Summary
Hier beschrijven en vergelijken we twee posities voor het verkrijgen van de apicale vier kamer weergave in muizen. Deze posities maken de kwantificering van de rechter ventriculaire functie mogelijk, bieden vergelijkbare resultaten en kunnen door elkaar worden gebruikt.
Abstract
Diastolische dysfunctie is een prominente eigenschap van rechter ventriculaire (RV) remodellering in verband met de voorwaarden van overbelasting van de druk. Echter, de RV diastolische functie wordt zelden gekwantificeerd in experimentele studies. Dit kan te wijten zijn aan technische moeilijkheden in de visualisatie van de RV in de apicale vier kamer weergave in knaagdieren. Hier beschrijven we twee posities die de visualisatie van de apicale vier kamer weergave in muizen vergemakkelijken om de diastolische RV-functie te beoordelen.
De apicale vier kamer weergave wordt ingeschakeld door het muis fixatie platform naar links en caudally (LeCa) of naar rechts en cranially (RiCr) te kantelen. Beide posities bieden beelden van vergelijkbare kwaliteit. De resultaten van de RV diastolische functie verkregen uit twee posities zijn niet significant verschillend. Beide posities zijn relatief eenvoudig uit te voeren. Dit protocol kan worden opgenomen in gepubliceerde protocollen en maakt gedetailleerd onderzoek van de RV-functie mogelijk.
Introduction
Diastolische dysfunctie is een prominente eigenschap van rechter ventriculaire (RV) remodeling1 en wordt geassocieerd met druk overbelasting voorwaarden2. Echocardiografie (echocg) kan worden gebruikt voor de karakterisering van RV diastolische disfunctie3,4. Ondanks recente ontwikkelingen in kleine dierlijke echocardiografie, worden metingen van diastolische parameters zelden gerapporteerd. Metingen van de systolische functie worden daarentegen veel gebruikt voor de karakterisering van transgene muizen5en voor de evaluatie van een behandelings respons6.
Dit kan deels worden verklaard door de moeilijkheden bij het meten van de diastolische parameters uit de apicale vier kamer weergave. Visualisatie van het hart in deze positie kan worden vergemakkelijkt door het fixatie platform LeCa of RiCr te kantelen. Zelfs als deze manipulaties gebruikt worden, rapporteren echocardiografen ze niet in hun manuscripten4,7. Daarom blijft het onduidelijk of deze manipulaties vergelijkbare resultaten opleveren. Bovendien verzet dit zich ook tegen een ontwikkeling van een gestandaardiseerde nomenclatuur van deze positie voor muizen.
Het doel van deze studie was om twee posities te beschrijven voor apicale visualisatie van vier kamer weergave en hun resultaten te vergelijken. Om de verschillen tussen de twee posities te bepalen, hebben we de muis longslagader banding (PAB) model gebruikt, waarin een tantaal clip leidt tot een gedeeltelijke occlusie van de longslagader. Deze occlusie resulteert in de rechter ventrikel remodellering en dysfunctie. De volledige details van de PAB-bewerking u vinden in eerder gepubliceerde werk3. Sham-bediende muizen, waar de clip werd geplaatst naast de longslagader, werden gebruikt voor vergelijking. EchoCG onderzoeken werden drie weken na de operatie uitgevoerd met behulp van het imaging systeem met een 30 MHz scan hoofd (Zie tabel van de materialen voor beide). Nomenclatuur voor de beschrijving van de posities en oriëntaties tussen de muis en de ultrasone straal wordt gebruikt zoals beschreven door Zhou et al.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd uitgevoerd volgens nationale voorschriften voor dierproeven en EU-richtlijn 2010/63. Apparatuur voorbereiden zoals eerder beschreven door Brittain et al.8.
1. voorbereiding van de muis
- Verkrijg 12 tot 13 weken oude mannelijke C57Bl6/J muizen en huis ze met een licht/donkere cyclus van 12 uur, bij een constante kamertemperatuur en met ad libitum toegang tot standaard laboratorium Chow en water, tot het begin van het experiment.
