Summary
Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.
Abstract
Cultivant Caenorhabditis elegans (c. elegans) de façon à grande échelle sur des plaques de gélose peut être long et difficile. Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteuse pour obtenir un grand nombre d’animaux pour l’isolement des protéines de procéder à de nouvelles analyses protéomique, spectrométrie de masse ou une tache occidentale. Par ailleurs, une augmentation de nombre de nématodes pour immunostainings et l’intégration des analyses multiples dans les mêmes conditions de culture peuvent être facilement réalisées. En outre, un transfert entre plaques avec différentes conditions expérimentales est facilité. Les techniques courantes dans la culture de la plaque à la cession d’un seul c. elegans en utilisant un fil de platine et le transfert de gélose peuplée en morceaux à l’aide d’un scalpel. Cependant, avec l’augmentation du nombre de nématodes, ces techniques deviennent trop longues. Ce protocole décrit la culture à grande échelle c. elegans incluant de nombreuses mesures pour minimiser l’impact de la préparation de l’échantillon sur la physiologie du ver. Fluide et contrainte de cisaillement peuvent modifier la durée de vie et les processus métaboliques chez c. elegans, ce qui nécessite une description détaillée des étapes critiques afin de récupérer des résultats fiables et reproductibles. C. elegans est un organisme modèle, consistant en des cellules neuronales jusqu'à un tiers, mais n’ayant pas de vaisseaux sanguins, permettant ainsi la possibilité d’étudier uniquement des altérations neuronales indépendantes contrôle vasculaire. Récemment, début neurodégénérescence dans la rétinopathie diabétique a été trouvé avant des altérations vasculaires. Ainsi, c. elegans est d’un intérêt particulier pour l’étude des mécanismes généraux des complications du diabète. Par exemple, une formation accrue d’advanced glycation produits (Age) et les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont observée, que l'on retrouve de façon reproductible chez c. elegans. Protocoles pour gérer les échantillons de taille suffisante pour un plus large éventail d’enquêtes sont présentées ici, illustré par l’étude des altérations biochimiques induites par le diabète. En général, le présent protocole peut être utile pour les études nécessitant une grande c. elegans numéros et dans quelle culture liquide ne convient pas.
Introduction
Les analyses de protéines, comme une tache occidentale ou la spectrométrie de masse, nécessitent milligrammes de protéines. Ce rendement nécessite une culture à grande échelle de centaines c. elegans, qui peut être accompli par la culture liquide ou sur des milieux solides, transférant les nématodes par lavage. Fluide et contrainte de cisaillement induit l’expression des canaux sodium épithélial (ENaC), ce qui pourrait augmenter le stress osmotique à travers une augmentation de l’absorption de sodium, potentiellement modifier la durée de vie de c. elegans et affectant les analyses métaboliques1 . Par conséquent, certaines étapes critiques dans le présent protocole pour l’approche axée sur la plaque prennent la réduction du stress affectant la variabilité expérimentale en compte. Milieu de culture liquide, d’autre part, influe sur le phénotype des nématodes et complique la culture et la collection d’un nombre exact de nématodes2. En outre, substances réactives peuvent être modifiés par les composants de médias et peuvent distribuer inégalement avant d’atteindre les nématodes. Relatives aux limitations de culture liquide, ce protocole prévoit une approche alternative à la culture des échantillons à grande échelle de c. elegans.
