Summary
Införliva ett Otillagade derivat av lysin i antikroppar tillåter platsspecifika, snabb och effektiv sammanlänkningen av tetrazine-bärande molekyler att generera antikropp-drogen konjugat.
Abstract
Antikropp-drogen konjugat (ADCs) används numera i klinisk praxis är blandningar av antikropp molekyler länkade till varierande antal gifter på olika positioner. Prekliniska studier har visat att det terapeutiska indexet av dessa traditionella ADCs kan förbättras genom platsspecifika sammanlänkningen av toxiner. Nuvarande metoder att producera homogen ADCs har dock flera begränsningar, såsom låg proteinuttryck och långsam reaktionskinetik. I detta protokoll beskriver vi hur du ställer in ett uttryck systemet att införliva ett Otillagade derivat av lysin (CypK) i antikroppar med hjälp av genetiska koden expansion. Denna minimala bioorthogonal möjliggör snabb Konjugation av tetrazine derivat genom en invers-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen. Uttryck systemet här rapporterade möjliggör lättköpt produktion och rening av trastuzumab med CypK i var och en av de tunga kedjorna. Vi förklarar hur du länka antikroppen till den toxin monometylfumarat auristatin E och karaktärisera immunoconjugate av hydrofob interaktion kromatografi och masspektrometri. Slutligen beskriver vi analyser att bedöma stabiliteten i humant serum av dihydropyridazine kopplingen följd konjugationen och testa selektiv cytotoxiciteten hos ADC för bröstcancerceller med höga nivåer av HER2-receptorn.
Introduction
Antikropp-drogen konjugat (ADCs) kombinera biotherapeutics selektivitet och styrkan av cytotoxiska småmolekyler. De flesta ADCs syftar till att minska biverkningarna av traditionell kemoterapi med inriktning på läkemedel som påverkar DNA eller mikrotubulära polymerisation till cancer celler1. Första generationens ADCs godkänts av Food and Drug Administration (FDA) förlitar sig på modifiering av lysines och cysteines, som genererar blandningar av molekyler modified på olika positioner med minskade farmakokinetiska egenskaper2. Däremot kan platsspecifika Konjugation av droger att antikropparna generera föreningar med förbättrade terapeutiska eleverade3,4. Att försöka ta itu med utmaningen att producera homogen ADCs, har flera selektiv kemiska och enzymatiska modifieringar varit rapporterade1,5. Nuvarande metoder kan dock rikta endast viss position på antikroppen, lider av låg proteinuttryck, ge linkers låg stabilitet eller förlita sig på långsamt och lågavkastande reaktioner.
Införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAA) genom genetisk kod expansion möjliggör platsspecifik installation av en uppsjö av bioorthogonal reaktiva grupper till proteiner, potentiellt övervinna begränsningarna av andra metoder som används för att generera ADCs. Kodning ncAAs svar på en target (stopp)-kodon beroende av aminoacyl-tRNA Synthetasen/tRNA-par som är ortogonal till endogena paren som införlivar kanoniska aminosyror6. Flera ncAAs har införlivats i antikroppar att generera ADCs. Men mest lider av olika skulder för applikationer i terapeutisk konjugation. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 är inte helt bioorthogonal, kräver lågt pH (4.5) och lång reaktionstid (> 60 h), medan azider såsom p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11och ett natriumazid derivat av lysin (AzK)12,13 kan minskas i cell14, och den koppar som används för att katalysera Huisgen cykloadditioner kan inducera oxidativ skada 15.
Även om alternativa ncAAs baserat på trans-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) och etylbicyklo [6.1.0] nonene (BCN) har nyligen kodats i en antikropp för bio-imaging ändamål, uttryck systemet lider av mycket låg avkastning (0,5 mg/L)16. Dessutom cyclooctenes och cyclooctynes är stora och hydrofoba handtag som kan öka känsligheten för ADC för aggregering -ADC nyttolaster är traditionellt hydrofoba och fysikalisk-kemiska egenskaperna för länkaren har visat sig kraftigt påverka farmakokinetiken och terapeutiskt index17. 1,3-disubstitued cyclopropenes är däremot små reaktiva grupper som borde orsaka minimal förändring i det protein struktur och physichochemical egenskaper18. Cyclopropenes reagera selektivt och snabbt med tetrazines via en omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen19. I detta protokoll vi göra använda av ett derivat av lysin (CypK, figur 1b) uthärda en metyl-Otillagade som är mindre påverkade av sterisk hinder än större ansträngda omättade cykler och har en reaktion hastighet konstant i storleksordningen 1-30 M-1s -1 i vattenmedium18,20.