- Anesthetiseer de muis met behulp van algemene anesthesie goedgekeurd door het Instituut en controleer of het gebrek aan reactie op de teen pinch. Onder milde anesthesie met Isofluraan 0,8% – 1,2%, bevestig de muis op een verwarmd platform. Breng elektrode gel aan op de extremiteiten voor de continue monitoring van de hartslag en temperatuur.
- Ontharing de borsthaar van de muis met behulp van ontharing crème. Om de druk op de thorax te verminderen, moet u de ultrasone koppelings gel niet direct op de thorax toepassen; Breng in plaats daarvan een laag van de gel aan op de punt van de transducer.
2. beeld verwerving
- Apical vier kamer zicht met links en caudale Tilt van het platform
- Na de voorbereiding van de muis, verlateren het platform naar links bij 10 ° – 15 ° en dan caudally bij 10 ° – 15 °.
- Positioneer de transducer boven de Apex met het beeldvormings vlak ~ 45 ° naar het coronale vlak en de centrale as van de ultrasone straal die op cranially, posterior en links is gericht om het apicale-aanzicht van vier kamer te verkrijgen. Druk op de b-mode -knop om de b-modus/2-D-afbeelding te activeren.
Opmerking: De transducer kan handmatig of vast door een podium worden vastgehouden. De term "B-mode" is afkomstig van het beeldvormings systeem dat werd gebruikt in plaats van de bekendere term "tweedimensionaal" (2-D) en wordt in het hele protocol gebruikt. - Zoek naar het uiterlijk van de volgende structuren in het akoestische venster: de linker ventrikel (LV), het linker Atrium (LA), de RV, het rechter Atrium (RA), de mitralisklep (MV) en de tricuspidalisklep (TV).
- Manipuleer het beeldvlak in het coronale vlak en draai de klok-en linksom rond de centrale as tot beide ventrikels op hun langste afmeting worden gevisualiseerd en beide atria zichtbaar zijn. Dit is de weergave met vier kamer (Figuur 1).
- Druk op de Cine Store -knop om de opname op te slaan.
- Druk op de knop scannen/vastzetten om het systeem te pauzeren.
- Meting van transtricuspid bloedstroom snelheden
- Druk op de knop scannen/vastzetten om het systeem te activeren.
- Druk meerdere malen op de overlay -knop om het sample volume voor de PW-modus (Pulsed Wave) te activeren.
- Houd de verkregen vier kamer weergave bij, gebruik de trackball om het monstervolume te positioneren bij de opening van de tricuspidalisklep-kleppen voor de meting van instroom snelheden (E en een pieksnelheden).
- Druk op de PW -modusknop voor de meting van instroom snelheden (E en een pieksnelheden).
Opmerking: Omdat tricuspidaliskleppen in deze positie moeilijk te visualiseren zijn, helpt het uitvoeren van verschillende metingen om het monstervolume correct uit te lijnen met de bloedtoevoer. Voer de Doppler bemonstering uit met de kleinste incidentie hoek tussen de Doppler-straal en de bloedstroom richting. Het verkregen bloedstroom profiel moet overeenstemmen met de volgende criteria: 1) een instroom profiel vergelijkbaar met een M-vorm met de eerste piek lager dan de tweede; 2) een respiratoire modulatie met een verhoogde amplitude op inspiratie; 3) een maximale amplitude van snelheden in verschillende metingen (Figuur 2). - Druk op de Cine Store -knop om de geoptimaliseerde opname op te slaan.
- Druk op de knop scannen/vastzetten om het systeem te pauzeren.
- Meting van de tricuspidvormige ring vlak systolische excursie (TAPSE)
- Druk op de knop scannen/vastzetten om het systeem te activeren.
- Schakel over naar B-modus door op de b-mode- knop te drukken. Sommige manipulaties op de afbeelding zijn mogelijk nodig om de juiste vier kamer weergave te herstellen.
