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Genetics

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

Abstract

Ad oggi, diversi tipi di cellule staminali a diversi stadi di sviluppo sono nel fuoco per il trattamento di malattie degenerative. Ancora, alcuni aspetti, ad esempio iniziale massiccia delle cellule morte e bassi effetti terapeutici, alterato la loro ampia traduzione clinica. Ingegneria genetica delle cellule staminali prima del trapianto è emerso come un metodo promettente per ottimizzare gli effetti terapeutici delle cellule staminali. Tuttavia, mancano ancora sistemi di consegna del gene sicuro ed efficiente. Pertanto, lo sviluppo di metodi adatti può fornire un approccio per risolvere le sfide attuali in terapie basate sulle cellule staminali.

Il presente protocollo descrive l'estrazione e caratterizzazione di cellule staminali umane follicolo dentale (hDFSCs) così come loro modificazione genetica non-virali. Il follicolo dentale postnatale ha presentato come una fonte promettente e facilmente accessibile per la raccolta di cellule staminali adulte multipotenti che possiede potenziale elevata proliferazione. La procedura di isolamento descritto presenta un metodo semplice e affidabile per la raccolta hDFSCs da denti del giudizio. Anche questo protocollo comprende i metodi per definire le caratteristiche di cellule staminali di cellule isolate. Per l'ingegneria genetica di hDFSCs, una strategia di trasfezione basata sui lipidi cationici ottimizzato è presentata abilitazione microRNA altamente efficiente introduzione senza causare effetti citotossici. I microRNA sono candidati adatti per la manipolazione di transitoria delle cellule, come questi piccoli regolatori traduzionali controllano il destino e il comportamento delle cellule staminali senza il pericolo di integrazione del genoma stabile. Così, questo protocollo rappresenta una procedura sicura ed efficiente per l'ingegneria di hDFSCs che potrebbe diventare importante per ottimizzare la loro efficacia terapeutica.

Introduction

Il follicolo dentale umano è un derivato ectomesenchymally tessuto connettivo che circonda il dente in via di sviluppo1,2. Al lato della sua funzione di coordinamento osteoclastogenesi e osteogenesi per il processo di eruzione dei denti, questo tessuto nutre le cellule staminali e progenitrici soprattutto per lo sviluppo del parodonto3,4,5. Di conseguenza, il follicolo dentale è considerato come una fonte alternativa per la raccolta di cellule staminali adulte umane6,7.

Diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali del follicolo dentale umano (hDFSCs) sono in grado di differenziarsi in lignaggio parodontale tra cui osteoblasti, fibroblasti del legamento e cementoblasti8,9,10 . Inoltre, queste cellule sono state indicate per abbinare tutte le caratteristiche delle cellule stromali mesenchimali (MSCs) tra cui capacità di auto-propagarsi, plastica aderenza, espressione di marcatori di superficie specifici (ad esempio, CD73, CD90, CD105) anche come osteogenica, adipogenico e condrogenica differenziazione potenziali11,12,13. Altri studi hanno anche rivelato un potenziale di differenziazione neurale di hDFSCs2,14,15,16,17,18.

A causa di loro proprietà promettente e un facile accesso, hDFSCs è diventato recentemente relativo per tessuto ingegneria19,20,21. I primi studi concentrano sulle potenzialità del DFSCs per rigenerare osso, parodontale e19,22,23,24,25,26, radici di dente 27,28,29,30. Poiché la conoscenza delle capacità neurogena di hDFSCs, loro applicazione come trattamento potenziale per le malattie neurodegenerative è stato indagato31,32,33. HDFSCs hanno anche acquisito importanza rispetto alla la rigenerazione di altri tessuti (ad es., epitelio corneale)34,35. Il potenziale terapeutico di hDFSC non si basa solo sul loro potenziale di differenziazione diretto, ma anche sulla loro attività paracrina. Recentemente, hDFSCs sono stati indicati a secernere una ricchezza di fattori bioattivi, come metalloproteinasi della matrice (MMPs), fattore di crescita insulino-simile (IGF), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF) e crescita dell'epatocita Factor (HGF), che svolgono un ruolo cruciale per l'angiogenesi, immunomodulazione, rimodellamento della matrice extracellulare e processi riparativi36.