C. elegans est un organisme modèle avec un réseau distinct de 302 neurones, qui constituent un tiers de toutes ses cellules3. Depuis son introduction dans la science, bon nombre d’homologues et gènes orthologues ont été décrites, amplifiant sa valeur comme un modèle pour la recherche médicale. Récemment, les preuves pour des troubles neurologiques dans la rétinopathie diabétique, précédant les lésions vasculaires, a été présenté4. C. elegans est dépourvu de vaisseaux sanguins, mais contient un réseau neuronal distinct, ce qui en fait un modèle approprié pour enquêter sur des altérations neuronales en dehors vasculaire. Ainsi, c. elegans est d’un intérêt particulier pour l’étude des mécanismes généraux des complications du diabète. Les modifications biochimiques dans les complications du diabète impliquent la formation d’Age, qui influencent davantage la formation de ROS en réponse à l’hyperglycémie5. Sont trouvent chez c. elegans et contribuent aux dommages neuronaux6ans. Les maladies chroniques sont souvent causés par des processus complexes, polygéniques, nécessitant une approche multiparamétrique pour l’évaluation de leurs mécanismes sous-jacents, comme exemplifié ici avec l’évaluation des complications du diabète. Ce protocole peut être utiles pour l’obtention des paramètres multiples simultanément, ainsi que par la suite. Comparabilité accrue et la reproductibilité d’une approche multiparamétrique est possible en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.
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Protocol
Remarque : Ce protocole est divisé en cinq sections. Dans les sections 1 à 3, le protocole principal à la culture de c. elegans à grande échelle est présenté. Les articles 4 et 5 fournissent des protocoles additionnels pour l’évaluation des métabolites dont témoigne en métabolites diabétiques. En détail, article 1 décrit une culture générale à grande échelle sur les plaques. Section 2 porte sur le transfert de grandes quantités c. elegans, considérant que le chapitre 3 explique la récolte d’un échantillon à grande échelle. Section 4 explique l’isolement des protéines de l’échantillon et la section 5 décrit la préparation des échantillons pour des analyses ultérieures liquid chromatography-spectrométrie de masse (LC-MS/MS).
1. Grande Culture sur plaques
- En général, travail sous hotte stérile ou à proximité d’une flamme nue pour éviter les contaminations.
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À la culture vers jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade adulte jeune, suivre ce protocole publiées antérieurement7 avec les adaptations suivantes.
- Bactéries vivantes Escherichia coli OP50 permet de nourrir les nématodes et préparer la gélose de fluorodésoxyuridine 400 µM (pas ampicilline/FUdR) pour des expériences.
- Pour la préparation d’une population synchrone, utilisez OP50 non concentrée et pour réussir les expériences avec les adultes, utilisez 3,3 x concentré OP50 enlève 70 % du liquide surnageant.
- Les intervalles d’alimentation quotidiennes sont recommandés. Lors de l’évaluation du stress oxydatif, à différents intervalles et volumes destinés à l’alimentation pourraient interférer avec les résultats.
- Pour l’inoculation, prenez une plaque avec plusieurs nématodes et coupez-la en morceaux d’environ 0,5 x 1 cm2 avec un scalpel. Le transfert de deux ou trois morceaux sur des plaques de croissance nématode médias (NGM) de 60 mm de diamètre, contenant OP50 non concentrée.
- Incuber les plaques à la température appropriée pour la souche (N2 sauvage devraient être cultivées à 20 ° C) jusqu'à ce que les oeufs sont visibles sur la plaque.
- Laver la plupart des œufs et des animaux adultes avec 2 mL de tampon de M9 et à leur rassemblement dans un tube de 15 mL. Centrifuger la suspension à 800 g pendant 2 min. Pendant ce temps, commencer à préparer la solution de blanchiment.
- Retirez le tube centrifugé et enlever le tampon M9 avec une pipette de 10 mL. Ajouter 10 mL de la solution de blanchiment et les mix sur le vortex jusqu'à ce que les nématodes adultes sont lysées. Cela prend habituellement environ 5 à 7 min, mais ne devrait pas prendre plu de 15 min ou les oeufs ne seront développera pas complètement plus tard sur dans l’expérience.
- Centrifuger la suspension à 800 g pendant 2 min. Laver 3 fois avec 10 mL M9 de tampon pour effacer les oeufs de la solution de blanchiment.
- Maintenant ajouter 150 µL de la suspension de le œuf sur plaques OP50. Une densité de 200 à 300 œufs doit être atteinte sur chaque plaque. Attendez que les nématodes ont atteint le stade adult.