- Druk meerdere malen op de overlay -knop om het sample volume van de M-modus te activeren. Gebruik de trackball om het monstervolume af te stemmen op het laterale gedeelte van de tricuspidalisklep annulus. Door de randen van het monstervolume met behulp van de trackball te trekken, lijnt u de lengte van het monstervolume uit om de gehele amplitude van de hart beweging tijdens de hart cyclus te bedekken.
- Druk op de m-mode- knop om m-modus te activeren. Tricuspid annulus ' bewegingen moeten verschijnen als een golf (Figuur 2).
- Druk op de Cine Store -knop om de opname op te slaan.
- Druk op de knop scannen/vastzetten om het systeem te pauzeren.
- Meting van de weefseldoppler parameters
- Druk op de knop scannen/vastzetten om het systeem te activeren.
- Druk op de b-mode knop om b-modus te activeren.
Opmerking: Sommige manipulaties door Angulatie in het coronale vlak en rotatie klok-en linksom rond de centrale as van de afbeelding kunnen nodig zijn om de juiste vier kamer weergave te herwinnen. - Druk meerdere malen op de overlay -knop om het sample volume voor TDI (weefsel Doppler-Beeldvorming) te activeren. Met behulp van de trackball, uitlijnen van het monstervolume met de laterale deel van de tricuspidalisklep annulus, waar de RV vrije muur creëert een hoek met de tricuspidalisklep. Door de randen van het monstervolume met behulp van de trackball te trekken, past u het monstervolume aan om zowel de systolische als de diastolische extreme posities van de annulus op te nemen.
-
Druk op de weefsel knop om de TDI-modus te activeren.
Opmerking: gele tracering van de TDI-opname wordt weergegeven met de volgende criteria: 1) een opname die vergelijkbaar is met een omgekeerde M-vorm; 2) duidelijk te onderscheiden E ' en een ' pieken tijdens diastole en S ' piek tijdens de systole; 3) een maximale amplitude van snelheden in verschillende metingen (Figuur 2). - Druk op de Cine Store -knop om een geoptimaliseerde afbeelding op te nemen.
- Druk op de knop scannen/vastzetten om het systeem te pauzeren.
- Apical vier Kamer aanzicht met rechter-en craniale Tilt van het platform
- Verover het platform rechts op 10 ° – 15 ° en dan craniale bij 10 ° – 15 °. Voer de metingen uit zoals beschreven in de vorige secties voor de LeCa-stappen (stappen 2,1, 2,2, 2,3 en 2,4).
Opmerking: Tijdens het onderzoek moet Isofluraan worden getitreerd tussen 0. – 1.2 om de hartslag van de muis bij 400 – 440 BPM te houden. In dit bereik zijn afzonderlijke pieken van transtricuspid bloedstroom en weefsel Doppler (DTI) snelheden meetbaar. Om de effecten van het warmteverlies op de hemodynamiek te vermijden, worden de gegevens geregistreerd en wordt de analyse off-line uitgevoerd. Alleen signalen die zijn verkregen bij de eindvervaldatum worden gebruikt voor analyse. Metingen van 3-5 heartbeats worden gemiddeld.
- Verover het platform rechts op 10 ° – 15 ° en dan craniale bij 10 ° – 15 °. Voer de metingen uit zoals beschreven in de vorige secties voor de LeCa-stappen (stappen 2,1, 2,2, 2,3 en 2,4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De apicale vier kamer weergave is moeilijk te verkrijgen bij muizen. Daarom kunnen manipulaties van de platform positie helpen om het hart te visualiseren door zijn positie in de thorax te veranderen. De kanteling van het platform aan de linker-en rechterkant verbeterde het akoestische venster en verstrekte beelden van vergelijkbare kwaliteit in B-modus (Figuur 1). Na het verkrijgen van de juiste posities verstrekte metingen in de PW-, M-en TDI-standen beelden van vergelijkbare kwaliteit (Figuur 2). De meting van de diastolische parameters werd uitgevoerd op Sham-en PAB-bediende muizen (tabel 1). Beide posities (RiCr en LeCa) gaven vergelijkbare resultaten in de diastolische parameters (tabel 2). Bovendien toonden de EchoCG-onderzoeken in beide posities vergelijkbare verschillen aan tussen de Sham-en PAB-groepen (tabel 2, de test van Dunnet). Uit de correlatieanalyse bleek een goede overeenkomst tussen de waarden die zijn verkregen uit deze twee gefaciliteerde posities (Figuur 3). Aangezien kleine groepen dieren voor deze studie werden gebruikt, werden niet-parametrische tests toegepast op9,10. Intra-Observer variabiliteit voor sommige geanalyseerde parameters is eerder gepubliceerd3.