Tuttavia, ampio traduzione clinica della terapia con cellule staminali è ancora compromessa da diverse sfide, come la morte iniziale massiccia delle cellule e cellule staminali benefico basso effetti37,38. Ingegneria genetica fornisce una strategia promettente per affrontare queste sfide e di conseguenza può migliorare notevolmente l'efficacia terapeutica delle cellule staminali38,39,40. Per manipolazione cellulare transitoria, microRNA (miRs) sono candidati adatti, come questi piccoli regolatori traduzionali controllano il destino e il comportamento delle cellule staminali senza il pericolo di genoma stabile integrazione41,42, 43. ad oggi, sono stati identificati diversi benefici miRs promuovere la proliferazione delle cellule staminali, sopravvivenza, homing, attività paracrina, nonché la loro differenziazione in diversi lignaggi44. Per esempio, miR-133a ingegnerizzato MSCs ha mostrato un aumento della sopravvivenza e l'attecchimento nei cuori del ratto colpito da infarto conseguente a un miglioramento della funzione cardiaca rispetto ai non modificato MSCs45. Allo stesso modo, miR-146a overesprimenti MSCs sono stati indicati per secernono una maggiore quantità di VEGF che a sua volta ha condotto ad una migliorata efficienza terapeutica nel tessuto ischemico46.

Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per l'estrazione selettiva e dell'ingegneria genetica di hDFSCs. Per questo scopo, abbiamo descritto la digestione enzimatica e raccolta dei follicoli dentali umane nonché l'isolamento successivo di hDFSCs. Per caratterizzare le cellule isolate, importanti istruzioni per la verifica delle proprietà MSC sono state incluse in conformità con le linee guida della società internazionale per la terapia cellulare13. Inoltre, forniamo una descrizione dettagliata per la generazione di hDFSCs miR-modificato applicando una strategia di trasfezione basata sui lipidi cationici e la valutazione di efficienza di trasfezione e citotossicità.

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Protocol

HDFSCs sono isolati dai follicoli dentali dei denti del giudizio estratti forniti dal dipartimento di chirurgia orale e maxillo-facciale plastica Rostock University Medical Center. Approvazione scritta e consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. Questo studio è stato autorizzato dal comitato etico locale dell'Università di Rostock (autorizzazione No. A 2017-0158).

1. isolamento di hDFSCs

Nota: Per evitare la contaminazione batterica, denti del giudizio non dovrebbe essere scoppiati prima dell'estrazione