Vi rapporterade nyligen hur att införliva CypK i antikroppar att generera ADCs genom att reagera denna minimala bioorthogonal handtag med tetrazine-bärande molekyler21. Här beskriver vi ADC förberedelser proceduren mer i detalj med tonvikt på de mest utmanande steg. Införlivandet av CypK riktas med hjälp av en pyrrolysyl-tRNA Synthetasen (PylRS) / tRNACUA(PylT) par som svar på en bärnstensfärgad kodon infördes i den tunga kedjan antikropp (HC)22. Här använder vi två plasmider för övergående transfection (figur 1a), en kodning den tunga kedjan av antikropp och den andra en kodning av lätt kedja (LC), båda innehållande PylRS/PylT kassett. Alternativt kan en stabil cellinje som möjliggör högre antikropp avkastning genereras genom en mer arbetskrävande förfarandet21.
De ovan nämnda uttryck system kan producera den terapeutiska anti-HER2 immunglobulin 1 (IgG1) trastuzumab med CypK på liknande nivåer till vildtyp antikroppen. Vi valde den första positionen CH1 domännamnet på den tunga kedjan att koda ncAA (HC-118TAG). Detta är den vanligaste modifierade platsen i ADCs23 och är känd som HC-118 (EU numrering) men har också kallats HC-121 (sekvens position) och HC-114 (Kabat numrering)24. Eftersom denna ståndpunkt är bevarad i hela alla IgG1s, bör dessa uttryck system bli föremål för mest terapeutiska antikroppar.
Vi visar trastuzumab(CypK)2 kan enkelt renas genom protein A följt av snabb protein vätskekromatografi med en hydrofob interaktion kolumn (FPLC-HIC). Därefter kopplas kovalent antikroppen inom 3 h att det mikrotubulära polymerisation hämmare monometylfumarat auristatin E (MMAE), som används i den FDA-godkända ADC Adcetris. Här använder vi ett bensyl-tetrazine derivat av MMAE (tetrazine-vcMMAE) med en länkare bestående av distanshylsa glutarat och beståndsdel valin-citrullin proteas-labila följt av en p- aminobenzylalcohol self-immolative enhet; Detta linker är klyvs av Cathepsin B i lysosomen vid internalisering av ADC resulterar i traceless frisläppandet av toxin25. För att visa den stora räckvidden av reaktionen, är antikroppen också kopplad till den fluorophore tetrametylrodamin (TAMRA). Vi förklarar hur att verifiera identiteten för konjugatet genom vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (LC-MS) och beräkna förhållandet drog-till-antikropp (DAR) med högupplösande vätskekromatografi med en hydrofob interaktion kolumn (HPLC-HIC) .
Som en del av karakterisering av antikropp prestanda beskriver vi testa stabiliteten av dihydropyridazine kopplingen i humant serum. Denna parameter bedöms lättare i trastuzumab-TAMRA eftersom det kan kvantifieras med en enkel ELISA och tolkningen av resultaten försvåras inte av komponenten proteas labila trastuzumab(MMAE)2. Slutligen bedöms den selektivitet och styrkan av trastuzumab(MMAE)2 genom att jämföra cytotoxicitet av ADC över cellinjer som uttrycker olika nivåer av HER2. Denna analys ger också en funktionell bevis på ADC stabilitet när de utförs efter inkubation i immunoconjugate i humant serum.
Protocol
1. ta fram och karakterisera antikroppen
- Express antikroppen
- Tina en injektionsflaska med HEK suspension celler i en 250 mL rundkolv innehållande 50 mL uttryck medium kompletteras med 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 250 ng/mL amfotericin B. hålla cellerna vid 37 ° C med 8% CO2 i tilluften inkubatorer utrustade med en shaker vid 125 rpm. Dela celler till 0,3-0,5 x 106 celler/mL (varje 2-3 dagar) minst 2 gånger innan transfecting.
