Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a extração de ácidos nucleicos de vírus rápida do vírus inactivados todo sangue. A extração é realizada diretamente em tubos de colheita de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade. O método não é dependente de instalações laboratoriais e pode ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha).
Abstract
O diagnóstico rápido de uma infecção é essencial para a gestão do surto, contenção de risco e atendimento ao paciente. Anteriormente mostramos um método para a inactivação de cabeceira rápida do vírus Ebola durante a amostra de sangue para testes de ácidos nucleicos seguro (NA), adicionando um tampão de Lise comercial/ligação diretamente para os tubos de coleta de sangue do vácuo. Usando essa abordagem de inactivação de cabeceira, nós desenvolvemos um seguro, rápido e simplificado cabeceira NA extração método para a detecção subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. A extração de nd é realizada diretamente em tubos de coleta de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade.
Depois que o sangue é colhido para o buffer de Lise/vinculação, os conteúdos são misturados por inversão do tubo com a mão, e a mistura é incubada por 20 min em temperatura ambiente. Partículas de vidro magnética (pop) são adicionadas ao tubo, e o conteúdo é misturado por inversão do tubo de coleta com a mão. O pop é então coletados no lado do tubo de coleta de sangue usando um suporte magnético ou um íman e uma faixa de borracha. O pop é lavados três vezes, e depois da adição de tampão de eluição directamente para o tubo de coleta, NAs está pronto para testes de at, tais como qPCR ou amplificação isotérmica laço (lâmpada), sem a remoção do pop da reação. O método de extração de at não é dependente de quaisquer instalações de laboratório e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha e enfermarias de isolamento). Quando este método de extração de nd é combinado com a lâmpada e um instrumento portátil, um diagnóstico pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.
Introduction
Em situações de surto de vírus, quando os pacientes estão confinados para as enfermarias de isolamento ou quando houver necessidade de um diagnóstico rápido, um seguro, simples e preciso diagnóstico molecular do point-of-care é imperativo para a contenção de cuidados e risco de paciente. Os dois surtos virais recentes, do vírus Ebola (EBOV) na África Ocidental (2013) e o vírus Zika na América do Sul (2015), aumentaram o interesse na melhoria point-of-care molecular testes de diagnóstico, tais como isothermal mediada por laço de transcrição reversa amplificação (RT-lâmpada)1,2 e recombinase polimerase amplificação (RPA)3,4. RT-lâmpada tanto RPA são testes moleculares rápidos, sensíveis e específicas que podem ser executadas em preparações de amostra simplificada. Para o vírus Zika, RT-lâmpada foi combinada com um ensaio de fluxo lateral (LFA), que pode detectar vírus Zika em amostras de sangue não-purificada dentro de 30 min1; no entanto, para EBOV, que é classificado como um patógeno do grupo 4 de risco e é altamente contagiosa, as amostras precisam ser manipuladas em Biossegurança de nível 4 (BSL-4) condições e inativado antes de quaisquer procedimentos de diagnósticos seguros podem ser realizados.
Métodos de inativação simplificado para EBOV, tais como a adição de buffers de Lise para a amostra2,3,4,5, foram utilizados durante o surto; no entanto, esses métodos requerem tratamento em condições de BSL-4 com equipamentos de laboratório, tais como armários de biossegurança BSL-3, centrífugas, blocos de aquecimento e pipetas, no mínimo. Este equipamento normalmente não está presente em enfermarias de isolamento ou em hospitais de campanha. Para superar este desafio, foram feitas tentativas para executar diagnósticos em malas3, e vários dispositivos portáteis e máquinas foram desenvolvidos [por exemplo, um dispositivo portátil para extração de ácidos nucleicos (at)]6. No entanto, amostras de EBOV-positivo ainda precisam ser inativado antes que estes dispositivos podem ser usados.
Temos anteriormente relatado um método de inativação de vírus cabeceira rápida para o EBOV7, vírus Vaccinia e Cowpox vírus8 pela adição de um tampão de Lise/ligação comercial para tubos de colheita de sangue vácuo ordinário, permitindo o direto transferência de sangue do paciente para a inactivação de tampão7. Esta inativação directa e imediata, em um sistema fechado elimina a necessidade para a manipulação das amostras usando qualquer confinamento rigoroso, tais como condições de BSL-47, e as amostras podem ser manipuladas em condições normais de BSL-2. Este método de inativação é compatível com vários sistemas de extração de at, tais como robôs e kits de purificação mão7; no entanto, esses métodos exigem equipamento de laboratório, como robôs, centrifugadores e eletricidade, que não estão sempre presentes em configurações do campo ou dentro de enfermarias de isolamento.