Figuur 1 : Representatieve beelden van de apicale vier kamer weergave. De apicale vier kamer weergave wordt ingeschakeld door het muis fixatie platform naar links en caudally (LeCa) of naar rechts en cranially (RiCr) te kantelen. LA = linker Atrium; LV = linker ventrikel; RA = rechter Atrium; RV = rechter ventrikel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Representatieve afbeeldingen van de TAPSE-, TDI-en transtricuspid-stromings metingen die zijn verkregen uit twee gefaciliteerde apicale weergave posities. TAPSE = tricuspidalisklep annulus vliegtuig systolische excursie; E ' = vroege piek van rechter ventriculaire ontspannings snelheid; A ' = late piek van rechter ventriculaire ontspannings snelheid; S ' = snelheid van de rechter ventriculaire contractie; E = vroege piek van de diastolische tricuspidalisklep instroom; A = late piek van de diastolische tricuspidalisklep inflow. Let op de verandering in de transtricuspid bloedstroom profiel op de inspiratie (INSP). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Correlatieanalyse van gegevens verkregen uit twee gefaciliteerde apicale posities. Correlatieanalyse werd uitgevoerd met behulp van niet-parametrische Spearman's test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: karakterisering van de geëxploiteerde groepen drie weken na de operatie. RVFW = rechter ventriculaire vrije wanddikte; VTI = snelheid-tijdsinterval.
Tabel 2: vergelijking van de resultaten verkregen uit de apicale vier kamer weergave, gefaciliteerd door de linker caudal of rechter craniale platform kantelen. Functionele parameters van de EchoCG-afgeleide RV worden weergegeven. Omdat elke muis in beide standen werd onderzocht, werd de ondertekende rang Wilcoxon-test gebruikt voor vergelijkingen binnen groepen. § p > 0,05 tussen ricr en Leca. De Kruskal-Wallis test, gevolgd door de post hoc test van Dunnet, werd gebruikt voor meervoudige groeps vergelijkingen. De resultaten van twee geselecteerde intergroepvergelijkingen worden in de tabel weergegeven. * p < 0,05, * * p < 0,01. PAB = banding van de longslagader; LeCa = linker caudal kantelen; RiCR = rechter craniale kantelen; E = vroege piek van de diastolische tricuspidalisklep instroom; A = late piek van diastolische tricuspidalisklep inflow; TAPSE = tricuspidalisklep annulus vliegtuig systolische excursie; e ' = vroege piek van rechter ventriculaire ontspannings snelheid; a ' = late piek van rechter ventriculaire ontspannings snelheid; S ' = snelheid van de rechter ventriculaire contractie; HR = hartslag; BPM = beats per minuut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De echo cardiographic RV functie en dimensie beoordeling van parasternal posities zijn goed beschreven. In tegenstelling, de apicale positie in echocardiografie van de muis is deels verwaarloosd vanwege technische problemen. Met behulp van een horizontale perron positie is het moeilijk om een voldoende akoestisch venster te verkrijgen voorbeeld vorming met vier kamer weergave. Om de beeldvorming van deze positie te vergemakkelijken, kan het platform naar links worden gekanteld, een manipulatie die vergelijkbaar is met de links zijdige positionering van patiënten. Dit moet resulteren in een leftward en meer superieure positionering van het hart, waardoor het verbeteren van de akoestische venster. Daarom is LeCa onze gestandaardiseerde positie voor apicale visualisatie. Echter, in ongeveer 30% – 35% van de muizen, de beeldkwaliteit in deze positie kan ontoereikend zijn. Hier kan imaging in de RiCr-positie nuttig zijn.