Remarque : Le M9 de tampon (pH 7,0) utilisé pour les expériences dépeinte se compose des substances suivantes : 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4et 86 mM NaCl. Après autoclavage le mélange, ajouter 1 mM MgSO4. La solution de blanchiment contient 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl résolu dans l’eau distillée. - Préparer la tampon stérile de M9, pointes de pipette stérile avec une coupe astuce pour éliminer les vers et les tubes de 15 mL pour les recueillir dans.
- Appliquer environ 1 mL de tampon de M9 sur les plaques, doucement distribuer le tampon en balançant doucement et pipette les nématodes de la plaque.
- Maintenant, recueillir les nématodes dans le tube. S’appliquent, avec les pointes de pipette coupés, 150 µL de suspension directement sur les plaques (boutonnée avec OP50) et d’évaluer au microscope la densité des nématodes (recommandé : 50 – 100 nématodes par plaque de 60 mm).
- S’ils sont trop denses, diluer la suspension avec un tampon M9 et évaluez-la sous le microscope, jusqu'à ce que la densité désirée est atteinte. Si le rendement est trop peu, laissez les vers s’installent ou Centrifuger le s suspension 10 x 800 g pour éliminer le liquide.
Remarque : Un exemple d’une densité suffisante est donné dans la Figure 1 a (macroscopique) et 1 b (microscopique) à une augmentation de X 20. Procéder empiriquement comme décrit. - N’oubliez pas que les vers s’installent rapidement. Afin d’assurer une répartition égale entre les plaques, il faut inverser le tube après chaque pile de plaques (plaques de 4 – 5).
Remarque : La coupe Pipeter pointe, ainsi que le doux balancement et lavage des plaques, réduit l’effort de cisaillement.
2. transférer de grandes quantités de Caenorhabditis elegans
- Laver les nématodes avec environ 500 µL de tampon de M9, selon l’âge et le degré de séchage des plaques. En utilisant le même tampon, répétez détacher les nématodes jusqu'à ce que la plupart des animaux est recueillie en suspension.
- Lentement relever les nématodes avec une coupe de pipette et de les transférer sur un plat préparé avec OP50. Sécher la plaque.
Remarque : Veillez à ne pas faire beaucoup plus que le volume recommandé. En particulier dans les expériences à long terme, les plaques ne pourraient pas tolérer il et l’agar peut casser, ce qui permet des nématodes à ramper dans les mailles du filet.
3. la récolte d’un Large échantillon de Caenorhabditis elegans
- Selon la méthode choisie, commencent des expériences avec une quantité suffisante de c. elegans. Pour les analyses LC-MS/MS, préparer 20 plaques (60 mm x 15 mm) par groupe avec environ 100 nématodes par plaque afin d’assurer un rendement d’au moins 200 µg de protéines par exemple.
Remarque : Cette partie du protocole ne requiert pas fonctionne dans des conditions stériles plus, car les nématodes seront récoltés et congelés. - Le jour de la collecte d’échantillons, préparer l’azote liquide à snap-freeze les échantillons collectés. Gardez non-stérile M9 tampon sur la glace pour ralentir le métabolisme du nématode.
- Nettoyez c. elegans , des plaques en appliquant 1 mL de tampon de M9 et en agitant doucement les plaques. Cela évite de recueillir les nématodes décédés et la plupart des oeufs, si il sont tous présents, car elles collent aux bactéries et agar.
- Prendre le volume et le transférer dans un tube de 15 mL.
- Après le prélèvement de l’échantillon complet, attendez que les nématodes régler ou Centrifuger le tube brièvement à 800 x g et enlever la plupart de la mémoire tampon de M9. Laver l’échantillon 3 x avec environ 10 mL de M9 (10 x le volume de l’échantillon) pour éliminer toutes les bactéries.