  1. Preparazione delle soluzioni richieste
    1. Preparare il tampone fosfato salino (PBS) / soluzione di penicillina-streptomicina-glutamina (P-S-G): mescolare 495 mL di PBS con 5 mL di soluzione di P-S-G. Conservare le aliquote da 50 mL a 4 ° C.
    2. Preparare il terreno di coltura di hDFSC: mescolare 445 mL di sostanza basale con 5 mL di agente antibiotico e 50 mL di siero bovino fetale (FBS). Conservare a 4 ° C.
    3. Preparare collagenasi tipo stock soluzione (30 mg/mL): diluire 300 mg di tipo collagenosi io in 10 mL di sostanza basale completato con agente antibiotico 1%. Agitare energicamente la soluzione. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 µm. Le aliquote di negozio di 500 µ l di collagenasi di tipo I soluzione di riserva a-20 ° C.
    4. Preparare la soluzione di riserva Dispase II (40 mg/mL): diluire 40 mg di Dispase II in 10 mL di basale supplementato con agente antibiotico 1%. Agitare energicamente la soluzione. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 µm. Conservare le aliquote di 500 µ l di soluzione di riserva Dispase II a-20 ° C.
  2. Procedura chirurgica
    1. Iniettare una quantità sufficiente (massimo: 2 mL) di anestetico locale.
    2. Creare e generare una falda mucoperiosteal tre lati. Non è necessario sollevare un lembo linguale.
    3. Proteggere l'aspetto linguale con un Scollaperiostio.
    4. Delicatamente mulino buccale e distale dell'osso con una bava di metallo dura rotonda.
    5. Allentare il tessuto del follicolo con un Scollaperiostio. Rimuovere con cautela il dente completo (germe) e follicolo estraendo la corona (e follicolo) con una pinza posteriore (terzo molare).
    6. Sbrigliare e irrigare la presa accuratamente con soluzione di NaCl.
    7. Sostituire la falda mucoperiosteal con punti di sutura vicryl (Vedi Tabella materiali).
    8. Rimuovere il follicolo dente dalla cavità orale e inserirli in un'aliquota di 50 mL di soluzione di PBS/P-S-G.
      Nota: Il campione può essere conservato a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione.
  3. Digestione enzimatica del follicolo di dente
    1. Pre-riscaldare il terreno di coltura hDFSC e soluzione di PBS/P-S-G a temperatura ambiente (TA).
    2. Scongelare, un'aliquota di ciascun tipo di collagenasi io e soluzioni di riserva Dispase II. Preparare una soluzione di digestione di 3mg/mL collagenasi di tipo I e 4 mg/mL Dispase II aggiungendo 500 µ l di ogni collagenasi di tipo I e la soluzione di riserva Dispase II a 4 mL di medium basale contenente 1% agente antibiotico.
    3. Posizionare il follicolo Estratto in una capsula di Petri sterile e aggiungere 10 mL di soluzione di PBS/P-S-G per lavare il tessuto Estratto. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
    4. Tritare il follicolo Estratto a pezzi di circa 1 mm x 1 mm con un bisturi sterile all'interno della capsula di Petri contenente 10 mL di soluzione di PBS/P-S-G.
    5. Trasferimento del tessuto macinato e soluzione di PBS/P-S-G da di Petri in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Lavare la capsula di Petri con 10 mL di soluzione di PBS/P-S-G e trasferire la soluzione nella provetta stessa.
    6. Centrifugare la provetta conica per centrifuga per 10 min a 353 x g a RT e scartare il surnatante.
    7. Aggiungere 5 mL di soluzione di digestione al tessuto pellettato. Mescolare delicatamente il tessuto e la soluzione. Incubare la miscela a 37 ° C e 5% di CO2 per 2 h in un incubatore d'agitazione.
    8. Centrifuga digerito sospensione di cellule/tessuti a 353 x g per 10 min a RT. scartare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 6 mL di terreno di coltura di hDFSC.
    9. Sospensione di cellule di seme in un 25 cm2 cellulare cultura pallone e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 e 20% O2.
      Nota: Se il tessuto non è completamente digerito, trasferire il tessuto restante nel matraccio di cultura cellulare pure.
    10. Sostituire il terreno con attenzione 24h dopo la semina delle cellule. In seguito sostituire il terreno ogni tre giorni fino alla confluenza.
      Nota: HDFSCs dovrebbe essere plastica-aderente 24 h dopo la semina delle cellule e possono essere separati da cellule non aderenti e componenti del sangue, semplicemente cambiando il mezzo.
  4. Cella di raccolta
    1. Pre-riscaldare il terreno di coltura di hDFSC, soluzione di PBS/P-S-G e soluzione di tripsina/Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) a RT.
    2. Scartare il surnatante da matraccio di cultura e lavare le cellule confluenti con 5 mL di soluzione di PBS/P-S-G.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA il matraccio di cultura e incubare per 3 min a 37 ° C. Interrompere il processo di digestione con l'aggiunta di 3 mL di terreno di coltura di hDFSC nel matraccio di cultura.
    4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga a fondo conico da 15 mL e centrifugare la sospensione per 10 min a 353 x g a RT. scartare il supernatante e risospendere il pellet in una quantità appropriata di terreno di coltura di hDFSC.
    5. Contare le celle: mescolare delicatamente 10 µ l di sospensione cellulare con 10 µ l di soluzione di blu di Trypan. Applicare 10 µ l in una camera di conteggio e calcolare la quantità di cellule hDFSC.

