läs täckning. Smart-seq2 är därför fortfarande den lämpligaste metoden för bukspottskörteln utveckling.
Bukspottskörteln preparatet från andra arter kan vara olika. För mänskliga bukspottkörteln, kan holmarna isoleras efter föregående protokoll26,27. Sedan de isolera öarna kan särskiljas i enstaka celler28 och utföra encelliga analyser med hjälp av denna metod. Denna metod kan i stor utsträckning till forskningen av däggdjur bukspottskörteln utveckling, sjukdomar och förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar det nationella centret för Protein Sciences, Beijing (Peking University) och Peking-Tsinghua Center för Life Science Computing-plattformen. Detta arbete stöds av ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2015CB942800), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31521004, 31471358 och 31522036) och finansiering från Peking-Tsinghua Center för Life Sciences till C.-R.X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3' |
||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3' |
||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' |
||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' |
||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' |
||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' |
||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A.
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer Science & Business Media. (2009).
- Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