Remarque : Pour garantir que tous les nématodes décédés sont annulés, flottaison du saccharose est une autre option. Cependant, ce n’était pas approprié pour les expériences affiché15. Saccharose est hydrolysé en glucose et fructose. Dans les expériences dépeinte, a évalué le rôle du glucose pour promouvoir des changements biochimiques trouvés dans le diabète chronique. Ainsi, flottaison saccharose pourrait potentiellement entraîner des résultats. - Préparer un tube de 1,5 mL avec 1 mL de tampon de M9 et un tube vide de 1,5 mL pour chaque échantillon. Transférer le culot avec une pipette de verre du tube 15 mL pour le tube vide de 1,5 mL. Cette étape est fondamentale assurer un transfert quantitatif.
NOTE : Contrairement au cours des étapes précédentes, ici les nématodes sont plus concentrés. En raison d’une possible adhésion aux embouts en plastique, la perte d’une grande partie de l’échantillon est prévu. Par conséquent, utiliser des pipettes en verre à la place. - Après le transfert, utiliser la pipette de verre pour prendre 1 mL de tampon de M9 dans le deuxième tube de 1,5 mL pour rincer les nématodes de la paroi de la pipette. En outre, laver les nématodes restantes dans le tube de 15 mL et transférez-les dans le tube échantillon.
- Centrifuger le tube d’échantillon à 19 000 x g pendant 1 min, puis retirez autant surnageant que possible.
- Fermer le tube avec du Parafilm et immédiatement snap-gel il dans l’azote liquide. Ranger le tube à-80 ° C jusqu'à ce que la préparation du lysate.
4. protein isolement de la spectrométrie de masse
Remarque : L’isolement de protéine décrite ici permet également d’autres épreuves (p. ex., la tache occidentale).
- Ajouter à l’échantillon congelé, les mêmes volumes de 0,5 mm oxyde de zirconium perles et au moins 2 x le volume de tampon lysat contenant un cocktail d’inhibiteur de protéase.
Remarque : Les analyses de corrélation dépeinte de nématodes-à-protéine ont été effectuées à l’aide de 100 µL de tampon. LC-MS/MS des échantillons ont été lysées avec 200 µL de tampon. - Commencer l’homogénéisateur pendant 1 min à vitesse 9. S’assurer que les échantillons sont complètement lysées. Répétez cette étape si elles ne sont pas complètement lysées.
- Centrifuger les échantillons pendant 30 min à 4 ° C à 19 000 x g. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sur la glace et conserver à-80 ° C jusqu'à ce que plus mesures vont être prises.
Remarque : La mémoire tampon non dénaturants utilisée pour les expériences dépeinte se compose des substances suivantes : 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1 % Triton-X et 2 mM EDTA.
Remarque : Après avoir suivi les étapes du présent protocole et après avoir appliqué le barème proposé, le rendement d’une pastille de protéine d’environ 1 000 nématodes devrait être environ de 500 µg. Pour plus de comparaisons, consulter la Figure 2 et les Résultats de représentant.
5. préparation des mesures de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide
Remarque : Selon le paramètre d’intérêt, la préparation de l’échantillon sera différente. Ce protocole met l’accent sur le méthylglyoxal et détermination de l’âge.
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Mesurer le méthylglyoxal intracellulaire par dérivation avec 1, 2-diaminobenzène (DB) comme décrit précédemment9.
- Homogénéiser les échantillons avec 20 µL de l’acide trichloroacétique glacee 20 % (wt/vol) dans le chlorure de sodium 0,9 % (wt/vol) et 80 µL d’eau dans un tube de 1,5 mL.
- Doper les échantillons de 5 µL avec l’étalon interne (13C3-MG ; 400 nM), mélangez-les au vortex et centrifuger à 21 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Transférer 35 µL du liquide surnageant dans le flacon d’échantillon HPLC contenant un insert en verre 200 µL.
- Ajouter 5 µL de 3 % d’azide de sodium (wt/vol) à chaque échantillon suivie de 10 µL de 0.5 mM DB 200 mM HCl contenant 0,5 mM diéthylènetriaminepentaacétique de l’acide (DETAPAC) dans l’eau.