2. caratterizzazione di hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Preparazione delle cellule per l'analisi cytometric di flusso
      1. Preparazione delle soluzioni richieste
        1. Preparare PBS/EDTA (2 mM): mescolare 996 mL di PBS con 4 mL di EDTA (0,5 M).
        2. Preparare il tampone colorazione: mescolare 995 mL di PBS/EDTA (2 mM) con 5 g di BSA. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e conservare a 4 ° C fino al momento d'uso.
        3. Preparare la soluzione di riserva di paraformaldeide (PFA) (4%): diluire 4G PFA in 100 mL di PBS e riscaldare la soluzione a 80 ° C. Miscelare la soluzione e regolare il pH a 7,3. Aliquota ottenuti soluzione PFA in rispettivi importi (1,5 mL) e conservare a-20 ° C fino a quando l'utilizzo.
          Attenzione: Poiché PFA fumi sono tossici, preparare la soluzione PFA in una cappa ventilata.
      2. Dopo cella di raccolta (1,4), trasferire 14 campioni di 5 x 104 celle in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare le sospensioni a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
        Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata. Tenere le celle e reagenti il ghiaccio se non diversamente specificato.
      3. Risospendere le cellule in determinate quantità di macchiatura tampone (4 ° C) e aggiungere FcR blocco reagente (4 ° C) come indicato nella tabella 1.
      4. Aggiungere i seguenti anticorpi sul lato interno del rispettivo campione come indicato nella tabella 1: Allophycocyanin (APC) del mouse anti-umano CD29; Mouse APC controllo di isotipo IgG1 κ; Proteina peridinin-clorofilla (PerCP)-Cyanine5.5 murino anti-umano CD44; PerCP-Cyanine5.5 mouse controllo di isotipo κ IgG2b; V500 murino anti-umano CD45; V500 mouse controllo di isotipo IgG1 κ; Ficoeritrina (PE) murino anti-umano CD73; Mouse PE controllo di isotipo IgG1 κ; PerCP-Cyanine5.5 murino anti-umano CD90; PerCP-Cyanine5.5 mouse controllo di isotipo IgG1 κ; del mouse CD105 anti-umano: Alexa Fluor (AF) 488; il controllo negativo IgG1 del mouse: AF488; PE-Cyanine7 murino anti-umano CD117; PE-Cyanine7 mouse IgG1, controllo di isotipo κ. Dopo che gli anticorpi sono stati aggiunti a ciascun campione, rotazione verso il basso gli anticorpi e mescolare delicatamente. Incubare le soluzioni per 10 min a 4 ° C.
      5. Aggiungere 1 mL di PBS (4 ° C) e centrifugare i campioni a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
      6. Risospendere le cellule in 100 µ l di PBS (4 ° C) e µ l 33 di PFA (4%). Mescolare le soluzioni e conservare in ghiaccio o a 4 ° C fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
    2. Misura di cytometric di flusso delle cellule
      Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata. Mantenere le cellule su ghiaccio fino a misura.
      1. Per esaminare l'espressione degli antigeni di superficie, è possibile trasferire campioni in tubi adatti per misure di cytometric di flusso.
      2. Misurare almeno 2 x 104 eventi utilizzando un citometro a flusso. Analizzare come raffigurato in Figura 2.
  2. Potenziale di differenziazione multipotente di hDFSCs
    1. Utilizzare un Kit disponibile in commercio umano Mesenchymal Stem Cell funzionale identificazione per confermare adipogenico, osteogenico e potenziale di differenziazione condrogenica di hDFSCs. Applicare anticorpo secondario di asino anti-capra AF488 per la macchiatura della proteina dell'acido grasso 4 (FABP4) e Aggrecano così come anticorpo secondario di asino anti-topo AF488 per la colorazione dell'osteocalcina. Per la colorazione dei nuclei, utilizzare il mezzo di montaggio con 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Nota: Preparare i campioni senza anticorpo primario come controlli negativi per analisi al microscopio.
    2. Analizzare l'espressione delle proteine mediante microscopia confocale a scansione laser. Impostazioni di microscopia: obiettivo 40x con olio da immersione; eccitazione laser 488 nm (per AF488) e 405 nm (per DAPI).

3. la transfezione di hDFSCs

  1. Dopo cella di raccolta (1,4), seme hDFSCs su una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti 24 h prima di transfezione.
    Nota: A partire di densità delle cellule è circa 4 x 104 cellule per pozzetto. Cellule dovrebbero raggiungere la confluenza di ~ 80% giorno di transfezione.
    Nota: Campione di cellule supplementari di un seme come controllo per analisi cytometric di flusso.
  2. Preparazione di complessi di transfezione
    Nota: Per evitare la contaminazione da RNasi, pulire l'area di lavoro direttamente prima della preparazione di complessi di transfezione usando la soluzione di decontaminazione di RNAsi. Utilizzare solo materiale privo di RNAsi e soluzioni.
    Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata.
    1. Preparare la soluzione di riserva di miR (50 µM): risospendere miR precursore Cy3-etichettati (nmol 5) in acqua priva di nucleasi di 100 µ l. Soluzione di riserva di aliquota miR ottenuti in rispettivi importi (5 µ l) e conservare al buio a-20 ° C fino a quando l'utilizzo.
    2. Diluire 40 pmol di miR (0,8 µ l della soluzione madre miR 50 µM) in 66,7 µ l di siero riduttore terreno. Mescolare delicatamente la soluzione
    3. Diluire 0,67 µ l di reagente di transfezione basata sui lipidi cationici in 66,7 µ l di siero riduttore terreno. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare per 5 minuti a TA.
    4. Dopo l'incubazione, aggiungere il reagente di transfezione pre-diluito il miR pre-diluito. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare per 15 minuti a TA.
  3. Aggiungere goccia a goccia i complessi di transfezione preparati direttamente al terreno di coltura sulle cellule. Mescolare delicatamente a dondolo avanti e indietro la piastra di coltura cellulare 24 pozzetti.
  4. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2e 20% O2 per 24 h.