Vanuit deze posities kunnen transtricuspid-bloedstroom snelheden (E en A) en weefseldoppler-snelheden (E ' en A ') worden gemeten, wat informatie verschaft over de diastolische functie van de RV. We hebben een goede correlatie waargenomen tussen TDI-parameters die zijn verkregen uit de twee posities. Minder bevredigend was de correlatie van E. Over het algemeen was de visualisatie van het transtricuspidale bloedstroom profiel het meest uitdagende deel van het protocol dat hier werd gepresenteerd en vertoonde de hoogste variabiliteit. De meting van TAPSE en S ' door weefsel Doppler voorzag in een schatting van de RV systolische functie. In het licht van de recente bevindingen is de fysiologische betekenis van TAPSE echter niet duidelijk11. We meten niet routinematig het RV breuk gebied van contractie vanuit de apicale positie omdat, in de omstandigheden van druk overbelasting, het laterale gedeelte van de vergrote RV deels wordt bedekt door het borstbeen en niet volledig zichtbaar is vanuit deze positie3. Zo kan de visualisatie van de apicale positie in muizen de meting van de parameters routinematig gebruikt in de kliniek en, daardoor, levert meer informatie, die een completere functionele karakterisering mogelijk maakt.
Stam, spanning rate analyse, en spikkel tracking echocardiografie zijn nieuwe modaliteiten van cardiale echografie12. De hoge gevoeligheid kan cardiale disfunctie in de beginfase13 detecteren en heeft de kracht om sterfte14te voorspellen; Daarom is de toepassing ervan ook gerechtvaardigd in experimentele studies. Helaas, in muizen, de RV vrije muur is deels verborgen achter de schaduw van het borstbeen, die de analyse van de stam zou kunnen belemmeren. Bovendien vereist vlek analyse een goede beeldkwaliteit en visualisatie van de gehele vrije muur.
Het cardiovasculaire systeem reageert snel op veranderingen in de houding door het activeren van baroreflex mechanismen15. Daarom zou kunnen worden verwacht dat de craniale Tilt van het platform reflectoire veranderingen in de gemeten cardiale parameters zou veroorzaken. Sterker nog, zowel de Head-up als de Head-Down Tilt positie veroorzaakte een voorbijgaande verandering in de hartslag en cardiale elektrische as bij muizen16. Terwijl een 90 ° Head-up Tilt een verhoogde hartslag veroorzaakt, veroorzaakte een 90 ° Head-Down Tilt voorbijgaande en statistisch onbelangrijke bradycardie. Wij raden u daarentegen aan om de muis slechts 10 ° – 15 ° in beide richtingen te kantelen. Deze milde veranderingen in de houding hebben geen meetbare hemodynamische perturbances veroorzaakt.
LV diastolische functie bij muizen is een ander onderbestudeerde gebied. Hoewel niet getest in deze studie, het protocol hier gepresenteerd moet kunnen worden gebruikt voor de kwantificering van de LV diastolische functie.
Theoretische en praktische beperkingen van het kleine dier EchoCG zijn in detail elders beschreven8. In dit protocol worden de metingen uitgevoerd met een hartslag van 400 – 440 BPM. Bij dit bereik van de hartslag zijn metingen van de E-en een snelheids pieken, evenals van TDI-indexen haalbaar. Bij hogere hartfrequenties fuseren pieken, waardoor kwantificering onmogelijk is. Aangezien de fysiologische hartslag voor muizen 500 – 600 BPM is, is de hartslag die in dit protocol wordt gebruikt vrij laag. Niettemin lijken de metingen bij dit Hartslagbereik betrouwbaar en maken het onderscheid mogelijk tussen fysiologisch en disfunctioneel fenotype3.