Neste relatório, descrevemos um seguro, rápido e simplificado NA extração método manual para detecção molecular subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração de at não exige qualquer equipamento que não seja um suporte magnético/imã. Não centrifugadores, blocos, ou eletricidade de aquecimento são necessários para a extração de at. Portanto, esse método não é dependente de instalações laboratoriais e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha, em enfermarias de isolamento, ou com as configurações de recursos Baixos). O método de extração de nd é rápida e simples e pode ser usado diretamente em qualquer testes de at a jusante, tais como qPCR, RT-qPCR, lâmpada ou RT-lâmpada. Quando este método de extração de at é combinado com a lâmpada e um instrumento isotérmico orientado a bateria portátil, um diagnóstico de cabeceira pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.
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Protocol
O Comitê de ética de pesquisa biomédica, região Capital deu consentimento informado, e todos os métodos descritos aqui foram isentos de uma revisão pelo sistema do Comité de ética, em conformidade com a lei dinamarquesa sobre projetos de desenvolvimento de ensaio.
1. preparação de tubos de vácuo de coleta de sangue para a inactivação do vírus e rápida NA extração
Atenção: O buffer usado para este protocolo contém de guanidinium (GITC) e tensoativo não-iônico, que são irritantes. Tomar medidas de segurança de laboratório adequado, usar um capuz de fluxo e use luvas ao manuseá-lo. Evite qualquer pele e contato com os olhos. Se o buffer é derramado, a superfície contaminada nunca deve ser desinfectada diretamente com cloramina ou hipoclorito de sódio (os ingredientes ativos em "bleach") porque essa mistura pode levar à formação de cianeto tóxico. Primeiro, limpe o buffer derramado com o tecido absorvente. Em seguida, limpe a superfície com etanol a 70% e, em seguida, com água e finalmente, usar cloramina ou hipoclorito de sódio.
- Para preparar os tubos de vácuo de coleta de sangue, Injete 1,6 mL de tampão de Lise comercial específica em um tubo de vácuo EDTA 4 mL por perfurar a tampa do tubo usando uma seringa de 3 mL e uma agulha de 25 x 1.
Nota: Não remova a tampa do tubo de vácuo. O vácuo deve ser mantido. - Armazene os tubos de vácuo contendo o buffer em temperatura ambiente até o uso.
Nota: Os tubos são estáveis pelo menos 1 ano após a sua preparação.
2. preparação de Buffers para extração de at
- Para preparar os buffers para uma extração de at, coloque dois 1.8 mL, dois 4,5 mL e um 3,6 mL tubos em um rack.
- Adicione, pipetando, 960 µ l de partículas de vidro magnética (pop) para um tubo limpo 1,8 mL e rótulo com pop. Ressuspender a suspensão MGP completamente antes de pipetagem-lo.
Nota: O pop tende a coletar rapidamente na parte inferior do tubo. - Adicionar, pipetando, 4 mL de tampão de lavagem para um tubo limpo 4,5 mL e rotulá-la como WB-1.
Atenção: O tampão de lavagem I contém cloreto de guanidínio, que é irritante. Tomar medidas de segurança de laboratório adequado, usar um capuz de fluxo e use luvas ao manuseá-lo. Evite qualquer pele e contato com os olhos. - Adicionar, pipetando, 1,5 mL de tampão de lavagem II para um tubo limpo 3,6 mL e rotulá-la como WB-2.
- Adicionar, pipetando, 3 mL de tampão de lavagem III para um tubo limpo 4,5 mL e rotulá-la como WB-3.
- Adicionar, pipetando, 100 µ l de tampão de eluição para um tubo limpo 1,8 mL e rotulá-la como EB.
- Armazene os buffers aliquotados à temperatura ambiente até o uso.
Nota: Os tubos são estáveis pelo menos 1 mês após a sua preparação.
3. coleção sangue de pacientes com sinais e sintomas de uma infecção de vírus
Cuidado: Tomar as medidas de segurança de laboratório adequado ao coletar sangue total do paciente. Use luvas e óculos. Se o paciente está em isolamento, por favor, siga os procedimentos de nível 4 de biossegurança.