- Incuber les échantillons pendant 4 heures à température ambiante, abrie de la lumière.
- Analyse des échantillons par LC-MS/MS, comme précédemment décrit9.
Remarque : Pour la mesure des âges, isoler les protéines comme décrit à l’article 4 du protocole.
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Mesurer la concentration de protéine des lysats (décongelées) à l’aide d’un dosage de Bradford10.
- Préparer des aliquotes de 30 µL pour une courbe standard additionnée de l’albumine sérique bovine (BSA) résolu en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de la concentration suivante : 0 ; 0.1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ; et 1,0 mg/dL.
Remarque : Si l’échantillon a été préparée à la taille suggérée (voir point 4.1 pour la préparation du lysat avec 200 µL de tampon), la concentration doit être de l’ordre de 2 à 7 mg/mL environ. Dans ce cas, diluer les échantillons 01:10 par PBS avant la mesure.
Remarque : Pour les premières expériences à l’aide de cette méthode, il est recommandé de mesurer les échantillons à différentes dilutions (1, 01:10 et 1/100). Comme il n’y a aucune détermination exacte du nombre de nématodes, le rendement peut différer entre les chercheurs individuels. - Utiliser une plaque transparente de 96 puits (polystyrène) et déposer 10µl de chaque concentration standard et des échantillons dans les dilutions choisies en double dans les puits.
- Diluer la protéine test colorant réactif concentré 1:5 avec de l’eau distillée (aq. dest.) et ajouter 200 µL de la dilution à chaque échantillon sur la plaque. Incuber la plaque pendant 10 min à température ambiante.
- Mesurer l’absorbance à moins de 30 min à 595 nm avec un lecteur de plaque. Les échantillons peuvent être interpolées à partir de la courbe standard calculée. Plus de détails sur la méthode ont été largement décrits dans la littérature10.
- Préparer des aliquotes de 30 µL pour une courbe standard additionnée de l’albumine sérique bovine (BSA) résolu en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de la concentration suivante : 0 ; 0.1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ; et 1,0 mg/dL.
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Mesurer les âges intracellulaires comme décrit précédemment11,12.
- Laver les extraits de protéines totales (environ 200 µg) x 3 avec de l’eau par ultracentrifugation en 10 unités de filtration centrifuge de kDa.
- Ajouter 10 µL de HCl à 100 mM, 10 µL de pepsine (2 mg/mL de HCl 20 mM) et 10 µL de thymol (2 mg/mL de HCl 20 mM) à la protéine Récupérée (environ 100 µL) et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 24 h.
- Neutralisent et les échantillons de tampon à pH 7,4 en ajoutant 12,5 µL de tampon de phosphate de potassium 0,5 M (pH 7,4) et 5 µL de 260 mM KOH.
- Ajouter 10 µL de la Pronase E [2 mg/mL dans le tampon de phosphate de potassium 10 mM (pH 7,4)] et 10 µL d’une solution de pénicilline-streptomycine et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 24 h.
- Ajouter 10 µL d’aminopeptidase [2 mg/mL dans le tampon de phosphate de potassium 10 mM (pH 7,4)] et 10 µL de prolidase [2 mg/mL dans le tampon de phosphate de potassium 10 mM (pH 7,4)] et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 48 h.
- Analyser l’hydrolysat résultante par LC-MS/MS, comme précédemment décrit12.
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Representative Results
Ici les exemples de la création d’une grande envergure c. elegans culture pour applications en recherche sur le diabète sont présentées. Il peut être intéressant de relier les paramètres pour un seul animal, plutôt que de normaliser ce à la concentration des protéines totales. Dans un test nécessitant un petit nombre de nématodes, ceci peut être facilement accompli en comptant les nématodes. Pour une envergure de c. elegans culture impliquant des centaines de nématodes par groupe expérimental, cette approche n’est pas pratique. Dans la Figure 2, la corrélation entre la quantité de c. elegans et la teneur en protéines est exposée. Comme nous l’avons démontré ici, isolement reproductible protéine quantitative peut être réalisé en utilisant ce protocole.