4. analisi di transfezione

Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata.

  1. Cella di raccolta dopo la trasfezione
    Nota: Raccogliere tutte le soluzioni di cella di un campione nella stessa provetta conica da 15 mL.
    1. 24 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante di campioni nelle rispettive provette.
    2. Lavare le cellule con 1 mL di PBS, trasferire PBS nella provetta da centrifuga rispettivi e aggiungere 500 µ l tripsina/EDTA (RT) alle cellule. Incubare le soluzioni per 3 min a 37 ° C.
    3. Fermare trypsinization aggiungendo 1 mL di terreno di coltura (RT) alle cellule e trasferire la soluzione nella provetta da centrifuga rispettivi. Cellule di centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
      Nota: Da questo momento, è necessario tenere le celle e reagenti il ghiaccio se non diversamente specificato.
  2. Preparazione delle cellule per l'analisi cytometric di flusso
    1. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 µ l di buffer di colorazione (4 ° C) e soluzione di cella di trasferimento in una microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Aggiungere 0,5 µ l di coloranti reattivi ammina ai campioni al fine di distinguere tra cellule vivi e morte. Delicatamente mescolare la soluzione e incubare per 10 min a 4 ° C.
    3. Aggiungere 1 mL di PBS (4 ° C) alle cellule e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
    4. Risospendere le cellule in 100 µ l di PBS (4 ° C) e µ l 33 di PFA (4%). Mescolare le soluzioni e conservare in ghiaccio o a 4 ° C fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
  3. Misura di cytometric di flusso delle cellule
    Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata. Mantenere le cellule su ghiaccio fino a misura.
    1. Trasferire i campioni in tubi adatti per misure di cytometric di flusso.
    2. Esaminare la vitalità cellulare e l'efficienza di assorbimento di miR utilizzando un citometro a flusso. Misurare almeno 2 x 104 eventi. Utilizzare la strategia di gating raffigurata nella Figura 4.
      Nota: Utilizzare cellule untransfected come controllo negativo per organizzare il gating per cellule positive Cy3 e calcolare la morte delle cellule causata dalla transfezione.

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Representative Results

Qui, presentiamo un istruzioni dettagliate isolamento per raccogliere hDFSCs dal tessuto umano del follicolo dentale. A causa del facile accesso del follicolo dentale durante l'intervento chirurgico di routine, è una fonte di promessa per l'estrazione di cellule staminali adulte.

Il hDFSCs isolato ha mostrato tutte le caratteristiche descritte per la definizione di MSCs13. Infatti, le cellule erano plastica-aderente sotto descritto condizioni di coltura e visualizzato una fibroblasto-come la morfologia (Figura 1). Analisi cytometric di flusso ha rivelato che hDFSCs espresso un pannello di determinati antigeni di superficie, tra cui CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105, mentre CD45 e CD117 erano assenti (Figura 2). Inoltre, l'adipogenico, osteogenico e potenziale di differenziazione chondrogenic delle cellule sotto specifiche in vitro cultura condizioni è stata confermata da immunostaining della proteina 4 dell'acido grasso (FABP4), osteocalcina e Aggrecano (Figura 3).

La strategia descritta trasfezione basata sui lipidi cationici attivati efficiente transitoria modificazione genetica di hDFSCs con un miR-assorbimento in ~ 100% di post-transfezione di cellule vitali 24h (Figura 4B). Inoltre, trasfettate (Figura 4A) e untransfected (Figura 4) campioni hanno mostrato importi paragonabili di cellule morte dimostrando condizioni di lavorazione delicata delle cellule.

Figure 1
Figura 1: rappresentante luce foto microscopio di hDFSCs. Le cellule mostrano una morfologia fibroblasto-come in condizioni di coltura standard.