- När en densitet på 2,5 x 106 celler/mL är nådd (2-3 dagar efter uppdelning), Bered en fräsch 100 mm CypK. För detta ändamål, väger 64 mg CypK, tillsätt 2,5 mL av 0,1 natriumhydroxid, vortex, spin ner till återvinna alla oupplösta partiklar och Sonikera.
- Tillsätt 2,5 mL CypK (100 mM i 0,1 M NaOH) till 42,5 mL uttryck medium kompletteras med antibiotika. Blanda väl, tillsätt 250 µL 0,1 M HCl och sterilisera med 0,22 µm filter.
- Späd 50 µg HC och LC pKym1 plasmider21 till 2,5 mL med reducerad serum medium. I en separat slang, späd 135 µL transfection reagens till 2,5 mL med reducerad serum medium.
- Fem minuter efter att förbereda lösningarna, blanda plasmidsna och transfection reagenslösningen och inkubera i 20 min till tillåta bildandet av komplex mellan DNA och transfection reagensen.
- Under tiden Centrifugera 125 miljoner celler på target densiteten för 5 min vid 500 x g, Omsuspendera med uttrycket mediet som innehåller CypK och lägga till DNA – transfection reagens blandningen. CypK kan köpas eller syntetiseras som rapporterats tidigare18.
- Efter inkubation celler för 20 h, tillsätt 250 µL av transfection reagens förstärkare ingår i satsen.
- Skörda antikroppar från supernatant 6-7 dagar efter tillsats av CypK (ingen förändring av medium krävs under uttryck).
* Alternativt, för att få högre och jämnare avkastning, en stabil cell-linjen kan genereras som beskrivs i Oller-Salvia o.a. 201821. I det här fallet uttrycks trastuzumab(CypK)2 genom tillsats av CypK 5 mM uttryck medium.
- Rena antikroppen
- Centrifugera cellerna för 15 min vid 3000 x g.
- Filtrera supernatanten med en 0,45 eller ett 0,22 µm filter. Om filtret blir ockluderas, ersätta det för en ny och fortsätta filtrera. Om detta händer efter endast några milliliter, Centrifugera supernatanten för en ytterligare 15 min på 7000 x g.
- Tillsätt protein A harts (2 mL/100 mL av supernatanten) i en tom polypropylen kromatografi kolumn och låt jämvikta kådan med minst 5 volymdelar pärla tvättbuffert (0,1 M natriumfosfat, 150 mM NaCl).
- Dela supernatanten i två 50 mL koniska rör och lägga till 5 x pärla tvättbuffert (0,5 M natriumfosfat, 150 mM NaCl) följt av pre skakad protein A harts. Placera koniska röret på en roller för 3 h i rumstemperatur att dra ner antikroppen i supernatanten.
Alternativt: Lägg supernatanten på kolonnen med minst dubbla den rekommenderade volymen av harts och tillåta för att flöda genom. Kontrollera att det inte finns en betydande mängd antikroppar kvar i supernatanten med SDS-PAGE. Om det finns, eluera supernatanten genom kådan återigen. - Överför protein A harts med supernatanten till en kolumn och låt vätskan rinna genom.
- Tillsätt 25 mL wash buffer (eller minst 10 harts volymer) och tillåta för att flöda genom.
- Eluera antikroppen med 4 mL 0,1 M natriumcitrat, pH 3, på 1 mL 1 M fosfatbuffert, 150 mM NaCl.
- Späd antikroppen med 10 mL PBS, koncentrera sig till 0,5-1 mL av centrifugal filtrering och exchange buffert tre gånger med PBS.
- Rena proverna med FPLC med en butyl HIC kolumn med ett flöde av 0,5 mL/min och en 0-100% lutning i 30 min på låg salthalt buffert (50 mM natriumfosfat pH 7.0, 20% isopropanol) i hög-salt buffert (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natriumfosfat pH 7,0 5% isopropanol). Samla alla fraktioner och övervaka elueringen vid 280 nm. Små mängder (< 1 mg) kan renas med HPLC-HIC enligt villkoren i 2.4 att maximera avkastningen och renhet.
- Poolen de fraktioner som innehåller antikroppar, späda ut dem till minst 4 mL med PBS, koncentrera dem av centrifugal filtrering och exchange buffert tre gånger med PBS.
- Kvantifiera antikroppen
- Få en ungefärlig koncentration genom att mäta absorbansen vid 280 nm med en spektrofotometer som mikro-volym.