Le Amadori adduit fructosyl-lysine est l’un des plusieurs précurseurs d’âge formés lors de diabète chez les animaux expérimentaux modèles13. Figure 3 affiche les mensurations de la LC-MS/MS après un traitement de glucose chez les nématodes âgés de 12 jours et appariés selon l’âge des témoins non traités de trois expériences indépendantes. Les nématodes ont été homogénéisés avec un ajout de 200 µL de tampon de lysat. Une formation accrue de fructosyl-lysine après que le traitement secondaire-glucose est présenté.
Les métabolites réactifs tels que méthylglyoxal sont fluctuant et modifier rapidement les protéines14. Par conséquent, reste à savoir si ces métabolites réactifs en fait s’accumuler dans l’organisme ou sont modifiés avant d’atteindre leur cible. Figure 4 confirme l’accumulation de méthylglyoxal chez c. elegans après un traitement avec la substance.
Le stress oxydatif est augmenté au cours de l’hyperglycémie6, ainsi qu’au cours de la contrainte de cisaillement. Figure 5 ne confirme aucune différence dans la formation du stress oxydatif entre le groupe imprégnées de glucose, transféré à l’article 2 du protocole et le groupe non transférées. Comparaison entre les deux groupes traités glucose au groupe témoin non traité présente une augmentation significative dans le stress oxydatif induit par le glucose. En revanche, aucune différence significative entre les deux groupes traités glucose a été observée. Ces résultats illustrent que manipulation nématodes utilisant ce protocole n’induit pas significativement la formation de stress oxydatif, qui pourrait servir comme un facteur de confusion dans les études de vieillissement ou le métabolisme. En outre, les résultats dans la littérature actuelle ont été reproduits utilisant ce protocole.
Figure 1 : densité adéquate de nématodes pour une distribution ultérieure sur plaques. (A), ce panneau affiche une vue macroscopique. (B), ce panneau affiche une vue microscopique, à une augmentation de X 20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Teneur en protéines de type sauvage c. elegans N2. Ce panneau montre la corrélation entre le nombre de nématodes pour le rendement en protéine le lysat, préparé comme décrit dans la section protocole 5 nématodes d’âgés de 12 jours en(n = 3 lysat de 500 nématodes ; n = 3 lysat de 1 000 nématodes ; et n = 1 lysat de nématodes 1 500). La courbe de régression est marquée en rouge (r2 = 0,976, y = 0,64). La concentration en protéines totales a été mesurée à l’aide de la méthode de Bradford. Les données sont exprimées en la moyenne ± écart-type (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Augmente la formation de fructosyl-lysine après un traitement de glucose de c. elegans N2. Les concentrations de fructosyl-lysine après traitement au glucose chez les nématodes âgés de 12 jours et le groupe témoin ont été déterminées par LC-MS/MS et normalisées à une concentration de protéine déterminée par la méthode de Bradford. Les données sont exprimées en la moyenne ± SD Les p-valeurs ont été déterminées par de Student t-test, **p < 0,01. Les résultats proviennent de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les concentrations intracellulaires de méthylglyoxal après un traitement de méthylglyoxal de c. elegans N2. Méthylglyoxal concentrations ont été mesurées par LC-MS/MS de nématodes âgés de 12 jours, traités avec méthylglyoxal. Les échantillons ont été recueillis à moins de 2 h après le dernier traitement. Les données sont exprimées en la moyenne ± écart type normalisé pour le nombre de nématodes. Les p-valeurs ont été déterminées par de Student t-test, **p < 0,01. Les résultats proviennent de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Le stress oxydatif mesurée dans c. elegans CL2166 après un traitement de glucose. Transgéniques CL2166 (gst4::GFP)8 contenant glutathion-S-transférase 4-promoteur-driven GFP journaliste ont été cultivés sur des plaques de FUdR 400 µM contenant du glucose pendant 2 jours. Un groupe a été transféré aux plaques de glucose frais le jour 1 tel que décrit à l’article 2 du présent protocole. Le stress oxydatif a été mesuré une augmentation en fluorescence [unités de lumière