Figure 2
Figura 2: immunophenotyping cytometric di flusso rappresentativo di hDFSCs. Analisi citofluorimetrica delle cellule dopo la macchiatura per indicatori di superficie delle cellule specifiche (blu). Controlli di isotipo corrispondenti sono stati utilizzati come controlli negativi (grigio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: verifica referente del adipogenico, osteogenico e potenziale di differenziazione condrogenica di hDFSCs. Dopo la differenziazione, adipociti, osteociti e condrociti sono stati identificati da immunostaining di proteina dell'acido grasso (A) 4 (FABP4) (verde), (B) osteocalcina (verde) e (C) Aggrecano (verde). I nuclei sono stati macchiati con DAPI (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: rappresentante gating strategia per analisi di transfezione. Rappresentazione schematica di gating strategia utilizzata per la quantificazione di citotossicità (A) (blu: le cellule morte) e (B) l'efficienza di assorbimento di Cy3-labeled miR (rosso: Cy3+ cellule) Post-transfezione 24h. Cellule untransfected (C,D) sono state usate come controllo.

MACS FcR Anticorpi [µ l] Isotype controlli [µ l]
Campione buffer blocco CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy 5.5 V500 PE PerCP-Cy 5.5 AF488 PE-Cy7
[µ l] reagente [µ l] APC PerCP-Cy 5.5 V500 PE PerCP-Cy 5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37.5 10 2.5
3 37.5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37.5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37.5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37.5 10 2.5

Tabella 1: Pipettaggio layout per immunophenotyping di hDFSCs.

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Discussion

Cellule staminali adulte sono attualmente a fuoco per il trattamento di parecchie malattie degeneranti. In particolare, dell'osso midollo osseo (BM)-cellule staminali, tra cui le cellule staminali ematopoietiche (HSCs) e MSCs, sono sotto indagine clinica intensiva47. Tuttavia, BM raccolta è una procedura invasiva, causando dolore al sito di donazione e può portare a eventi avversi48. Recentemente, il tessuto dentale postnatale è emerso come un romanzo e una fonte facilmente accessibile per le cellule staminali. Queste cellule staminali dentali sono state indicate per soddisfare tutte le caratteristiche MSC e ha mostrate maggiore capacità di proliferazione come cellule staminali derivate dal BM49. Qui, abbiamo presentato un protocollo dettagliato per l'estrazione, la caratterizzazione e l'ingegneria di hDFSCs.

La procedura di isolamento descritto è stata sviluppata su umani follicoli dentali dei denti del giudizio, come questo tessuto viene comunemente estratta e smaltito come rifiuti medici19. Tuttavia, altri tessuti dentali, tra cui polpa dentale50,51, legamento parodontale52, denti decidui esfoliate53e radice apicale papilla54, possono essere utilizzati per l'estrazione di staminali dentali cellule.

Ingegneria genetica delle cellule staminali inserendo miRs è una nuova strategia per superare alcune difficoltà nelle terapie basate sulle cellule staminali, quali cellule staminali bassa sopravvivenza43,55,56,57. Questo protocollo presentato istruzioni cruciale per l'introduzione efficiente di miR sintetica in hDFSCs utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi cationici commercialmente disponibili. L'applicazione delle formulazioni liposomiali cationiche per la consegna dei reagenti terapeutiche, quali le droghe e gli acidi nucleici, è stato studiato in numerosi studi clinici58,59. Tuttavia, liposomi cationici sono potenzialmente citotossici in maniera dose-dipendente causando ad esempio, danno all'integrità della membrana cellulare o alterazioni nel gene espressione59,60,61 . Di conseguenza, devono prestare particolare attenzione agli effetti tossici sulle cellule indotte dalla transfezione.

In particolare, condizioni di transfezione indicato sono state ottimizzate per miR-mediata di modificazione genetica di hDFSCs per quanto riguarda efficienza e citotossicità. Tuttavia, altri studi hanno dimostrato l'efficace applicazione di questo reagente di transfezione per la consegna di ulteriori acidi nucleici, compreso il plasmide DNA, mRNA e siRNA, nella cella diversi tipi62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. risultati di questi studi hanno rivelato che le condizioni di consegna ideale variano sensibilmente e devono essere definite per ogni tipo di cellula.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal foro con. rar programma di il Rostock University Medical Centre (889018) e la Fondazione umida (2016-11). In aggiunta, P.M. e R.D. sono supportati da BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

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Genetica problema 141 cellule staminali cellule staminali del follicolo dentale cellule staminali mesenchimali modificazione non virali ingegneria genetica trasfezione transiente microRNA
Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano
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Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

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