- Para coletar intravenosa sangue total do paciente, use uma agulha borboleta com tubos de extensão de pequeno calibre e um tubo de vácuo de coleta de sangue com um tampão de Lise/vinculação. Descansa braço do paciente em uma posição para baixo e posicione o tubo de coleta menor do que a agulha da borboleta. Insira a agulha de borboleta na veia do paciente e conecte o tubo de vácuo de coleta de sangue para a extensão de pequeno calibre.
Nota: Isto irá prevenir o refluxo. - Após a coleta de sangue, misture o conteúdo do tubo por inversão do tubo 5 - 10 vezes.
Nota: Devido o vácuo restante no tubo de coleta de sangue contendo 1,6 mL de tampão de Lise/vinculação, o volume da amostra recolhida automaticamente será 1,6 mL. - Desinfecte o exterior do tubo usando etanol a 70%.
- Incube os tubos por 20 min em temperatura ambiente.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e os tubos de colheita de sangue completo podem ser armazenados a-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C ou 37 ° C, durante pelo menos 1 mês7. - Continue-se diretamente para o método de extração NA simplificada.
4. simplificado NA extração do sangue inteiro
- Para purificar o nd do lise/ligação inactivadas tampão coletado sangue, mistura o conteúdo do tubo lançando o vácuo do tubo à mão x 10-5.
- Retire a tampa do tubo com cuidado e a tampa de descarga.
- Despeje a preparado alíquota do pop (1 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
- Coloque uma tampa nova de um tubo de coleta de sangue não utilizados no tubo que contém a amostra.
- Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado e misturar o conteúdo do tubo por inversão do tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.
- Colocar o tubo no suporte magnético e mantenha um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
- Vire o suporte magnético com o tubo algumas vezes à mão para certificar-se de que todos os pop é coletados no lado do tubo com o ímã.
Nota: O suporte magnético pode ser substituído com um ímã alongado e um elástico. - Retire a tampa do tubo e descartar o conteúdo do tubo utilizando uma pipeta descartável ou simplesmente derramando o conteúdo em um tubo de coleta de 50 mL.
Nota: Evite aerossóis do tubo de coleta de 50 mL, fechando o tubo com uma tampa. - Despeje a preparado alíquota de WB-1 (4 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
- Retire o tubo do porta magnética, mantendo a tampa bem apertada com um dedo.
Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo. - Ressuspender o pop ao virar o tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.
- Repita as etapas de 4.6-4.8.
- Despeje a preparado alíquota de WB-2 (1,5 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético.
Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo. - Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
- Ressuspender o pop lançando o tubo de coleta de sangue com a mão por alguns segundos.
- Repita a etapa 4.6-4.8.
- Despeje a preparado alíquota de WB-3 (3 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético.
Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo. - Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
- Ressuspender o pop ao virar o tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.
- Repita as etapas de 4.6-4.8.
- Despeje a preparado alíquota do EB (100 µ l) directamente para o tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético.
Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo. - Resuspenda o pop no EB tocando o tubo de coleta de sangue 5 - 10 vezes com um dedo.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e os tubos podem ser armazenados a-20 ° C. - Transferi uma gotícula (5-8 µ l) da ressuspensão pop à jusante NA amplificação reação mistura usando uma pipeta descartável de 1,5 mL (qualquer amplificação de at diagnóstica a jusante do ensaio, tais como lâmpada/RT-lâmpada ou qPCR/RT-qPCR ensaios podem ser usados).
Nota: NAs vai grudar o pop, então certifique-se usar o pop na reação de amplificação de at a jusante. Misture a suspensão MGP antes do uso. Após a mistura, o pop vai coletar no fundo do tubo.
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Representative Results
O protocolo aqui apresentado é simples e eficiente e pode ser amplamente aplicado a qualquer ensaio molecular a serem realizadas em amostras de sangue infecciosas inactivadas com o tampão de Lise/vinculação. O fluxo de trabalho para a inactivação de sangue e NA extração é mostrado na Figura 1, incluindo a preparação de sangue coleção tubos de vácuo7 (figura 1A), a coleta de sangue7 (figura 1B), a extração de ND ( Figuras 1 - 1 H) e a análise de at a jusante (Figura 1I).
Devido o protocolo de extração NA simplificada, o pop não é removidos da etapa de eluição, e, portanto, NAs tende a ficar para o pop. Qualquer análise molecular a jusante, tais como qPCR ou análise de lâmpada, deve ser realizada diretamente sobre o pop (Figura 1I e Figura 2) para garantir um resultado positivo.