relatives (RLU)] avec l’aide d’un lecteur. Les données sont exprimées en la moyenne ± SD Les p-valeurs ont été déterminées par l’analyse de la variance, *p < 0,05. Les résultats proviennent de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole présente une approche fiable pour la culture à grande échelle c. elegans afin d’obtenir des résultats quantitatifs. Les résultats de la littérature pourraient être transposés comme indiqué dans les Résultats de représentant. Même si ce protocole pour le prélèvement d’échantillons à grande échelle de c. elegans semble être une méthode directe, il y a certains pièges à prendre en compte. Concernant la synchronisation de la population des nématodes, ce protocole décrit une approche par la population avec l’hypochlorite de sodium et hydroxyde de sodium pour détruire les nématodes et récolter les œufs uniquement de blanchiment. Il doit être tenu compte du fait que cette approche peut ne pas convenir pour toutes les expériences. Selon le rapport entre la taille de la population au volume de la solution de blanchiment, l’effet de porter atteinte à de la solution de blanchiment influence le développement des embryons15. Surtout quand étudie les processus de développement, cela pourrait être une étape cruciale. En ce qui concerne le traitement des nématodes, il est crucial d’appliquer comme forces de cisaillement peu possible dans tout le protocole. Si ne pas manipulés avec soin, un grand nombre de nématodes périront. D’ailleurs, il est important de ne pas dépasser le temps de rotation et la vitesse. Lorsque vous transférez les nématodes, une coupe de la pipette pour réduire le nombre de nématodes blessés doit être utilisée. Pour le transfert des nématodes, le volume recommandé du tampon de ne doit pas être dépassé comme la gélose pourrait craquer quand il devient trop humide, les nématodes du donner l’occasion de s’enfoncer dans la plaque. Alors qu’elles ramassaient les échantillons, le tampon M9 devra être glacé pour ralentir le métabolisme des nématodes, en particulier lorsque vous travaillez avec des métabolites ou des substrats qui c. elegans va se dégrader. Il est important de laver l’échantillon soigneusement afin de minimiser toute contamination bactérienne de l’alimentation préalable. Lorsque vous transférez le culot, n’oubliez pas qu’un grand nombre vers pourrait s’en tenir aux pointes de pipette en plastique. La pipette de verre recommandée doit être utilisée, comme pointes de pipette même faible liaison pourraient retenir une grande quantité de l’échantillon. Comme alternative, l’ajout de 0,01 % Triton-X100 M9 dans la mémoire tampon a été précédemment suggéré16. Pour s’assurer qu’aucun défunt c. elegans ou bactéries n’influeront sur les résultats, flottaison de saccharose après que la collection des nématodes peut être effectuée14. Cela se fait habituellement après mise en culture liquide pour retirer le support. Dans cette expérience, ce nettoyage a été omis, parce que le saccharose est métabolisé en glucose et fructose, donc potentiellement confondants nos résultats.
En règle générale, une culture à grande échelle de c. elegans est effectuée à l’aide de milieux liquides. Culture liquide, cependant, n’est pas approprié pour tous les paramètres expérimentaux, surtout lors de l’utilisation des affichages qui nécessitent un nombre exact de nématodes. Une modification de l’appareil de Baerman a été décrit précédemment pour trier et purifier les nématodes issus du milieu de culture liquide17. Cette méthode a considérablement réduit la contamination bactérienne et filtre les nématodes adultes seulement à travers un système de filtre de composants multiples. Cette méthode élégante est limitée par le temps de filtrage depuis longtemps (2-6 h) à la température ambiante, ce qui pourrait confondre des analyses métaboliques. En ce qui concerne la technique de filtrage, les nématodes sont triés par leurs activités mobiles. Nématodes doivent être suffisamment à analyser indépendamment à travers les pores des filtres à partir de différents matériaux. Ainsi, les résultats pourraient être déformées en excluant les nématodes qui sont affaiblis par les traitements expérimentaux.