- Om en exakt mätning krävs, Använd en ELISA-kit för att mäta mänskliga IgG. För en grov uppskattning, använda SDS-PAGE med en Coomassie-baserade fläck som följer:
- Förbereda standarder genom att späda ut sex gånger två gånger en trastuzumab standard kvantifieras av ELISA vid 1 mg/mL.
- Koka upp normerna och proverna cirka 0,25 mg/ml minska lastning buffert.
- Kör dem i ett 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE använder MES-SDS buffert och fläcken med ett Coomassie-baserade färgämne. Slutligen mäter färgdensitet bandet motsvarar ljuset eller den tunga kedjan använder ImageJ och interpolera signalen från proverna i standardkurvan.
- Lagra antikroppen vid 4 ° C.
2. konjugat antikroppen och karakterisera ADC
- Konjugat Antikroppen med tetrazine-bärande molekylen
- Späd 10 molar motsvarigheter till tetrazine-vcMMAE (4 µL, 3,4 mM i dimetyl sulfoxid (DMSO)) med 20 µL av acetonitril och 76 µL av PBS i en liten konisk slang (t.ex.PCR-röret).
- Lägg till 1 molar motsvarande trastuzumab(CypK)2 (100 µL, 2 mg/mL i PBS), blanda och tillåta för att reagera för 3 h i rumstemperatur (25 ° C) att bilda trastuzumab(MMAE)2.
Obs: Andra molekyler såsom tetrazine-5-TAMRA kan kopplas till antikroppen i stället för tetrazine-vcMMAE använder detta protokoll.
- Rena ADC
- Pre jämvikta en storlek utslagning spin kolumn med PBS följa tillverkarens instruktioner.
- Tillsätt hela volym av reaktionen på spin kolumn och centrifugera vid 1500 x g i 1 min.
- Kvantifiera ADC och analysera konjugatet av SDS-PAGE
- Kvantifiera ADC som beskrivs i 1.3.2. genom att mäta färg tätheten av lätta kedjan på en SDS-PAGE med den icke-modifierade antikroppen för standardkurvan.
- Den tunga kedjan bör har skiftat något visar en ökning i molekylvikt vid konjugationen.
Obs: Om antikroppen är modifierad med en fluorophore såsom i trastuzumab(TAMRA)2, endast bandet motsvarar den tunga kedjan ska visa i-gel fluorescens före färgning.
- Analysera konjugatet av HPLC-HIC
- Temperera HPLC-HIC kolonnen med 100% buffert A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natriumfosfat pH 7,0, 5% isopropanol) för 5 min.
- Mix 15 µL (67 pmol) av en 1 mg/mL trastuzumab (CypK) 2 med 2 x 15 µL buffert i en injektionsflaska. Sedan programmera en 10 µL injektion i HPLC.
- Eluera i en Isokratisk 1 mL/min flöde med 100% buffert A för 1 min följt av 15 min toning från 100 till 0% av buffert A i B (50 mM natriumfosfat pH 7.0, 20% isopropanol). Övervaka elueringen vid 280 nm.
- Beräkna DAR genom att integrera den topp som motsvarar varje art och använda de resulterande områdena i följande ekvation:
DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Förväntade retentionstiden för trastuzumab(CypK)2 är 7,5-8,0 min, för trastuzumab (CypK, MMAE) är 9,1-9,6 min, och för trastuzumab(MMAE)2 är 10,5-11,0 min.
- Analysera konjugatet av LC-MS
- Deglycosylate 30 µL av 1 mg/mL ADC och omodifierad antikroppen i icke-reducerande förhållanden med 250 PNGase F enheter för minst 6 h vid 37 ° C.
- Eluera antikroppen i massa spektrometern i en C4 1-5 µm 1.0 x 100 mm kolumn med en 20 min lutning 2% till 80% acetonitril i vatten. Förvärva data över en m/z 350-4000 i positiv Jon läge med en kon spänning på 150v.
- Deconvolute raw-data med hjälp av lämplig programvara. Beräkna skillnaden i massa mellan den modifierade och omodifierad antikropparna.
3. analysens stabilitet av Dihydropyridazine kopplingen i Trastuzumab(TAMRA)2 i Serum
- Filtrera serum med 0,22 μm filter under sterila förhållanden. Du kan lägga till 100 enheter/mL penicillin, och 100 μg/mL streptomycin.