O método de extração de nd é amostras de sangue de todo eficiente e o RNA ou DNA-vírus-positivo com cargas virais tão baixas como 130-3.000 cópias/mL podem ser extraídos e analisados usando qPCR ou RT-qPCR (Figura 3).
Usando o método de extração de at, lâmpada ou RT-lâmpada e um dispositivo isotérmico orientado a bateria portátil para amostras de sangue total de vírus-positivo, o diagnóstico pode ser obtido dentro de 40 min da coleção do sangue (Figura 4).
Figura 1 : Fluxo de trabalho para extração de at simplificado de amostras de sangue total. (A) preparar que a coleção de sangue vácuo de tampão de Lise/ligação tubos usando uma agulha e uma seringa. (B) coletar o sangue com uma agulha de borboleta. (C) Coloque o tubo de coleta de sangue em um suporte, retire a tampa e despeje o tubo com o pop. (D) fechar o tubo com uma tampa nova e misturar o conteúdo por inversão do tubo com a mão. (E) coletar o pop na lateral do tubo de coleta de sangue por inversão do tubo no suporte magnético. (F) remover o sobrenadante com uma pipeta descartável. (G) despeje os buffers de lavagem ou eluição diretamente o tubo de coleta de sangue e repetir as ações mostradas em painéis D - F. (H), este painel mostra pop pronto para uso direto em um qPCR, reação de RT-lâmpada, lâmpada ou RT-qPCR. (eu) transferência uma gotícula (5-8 µ l) de pop para um tubo de reação de PCR ou lâmpada usando uma pipeta descartável de 1,5 mL. Painel de A e B: esta figura foi modificada de Rosenstierne et al . 7. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Deteção de nd de 28 amostras de sangue total de vírus-positivo extraído usando o método de extração at simplificado. Amostras de sangue total negativo testado (1,6 mL) para um vírus estava cravado com qualquer um DNA-vírus [vírus de Epstein - Barr (EBV) (2,0 x 104 - 1,0 x 103 cópias/mL)] ou um RNA-vírus [vírus da hepatite C (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 cópias/mL)] ou um vírus da Dengue (DENV) (1.7 x 108 - 1.7 x 106 cópias/mL). NAs foram extraídas usando o método descrito acima, e o extraído NAs foram analisadas em duplicado por RT-PCR, qPCR interno específico, lâmpada ou RT-lâmpada, com ou sem pop. O x-eixo = o método de detecção NA y-eixo = o percentual de amostras positivas em qPCR/lâmpada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Sensibilidade de método simplificado de extração at. Para uma prova de conceito do método, sangue total negativo de vírus foi cravado com preparações diferentes de vírus de DNA ou RNA, contendo uma carga viral definida e NAs foram extraídas pelo método simplificado NA extração. (A) sangue negativo (1,4 mL) foi cravado com 200 µ l de diluições de 10 vezes da norma EBOV preparado para fins de diagnóstico (ENIVD), que foi preparado desde o recente surto no Guéckédou/Guiné (2,0 x 106 cópias/mL). O extraído NAs foram analisadas em duplicado por um específico EBOV RT-qPCR in-house7 usando um cycler térmico MX3005P. (B) todo sangue (1,2 mL) foi cravado com 400 µ l de 10 vezes as diluições de uma amostra de soro padronizada de HCV que (1,2 x 106 UI/mL). NAs extraídos foram analisado em duplicado por um in-house HCV-específicos RT-qPCR usando um cycler térmico MX3005P. (C) todo sangue (1,2 mL) foi cravado com 400 µ l de diferentes concentrações de EBV (2,0 x 104 cópias/mL, 8,0 x 103 cópias/mL, 2.7 x 103 cópias/mL e 9,3 x 102 cópias/mL). O extraído NAs foram analisadas em duplicado por um in-house qPCR EBV-específicos. (D) sangue (1,2 mL) foi cravado com 400 µ l de diluições de 10 vezes de um vírus de BK (1,3 x 104 cópias/mL). O extraído NAs foram analisadas em duplicado por um in-house qPCR BK-específicos. O x-eixo = a concentração final de um vírus na amostra cravado de sangue total (cópias/mL ou UI/mL), o y-eixo = Ct-valor (média ± DP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Simplificado NA extração e RT-lâmpada ou lâmpada usando um dispositivo portátil isotérmico. (A) devido à falta de amostras de sangue total EBOV-positivo no departamento de vírus & microbiológicos diagnósticos especiais, Statens Serum Institut, Dinamarca, 1,4 mL de sangue negativo foi cravado com 200 µ l de diferentes diluições do EBOV padrão, preparado para fins de diagnóstico (ENIVD). As amostras cravadas foi submetido a uma extração at usando o método de extração de at simplificado e foram analisadas por uma reação de RT-lâmpada de EBOV específico. Como um controle negativo, uma amostra de sangue negativo foi incluída. O x-eixo = a concentração final de EBOV na amostra de sangue de todo cravado (cópias/mL), o y-eixo = o min para positivo. (B) para uma prova de conceito, alíquotas de sangue total (1,6 mL) de 7 pacientes, diagnosticada positivo para EBV (13.000-500 cópias/mL) no departamento de vírus & microbiológicos diagnósticos especiais, Statens Serum Institut, Dinamarca, foi submetido a um at extração pelo método simplificado NA extração e foram analisados por uma reação de lâmpada EBV específicos usando orientado a bateria Genie II isotérmico dispositivo portátil. Como um controle negativo, uma amostra de Parvo B19-positivo foi incluída. O x-eixo = a carga viral do EBV em uma amostra do paciente (cópias/mL), o y-eixo = o min para positivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste relatório, nós descrevemos um seguro, rápido e simples cabeceira NA extração método manual para detecção molecular a jusante de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração NA descrito foi desenvolvido para ser executada diretamente em amostras de sangue total coletadas em tubos de colheita de sangue vácuo contendo a Lise/ligação tampão (Tabela de materiais)7. Esse buffer específico inactivates EBOV7 e é o componente crítico no método. Após a coleta de sangue, nós recomendamos a incubar o tubo pelo menos 20 min7 a fim de garantir uma completa inativação da amostra. A cabeceira inactivação de EBOV elimina a necessidade para a manipulação de amostras mais EBOV-positivo em condições de rigorosa contenção, tais como condições de BSL-4 e permite que as amostras para serem manipulados em condições normais de BSL-2. É provável que outros quatro patógenos de grupo de risco, tais como o vírus de Lassa, o vírus de Marburg e o vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo também são inactivados por esta reserva, mas esta continua a ser mostrado.
O método de extração descrito nd foi desenvolvido para ser executado ao lado de um paciente em uma ala de isolamento do hospital ou em um hospital de campo e, portanto, exige nenhum equipamento de laboratório, como centrífugas, blocos de aquecimento ou eletricidade. Tudo o que o método de extração de at requer são tubos contendo um volume fixo de pop ou buffers de lavagem, um suporte magnético e pipetas descartáveis. A pré-preparação dos tubos contendo buffers simplifica o protocolo porque elimina a necessidade para pipetas, e em vez disso, os buffers aliquotados são despejados diretamente para os tubos de amostra. O suporte magnético captura o pop contendo o nd e Medeia uma manipulação fácil das etapas de lavagem. O suporte magnético pode ser substituído com um ímã comum e um elástico, no caso de um suporte magnético não está disponível; no entanto, o suporte magnético reduz o risco prático de soltando o tubo e derramar o conteúdo ao aplicar o ímã e o elástico. Devido a viscosidade da amostra de sangue de todo inactivadas tampão de Lise/ligação, pipetas descartáveis são usadas para remover os buffers de sobrenadante/líquido/lavagem do tubo. As pipetas descartáveis podem ser substituídas por um direto despejando o conteúdo do tubo de um tubo de recolha de lixo, mas por favor esteja ciente para não criar qualquer gotículas fora do tubo. Se as gotas são criadas, a superfície contaminada nunca deve ser desinfectada diretamente com cloramina ou hipoclorito de sódio (os ingredientes ativos em "bleach") porque essa mistura pode levar à formação de cianeto tóxico. Portanto, se derramado primeiro, limpe o derramamento com um tecido absorvente. Em seguida, limpe a superfície com etanol a 70% e, em seguida, com muita água e finalmente, usar cloramina ou hipoclorito de sódio. Isso inclui todos os resíduos que tem estado em contacto com o tampão de Lise/ligação (incluindo o tubo de coleta de resíduos e as pipetas descartáveis). Em vez disso, coletar todos os resíduos em um recipiente de recolha separado e só desinfectar o exterior do recipiente com etanol a 70%.