Combinant des cultures liquides et la plaque dans un seul dispositif expérimental pourrait également servir comme un facteur de confusion dans les analyses ultérieures. C. elegans développe un phénotype plus mince et plus long dans un milieu liquide, rendant difficile la comparaison des paramètres normalisés à la messe, la teneur en protéines, ou corps de longueur et largeur2. En outre, l’étude des substances réactives est difficile dans un milieu liquide, puisque substances réactives seront probablement modifiés ou inactivés par composants media avant d’atteindre les nématodes. Même si des échantillons à grande échelle de c. elegans peuvent être obtenues avec ce protocole, plaque la culture elle-même est plus fastidieuse que la culture liquide. Cependant, il y a certaines façons de faciliter la manipulation (par exemple, avec l’utilisation d’une machine de distribution agar). Une autre option pour promouvoir la culture à grande échelle efficace est l’utilisation des boîtes de Pétri avec un plus grand diamètre pour la production de plaques d’agar. Cette option peut être contrainte par les analyses suivantes. Évaluation microscopique ou plaque de manutention en général, les agréments diminuent avec le diamètre de la parabole.
Des approches multiples de haut débit adaptés pour l’évaluation de différents paramètres, tels que les produits chimiques ou de dépistage des drogues, ont été mis au point et examiné18. Dispositifs microfluidiques permettent aux chercheurs d’étudier les divers paramètres, comme le montre un modèle de diabète de type 2,19. Durée de vie, métabolisme des lipides et les réactions au stress oxydatif peuvent être simultanément évaluées sur un niveau unique-animal, révélant les avantages du dépistage de haute teneur, qui intègre phénotypique des informations biochimiques. L’évaluation de la fiabilité et la reproductibilité de la littérature actuelle a déjà montré un grand raffinement de ces techniques, allant au-delà des études de validation du18. Le caractère abordable, surtout pour les petits laboratoires, reste encore problématique, car les appareils doivent souvent être personnalisé selon les besoins expérimentaux, ce qui peuvent s’avérer coûteux.
La quantification des âges chez c. elegans est compliquée par la cuticule imperméable du nématode. Une méthode couramment utilisée est la détection des âges par immunofluorescence salissures6. En raison de la cuticule, grandes tailles d’échantillons sont nécessaires pour réduire la variance élevée des résultats. L’imagerie doit être pris en considération comme un facteur de temps.
Le protocole pour la préparation de lysat confiné décrit ici âges intracellulaires et autres composants de c. elegans rend accessible aux fins d’analyses. LC-MS/MS mesures d’échantillons de c. elegans ont été effectuées avant14. Les conditions de culture adéquates, cependant, pour atteindre un nombre suffisant de nématodes, n'ont pas été décrites en détail, encore.
La méthode décrite dans le présent protocole est utile pour afficheurs nécessitant une grande échelle, cultivé homogène de la population de c. elegans, ou la combinaison de multiples lectures par expérience. Ceci est particulièrement pratique pour l’étude des maladies multifactorielles complexes comme le diabète et ses complications. Autres approches, telles que le dépistage de haut débit et haute teneur en utilisant les systèmes microfluidiques, sont technologiquement plus avancées et sont en mesure de fournir des données de plus grande taille. Leur application principale sont visibles actuellement en chimique et de dépistage des drogues ou de dépistage génétique pour répondre aux traitements expérimentaux des mutants. Ce protocole permet aux chercheurs à facilement et à moindre coût la taille de leurs projets actuels ou futurs, sans la nécessité d’une adaptation des afficheurs expérimentales actuelles de haut de gamme et, donc, pour minimiser toute perte de temps associées à la mise en place de nouveaux Méthodes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le IRTG 1874 « Complications microvasculaires du diabète » et le CRC 1118 « Métabolites réactifs comme une cause de complications liées au diabète tardive ». Les souches de c. elegans N2 et CL2166 ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH Office de programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
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