- Fyll de externa brunnarna i en plattan med 96 brunnar med vatten. I centrala brunnar, blanda i tre exemplar 90 µL av filtrerade serum med 10 µL av 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 i PBS med en slutlig koncentration på 0,1 mg/mL. Placera plattan i en inkubator mättad med fuktighet vid 37 ° C och 4-5% CO2.
- Varje 24 h i hela 5 dagar, Pipettera varje väl grundligt blanda, ta en 5 µL alikvotens, flash-frysning med flytande kväve, och lagra vid-80 ° C.
- När alla prover som har samlats in, Tina alikvoter och analysera med hjälp av en indirekt ELISA som tidigare rapporterade12 med några ändringar:
- Coat en plattan med 96 brunnar över natten med 0,25 µg/mL HER2 vid 4 ° C. Alla andra steg utförs i rumstemperatur.
- Följande dag, tvätta 5 gånger med PBS 0,05% tween (PBS-T) och blockera med 1% bovint serumalbumin för 1 h.
- Tvätta och inkubera proverna på 1:10000 utspädning i PBS för 2 h.
- Tvätta och inkubera en anti-TAMRA antikropp upp i musen på 1: 2000 spädning i PBS-T med 0,5% BSA för 1 h.
- Tvätta och inkubera en antimus HRP konjugatet 1: 1000 i PBS-T med 0,5% BSA för 1 h.
- Tillsätt TMB och reagerar 5-10 min.
- Stoppa reaktion med 50 µL H2så4 1 M och Mät absorbansen vid 450 nm. Subtrahera bakgrunden mäts vid 570 nm.
- Passar en 4-parameter logistic regression kurva till standard utspädningar och interpolera mätningar från prover.
Obs: Stabiliteten i trastuzumab(MMAE)2 kunde bedömas med hjälp av samma protokoll genom att ändra den analysmetod som beskrivs i 3.3 för en kommersiell ELISA-kit för att mäta koncentrationen av ADC.
4. utvärdera cytotoxiciteten hos ADC
Obs: Detta protokoll baseras på tidigare rapporterade analyser23,26 med vissa ändringar.
- Tina SK-BR-3 och MCF-7 celler och tillåta dem att bosätta sig i p25 kolvar som innehåller komplett medium, dvs DMEM kompletteras med 10% värme inaktiverat fetalt bovint serum, 100 enheter/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin.
- Dela celler på 80-90% confluence (varje 3-4 dagar) minst 2 gånger innan analysen.
- Två dagar före analysen, fyll de yttre brunnarna i en plattan med 96 brunnar med vatten. Sedan hiss celler med 0,05% trypsin i 0,5 mM EDTA, centrifug 3 min på 250 x g, Återsuspendera i nytt medium och utsäde 3000 celler i 100 µL per (tom) brunn i 96 brunnar tallrikar.
- Två dagar efter sådd cellerna, förbereda 10 seriespädningar av alla prover i tre exemplar med 0,1% DMSO i komplett medium. Överväga följande prover och kontroller: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab vildtyp, tetrazine-vcMMAE och MMAE.
- Tillsätt 100 µL av varje prov i varje brunn och inkubera i 5 dagar vid 37 ° C och 4-5% CO2.
- Dag 5, mäta cellviabilitet. I detta syfte använda en kommersiell kit lysera celler och mäta den ATP som släppt. Rita procentandelen av signal med avseende på kontroll celler behandlas med 0,1% DMSO.
Obs: ADCs kan inkuberas i 5 dagar i serum och analyseras för cytotoxicitet att bevisa funktionell stabilitet.
Varning: MMAE är mycket giftiga. Därför Använd handskar och skyddsglasögon vid hantering av MMAE derivat. Om du använder omodifierade MMAE som kontroll i experimentet, när du förbereder stamlösning i DMSO, hantera fast produkten inuti ett dragskåp.
Representative Results
Rapporterade övergående uttryck systemet (figur 1a) ger 22 ± 2 mg av trastuzumab(CypK)2 per liter odlingsmedium, vilket motsvarar 2/3 av vildtyp antikropp producerad under samma förhållanden (figur 1 c). Den stabila cellinje kan öka denna avkastning upp till 31 ± 2 mg/L21.