NAs são normalmente eluídas do pop durante uma etapa de aquecimento, mas este passo de aquecimento foi removido no protocolo de extração de at simplificado para eliminar o uso de eletricidade e equipamentos. Portanto, NAs tende a ficar para o pop, que, portanto, deve ser adicionado para o ensaio de deteção at a jusante para uma detecção positiva de at. O pop é transferidos para a mistura de reação a jusante usando uma gota de uma pipeta descartável de 1,5 mL. Esta adição não é tão precisa quanto a adição normal usando uma pipeta de ponta da nadadeira; no entanto, a adição de imprecisa de at/pop à lâmpada, mistura de reação de RT-lâmpada, qPCR ou RT-qPCR não inibir a reação ou influenciar o sinal de fluorescência em nosso ensaio diagnóstico in-house. No entanto, este pode diferir de um ensaio para o ensaio, e recomendamos que todos os testes NA jusante é validado, e que a sensibilidade do ensaio é testada usando o método de extração NA simplificada. O método de extração de nd é relativamente sensível e amostras de sangue total contendo um DNA ou RNA vírus tão baixo como 3.000 cópias/mL pode ser facilmente extraído e detectado nos testes moleculares a jusante, tais como qPCR. A carga viral em amostras clínicas é geralmente muito alta durante a fase aguda da infecção, e vírus de Lassa, vírus de febre hemorrágica, tais como o EBOV e vírus de febre hemorrágica da Crimeia-Congo, geralmente contêm mais de 105 cópias/mL9 ,10,11. Portanto, vírus nestas amostras facilmente podem ser detectadas usando esse método de extração de at. No entanto, a inactivação de MPLB de vírus diferentes a7EBOV, Vaccinia e Cowpox vírus8 continua a ser mostrado.
O método de extração at simplificado pode ser executado em enfermarias de isolamento ou em configurações do campo e é ideal para o diagnóstico molecular de point-of-care. No entanto, o método não é aplicável para extracções de at de alta produtividade devido a manipulação de hands-on de um tubo aberto. Se forem necessárias extrações de at de alta produtividade, as amostras inactivadas sangue total facilmente podem ser purificadas usando NA extração robôs7. Outra desvantagem é a manipulação de reagentes prejudiciais tais como o buffer de17 e lavagem de buffer [20-30% polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter e 30-50% de guanidinium (GITC)] lise/ligação eu (30-50% guanidínio cloreto de potássio)17 em um tubo aberto fora um capuz de fluxo. O buffer de Lise/ligação na forma concentrada é contido no interior do tubo de vácuo e com a coleta de sangue de 1:1 (v/v), a concentração é reduzida antes que o tubo é aberto. A abertura do tubo de vácuo e a adição/remoção de pop ou o tampão de lavagem é realizada em poucos segundos e, portanto, o risco de inalação de aerossóis é mínimo. Após a remoção do tampão de lavagem-eu, do tubo, sem outros reagentes prejudiciais são usados no protocolo.
Muitos testes moleculares rápidos de point-of-care e dispositivos foram desenvolvidos desde a eclosão EBOV em 20133,6,12,13,14,15,16 . No entanto, muitos destes testes ainda requerem um tratamento de montante de infecciosas materiais, armários de biossegurança BSL-3 e em um mínimo, equipamento de laboratório, tais como pipetas, centrífugas e blocos de aquecimento ou eletricidade. O uso de armários de biossegurança complica e prolonga um diagnóstico rápido. A inactivação de vírus cabeceira descrito com a recolha directa de sangue para os tubos de inactivação de vírus combinado com o método de extração at simplificado elimina a necessidade de armários de biossegurança, electricidade e instalações laboratoriais. Além disso, porque o método de extração de at simplificado pode ser realizado ao lado do paciente e combinado com uma reação de lâmpada em um dispositivo portátil isotérmico orientado a bateria, um seguro diagnóstico molecular cabeceira pode ser obtido dentro de 40 min.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen para sua assistência técnica e para a manipulação das amostras clínicas. Este projeto faz parte do consórcio EbolaMoDRAD, que recebeu financiamento da inovadora medicina iniciativa 2 empresa comum sob concessão acordo N ° 115843. Esta empresa comum recebe apoio da investigação de Horizonte 2020 da União Europeia e programa de inovação e da EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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