We beschrijven een protocol voor twee posities ter vergemakkelijking van de beoordeling van RV functionele parameters uit vier kamer uitzicht in muizen. De posities zorgen voor vergelijkbare resultaten en kunnen door elkaar worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd gefinancierd door het Ludwig Boltzmann Institute for Lung Vascular Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RMV-707B scan head 30 MHz | Visual Sonics | P/N 11459 | mouse scan head |
| VisualSonics Vevo 770® High-Resolution Imaging System | Visual Sonics | 770-230 | ultrasound machine |
| Veet depilation creme for sensitive skin | Veet | 07768307 | |
| Surgical tape Durapore 3M | 3M Deutschland GmbH | 1538-1 | for fixation |
| Askina Brauncel cellulose swabs | B.Braun | 9051015 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | BT025-0037L | |
| Electrode Gel | GE medical systems information technologies Inc. | 2034731-002 | apply to extremities for countinous ECG and heart rate monitoring |
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories Inc. | 82-04-20 | to reduce heat loss warm up the ultrasound gel before use |
References
- Egemnazarov, B., Crnkovic, S., Nagy, B. M., Olschewski, H., Kwapiszewska, G. Right ventricular fibrosis and dysfunction: Actual concepts and common misconceptions. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 68-69, 507-521 (2018).
- Rain, S., et al. Right ventricular diastolic impairment in patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 128, 1-10 (2013).
- Egemnazarov, B., et al. Pressure overload creates right ventricular diastolic dysfunction in a mouse model: assessment by echocardiography. Journal of the American Society of Echocardiography. 28, 828-843 (2015).
- Crnkovic, S., et al. Functional and molecular factors associated with TAPSE in hypoxic pulmonary hypertension. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 311, 59-73 (2016).
- Shi, L., et al. miR-223-IGF-IR signalling in hypoxia- and load-induced right-ventricular failure: a novel therapeutic approach. Cardiovascular Research. 111, 184-193 (2016).
- de Raaf, M. A., et al. Tyrosine kinase inhibitor BIBF1000 does not hamper right ventricular pressure adaptation in rats. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 311, 604-612 (2016).
- Zhou, Y. Q., et al. Comprehensive transthoracic cardiac imaging in mice using ultrasound biomicroscopy with anatomical confirmation by magnetic resonance imaging. Physiological Genomics. 18, 232-244 (2004).
- Brittain, E., Penner, N. L., West, J., Hemnes, A. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50912 (2013).
- Kitchen, C. M. Nonparametric vs parametric tests of location in biomedical research. American Journal of Ophthalmology. 147, 571-572 (2009).
- Yan, F., Robert, M., Li, Y. Statistical methods and common problems in medical or biomedical science research. International Journal of Physiology, Pathophysiology and Pharmacology. 9, 157-163 (2017).
- Guihaire, J., et al. Non-invasive indices of right ventricular function are markers of ventricular-arterial coupling rather than ventricular contractility: insights from a porcine model of chronic pressure overload. European Heart Journal Cardiovascular Imaging. 14, 1140-1149 (2013).
- Sareen, N., Ananthasubramaniam, K. Strain Imaging: From Physiology to Practical Applications in Daily Practice. Cardiology in Review. 24, 56-69 (2016).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of myocardial strain imaging by echocardiography for the early detection of cardiotoxicity in patients during and after cancer chemotherapy: a systematic review. Journal of the American College of Cardiology. 63, 2751-2768 (2014).
- Sengelov, M., et al. Global Longitudinal Strain Is a Superior Predictor of All-Cause Mortality in Heart Failure With Reduced Ejection Fraction. JACC: Cardiovascular Imaging. 8, 1351-1359 (2015).
- Silvani, A., et al. Physiological Mechanisms Mediating the Coupling between Heart Period and Arterial Pressure in Response to Postural Changes in Humans. Frontiers in Physiology. 8, 163 (2017).
- Mohan, M., Anandh, B., Thombre, D. P., Surange, S. G., Chakrabarty, A. S. Effect of posture on heart rate and cardiac axis of mice. Indian Journal of Physiology and Pharmacology. 31, 211-217 (1987).