Trastuzumab(CypK)2 kan vara konjugerat med tetrazine-vcMMAE, som ger quasi homogena trastuzumab(MMAE)2 inom 3 h vid 25 ° C (figur 2). Den höga vattenavvisande egenskaper av detta cellgift kräver tillsats av 10% acetonitril när 5 eller fler molar medel av toxin per CypK används. Alternativt, cykloadditionen är också avslutat inom 20 h använda 2 motsvarighet till tetrazine-vcMMAE utan acetonitril (figur 2 c). Trastuzumab(CypK)2 reagerar med tetrazine-TAMRA inom 2 h vid 25 ° C och 3-6 h krävs när temperaturen är minskade till 4 ° C (figur 3 c).
Den beräknade DAR för trastuzumab(MMAE)2 mäts av HPLC-HIC är 1,9 (figur 2b). Topp först observerades i kromatogrammet 8,0 min representerar okonjugerat antikroppen (DAR 0) och bör har helt försvunnit när reaktionen är klar. Arter med DAR 1 eluerar vid 9,1-9,6 min och bör ha en area < 10% efter 3 h; och produktens mål med DAR 2 har en retentionstid på 10,5-11,0 med beräknade området > 90%. Den rörlighet Skift och fluorescens i SDS-PAGE geler bekräftar införlivandet av TAMRA (figur 3b) och immunoconjugates identitet verifieras av LC-MS (bild 2d-e och figur 3d).
Inkubering av trastuzumab(TAMRA)2 under 5 dagar i humanserum och efterföljande analys av ELISA bekräftar att nyttolasten förblir knutna till antikroppen (figur 4b). Om cytotoxicitet analysen, trastuzumab(MMAE)2 visar hög potens i SK-BR-3 (HER2 hög) bröst cancerceller, med en halv maximal effektiv koncentration (EG50) 55 ± 10 pM (figur 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 underhåller cytotoxiciteten efter 5 dagars inkubation i humant serum (figur 4 c). Omvänt, när ADC har analyserats på MCF-7 (HER2 låg) den EG50 är 200-fold lägre (figur 4 d). Vildtyp antikropp, trastuzumab(CypK)2 och tetrazine-vcMMAE visar extremt låg toxicitet (figurerna 4 d och 4e), medan MMAE visar hög icke-selektiva cytotoxicitet i både cellinjer (figur 4e).
Figur 1: övergående uttryck systemet. A. berörda regionerna av plasmidsna används för övergående transfection i HEK293 celler. CMV: cytomegalovirus promotorn, WPRE: murmeldjur hepatit Virus från föreskrivande Element, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: specifika promotorn, PylRS: pyrrolysil tRNA Synthetasen, > och <: riktning av transkription. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. uttryck ger av vildtyp (WT) trastuzumab och trastuzumab(CypK)2 mätt i en western blot efter protein en rening. Felstaplar representera standardavvikelsen för biologiska exemplar. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Oller-Salvia o.a. 201821. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Konjugation av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE. A. inversen elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen mellan CypK återstoden i antikroppen och tetrazine derivatan av MMAE. De reagerande grupperna är markerade i rött, p- aminobenzylalcohol avbildas i grönt och den valin-citrullin dipeptiden i blått. B. HPLC-HIC kromatogram visar förloppet för konjugationen av antikropp. C. graden av omvandling med avseende på den maximala DAR 1,9 använder olika reagens koncentrationer. D-E. Deconvoluted masspektra fullängds antikroppens före och efter konjugationen. Trastuzumab(CypK)2 erhölls med hjälp av den stabila cellinje. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Oller-Salvia o.a. 201821. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Konjugation av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-TAMRA. A. inversen elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen mellan CypK återstoden i antikroppen och tetrazine derivatan av TAMRA. B. SDS-PAGE geler visar det rörlighet skiftet och i-gel fluorescensen härrör från konjugationen av TAMRA. C. konjugation kinetik vid två olika temperaturer. D. Deconvoluted masspektrum av trastuzumab(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 erhölls med hjälp av den stabila cellinje. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Oller-Salvia o.a. 201821. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: stabilitet i serum och cytotoxicitet av trastuzumab konjugat. A. tecknad belyser de funktioner som önskas i en internalizing ADC. B. stabilitet för trastuzumab(TAMRA)2 i humant serum mätt i ELISA. C. Cell lönsamhet analysen med trastuzumab(MMAE)2 efter 5 dagar i humant serum (+ serum, svart). Ett kontrollprov inkuberas i PBS istället för serum (-serum, röd) ingick i samma analys. D. Cell lönsamhet analysen med nymalen utspädda antikropp prover. E. Cell lönsamhet analysen med nymalen utspädda MMAE derivat. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet av 3 oberoende experiment. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Oller-Salvia o.a. 201821. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Övergående uttryck förfarandet att producera trastuzumab(CypK)2 beskrivs i detta protokoll är enkel och möjliggör hög modularitet. Den avkastning som erhålls är inom de som förväntat i en akademisk miljö27 och stabil cellinjer kan skapas för att ytterligare öka produktionen avkastning21. Under uttryck lägre koncentrationer av CypK än 5 mM kan resultera i lägre ncAA införlivandet, och högre belopp kan påverka cellernas tillväxt och minska antikropp avkastning. CypK som en fri aminosyra har låg vattenlöslighet, således det bör först upplöst på 100 mM i 0,1 M NaOH och sedan läggs till odlingsmediet. Efter utspädning CypK på medellång och innan den läggs till celler, är det viktigt att neutralisera mediet med HCl och filter för att sterilisera. Därefter med transfection reagens anges i detta protokoll och följa de inkubationstider som rekommenderas av tillverkaren är viktigt för ett högavkastande uttryck. För ytterligare information om övergående uttryck av humana antikroppar hänvisas till andra publicerade protokoll31,32.
När antikroppen har renats, krävs en hög överskott av protein A harts för förmånerna som anges för att säkerställa fullständig antikropp dra ner från supernatanten. För att förhindra utfällning av trastuzumab under eluering, är det rekommendabelt att använda en lösning med hög buffert kapacitet, utspädd omedelbart med PBS och utbyta bufferten att undvika överdriven koncentration. Alltid hålla antikroppen < 5 mg/mL.
Konjugationen av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE är snabbare än de flesta reaktioner rapporterats med andra bioorthogonal handtag för ADCs. Dessutom denna cycladdition sker under mycket milda förhållanden: rumstemperatur eller lägre och fysiologiska pH. Det är viktigt att späda DMSO lager lösningar av reaktanterna med acetonitril före tillsats av PBS och antikroppen; annars kommer tetrazine derivat fällningen. Acetonitril krävs endast på grund av den höga vattenavvisande egenskaper av MMAE och TAMRA, men mindre hydrofoba molekyler kan inte behöva tillägg av co lösningsmedel. Alternativt, tetrazine-vcMMAE kan vara konjugerade utan acetonitril och endast 2 molar likvida medel tetrazine-vcMMAE inom 20 h. Denna lilla mängd toxin kan innebära en avsevärd minskning av tillverkningskostnaden för ADC jämfört med nuvarande ncAA-baserad teknik. Trastuzumab(CypK)2 är fullt reaktivt för minst 4 månader när bevaras vid 4 ° C.
HPLC-HIC möjliggör en noggrann bestämning av DAR eftersom MMAE är starkt hydrofoba och ger en utmärkt upplösning av de toppar som motsvarar antikroppen konjugat med 0, 1 och 2 gifter. Oreagerad tetrazine-vcMMAE eluerar runt 13,7 min och detekteras vid 280 nm. Denna teknik kräver utgångsmaterial med hög renhet. Det är dessutom inte rekommendabelt att släcka reaktion med andra tetrazine-reaktiva molekyler såsom BCN-OH eftersom de kan förändra retentionstiderna och formen på topparna. Det är viktigt att Saltkoncentrationen av proverna motsvarar det som i den mobila fasen i början av övertoningen för att erhålla en bra separation, speciellt om mer än 10-20 µL injiceras.
Angående den LC-MS-analysen krävs deglycosylation antikropp prover att få en enkel topp vid deconvolution raw spektrum. Riktigheten av de totala antikropp och ADC massorna kan variera beroende på kalibreringsmönstret av instrumentet. Därför, för att beräkna massan för modifiering, subtrahera massan erhålls för omodifierade antikropparna från en erhålls för ADC. Moderna högupplösta masspektrometrar bör ge ett relativt fel nedanför 1:10000. Även om LC-MS kan också användas för att beräkna förhållandet mellan olika arter, är detta värde vanligtvis en överskattning eftersom ändringen kan påverka jonisering kapaciteten av de arter som genereras och låga mängder föroreningar identifieras inte.
Stabiliteten i länkaren i ADCs är kritisk eftersom förtida frisläppandet av drogen resulterar i högre toxicitet och lägre effektivitet. den gratis cellgift skadar friska vävnader och nakna antikroppen konkurrerar med den väpnade för målet bindande platser på sjuka celler. En release under 5%, vilket är inom variabilityen av stabilitet analysen, bör förväntas.
Slutligen en ADC inriktning HER2 som trastuzumab(MMAE)2 kan bedömas genom att jämföra cytotoxiciteten i SK-BR-3 celler (HER2 hög) och MCF-7 celler (HER2 låg) sedan den senare uttrycker 15-fold mindre HER2-receptorer än tidigare28 selektivitet . Immunoconjugate förväntas resultera i en cellviabilitet minst 2 tiopotenser lägre i SK-BR-3 jämfört med MCF-7. De EG50 i SK-BR-3 bör vara i intervallet tvåsiffriga nanomolar återspeglar den höga potensen av denna ADC29,30. Omodifierade antikroppen, antingen trastuzumab(MMAE)2 eller trastuzumab, bör Visa ingen toxicitet i denna analys. Tetrazine-vcMMAE bör ha en effekt 3 tiopotenser lägre än ADC eftersom länkaren tar bort aktiviteten av peptidomimetic toxin. Eftersom MMAE ska kunna genomsyra de cellmembran30, bör det omvänt, har en liknande toxicitet för ADC men Visa någon diskriminering mellan HER2 hög och HER2 låg cellinjer. Dessutom om denna analys utförs efter en 5-dagars inkubation av ADC i serum, det kan användas för att ge en funktionell bevis på stabiliteten i länkaren: en release av toxinet skulle resultera i antingen en minskning av ADC effektivitet i SK-BR-3 om MMAE släpptes med p konsten att länkaren eller en minskning av selektivitet om länkaren var klyvs i ett traceless mode.
ADC tekniken beskrivs häri gör effektiv och platsspecifika införlivandet av ett Otillagade derivat av lysin i IgG1s. Efter en lättköpt rening, kan vara snabbt konjugerade antikroppar med tetrazine-innehållande molekyler, framställning av homogena produkter. På grund av liten storlek och höga reaktivitet av Otillagade minimal handtag, bör denna metod möjliggöra konjugationen av produkter hindras nyttolaster. De resulterande immunoconjugates är stabila i serum och är mycket potent och selektiv. Sammantaget möjliggör CypK en snabb och stabil och platsspecifika bioorthogonal koppling för antikroppar och andra protein konjugat som ska användas i behandling eller diagnos.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av medicinska forskningsrådet, UK. B.O.-S. rymmer ett EMBO stipendium (ATLF 158-2016) och är tacksam att H. Pelham och J.W. hakan för stöd, och G. Kym, C. W. Morgan och O. Perisic för hjälp och råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
| Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
| 125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
| Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
| Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
| Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
| Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
| Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
| Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
| ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
| HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
| Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
| Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
| Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | - | Costum synthesized |
| Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
| UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
| Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
| PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
| NanoAcquity | Waters | ||
| C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
| 96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
| Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
| CO2 incubator | Panasonic | ||
| HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
| Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
| Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| TMB | BioLengend | 421101 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
| PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
| SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
| Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
| Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
| MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
| Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
| Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
| Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |
References
- Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen. Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).
- Hamblett, K. J., et al. Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate. Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy. Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).
- Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code. Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Tian, F., et al. A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).
- Kern, J. C., et al. Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates. Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- VanBrunt, M. P., et al. Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).
- Xiao, H., et al. Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells. Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).
- Milles, S., et al. Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence. Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).
- Koehler, C., et al. Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering. Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).
- Lyon, R. P., et al. Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).
- Elliott, T. S., et al. Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal. Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).
- Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems. Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).
- Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).
- Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction. Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).
- Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
- Junutula, J. R., et al. Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Junutula, J. R., et al. Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs. Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).
- Doronina, S. O., et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).
- Shiraishi, Y., et al. Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).
- Sabourin, M., et al. Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM). CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102 (2011).
- Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer. Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).
- Shinmi, D., et al. One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies. Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).
- Badescu, G., et al. Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).
- Vazquez-Lombardi, R., et al. Transient expression of human antibodies in mammalian cells. Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).
- Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).
