Summary
Det här protokollet beskriver en kalibrering-fri metod för att kvantifiera protein homo-oligomerisering in vitro- baserat på fluorescens fluktuation spektroskopi med kommersiella ljus skanning mikroskopi. Rätt förvärvet inställningar och analysmetoder visas.
Abstract
Antal och ljusstyrka är en kalibrering-fri fluorescens fluktuation spektroskopi (FFS) teknik för att upptäcka protein homo-oligomerisering. Det kan användas med konventionella confocal Mikroskop utrustade med digitala detektorer. Ett protokoll för användning av teknik i in vitro- visas med hjälp av ett användningsfall där nummer och ljusstyrka kan ses att exakt kvantifiera Oligomera delstaten mVenus-märkt FKBP12F36V före och efter tillsats av dimerizing drogen AP20187. Vikten av att använda rätta Mikroskop förvärv parametrarna och metoderna rätt data förbehandling och analys diskuteras. Särskilt betonas vikten av valet av fotoblekning korrigering. Här billig metod kan användas för att studera protein-protein interaktioner i många biologiska sammanhang.
Introduction
Protein-protein interaktioner jag n Vitro
Traditionellt, är kristallografi och magnetiska kärnresonans-experiment kombinerat med kryo-elektronmikroskopi (kryoEM) den teknik som valt att exakt beskriva de tredimensionella arkitekturen av proteiner och att härleda deras funktion av granskar deras strukturella Detaljer för hög upplösning. Proteiner, dock är inte statiska strukturer och kan genomgå en mängd konfirmerande förändringar och vibrationer i tid och rum. Därför strukturell information från kristallografiska eller kryoEM data behöver kompletteras med andra tekniker (t.ex., molekyldynamik simuleringar och enda molekyl tekniker): funktionen av ett protein som är relaterad till dess konfirmerande förändringar och interaktioner, och denna information är inte närvarande i en statisk struktur. För att probe för transaktioner inom molekylär dynamik, är tekniker baserat på enda molekyl Forster resonans överföra energi (smFRET) mycket effektiv1. Dessa metoder ska kunna bedöma olika subpopulations av molekyler i komplexa media. Detta är mycket viktigt, eftersom dessa förändringar är snabb och uppstå under förvärv av data (d.v.s., nanosekund till andra intervallet).
Två huvudsakliga metoder är vanligen anställda att påvisa och kvantifiera dessa förändringar: proteiner i lösning och surface-immobilisering. För detektion av Inter molekylära interaktioner och i synnerhet, processen för dimerization induceras av ligander, är smFRET inte alltid det bästa verktyget. Verkligen GRÄMA beror inte bara på avståndet (≈10 nm), men också om inriktningen på de två dipolerna (givare och acceptor, χ2) och överlappningen av givare utsläpp med den acceptor Absorptionsspektra2, men kanske detta sista villkor är mindre under förutsättning att experimentalist kan valde viktigt rätt bandet paret. Särskilt missgynnar av smFRET för avsökning av homo-dimerization kommer från märkning av proteinet av intresse: för Straighta smFRET, dimerization endast kan upptäckas upp till 50% (dvs, hetero-bandet kommer endast att kunna upptäcka givare-acceptor och acceptor-givare homo-dimerer men inte givare-givare eller acceptor-acceptor, som är de andra 50% av dimerer). Användning av fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) och derivat (S.K., etc.3) att fastställa protein diffusion konstanter och bindande konstanter i vitro är ett annat alternativ. Dessa metoder kan inte helt kvantifiera homo-dimerization antingen, som i FCS en åtgärder koncentration och diffusion, och radie och diffusion koefficient av en diffuserande partikel är mycket dåligt beroende av den molekylära vikten; till exempel innebär en 10-faldig ökning i molekylvikt endast en 2.15 faldig förändring i diffusion koefficient4. Vid två-färg FCS eller S.K., kommer endast 50% av homo-dimerer att ses av samma anledning som ovan. Den mest praktiska och kvantitativa metoder för att detektera homo-dimerization in vitro- och in-vivo är homo-bandet5 och nummer och ljusstyrka (N & B)6. Med tanke på faktumen att homo-bandet kräver särskild instrumentation återställning av anisotropi värdet (dvs. optiska element/analysatorer till återvinna den parallella och vinkelräta polariseringen), N & B presenteras här som en god teknik för att upptäcka protein homo-dimerization och aggregering. Det kan vara sysselsatt både in vitro- och in-vivo med en kommersiell set-up.
Antal och ljusstyrka
N & B har varit nyligen granskade7. Granskningen fokuserar på tillämpningen av tekniken i levande celler. Det är värt att återge matematisk formalism här som dessa ekvationer kommer att tillämpas på data som samlats in i vitro. Det första är det nödvändigt att definiera vissa termer och matematiska kvantiteter:
- En entitet är en uppsättning av molekyler som är sammanfogade.
- Den ljusstyrka ε för en entitet är antalet fotoner som den avger per tidsenhet (per bildruta).
- n är antalet enheter närvarande.
- För en viss pixel under loppet av en bild serie är < i > dess genomsnittliga intensitet och σ2 är variansen i dess intensitet.
Sedan, med fotonräknande detektorer och förutsatt att mobila enheter och ingen bakgrund,
där N är den uppenbara nummer och B är skenbar ljusstyrka. Detta resulterar i
Dalal o.a. 8 visade att med analog utrustning, man behöver tre korrektionsuttryck: S factor, bakgrunden offset, och utslaget buller σ02. Sedan igen förutsatt att mobila enheter,
att ge
Observera att ovanstående ekvation för skiljer som ges i Dalal o.a. 8 och en efterföljande omprövning. 7 i Dalal et al. S i nämnaren utelämnades på grund av ett stavfel och felet reproducerades i översynen. Ekvationen ovan är rätta. Instruktioner för mätning av S, offset och σ02 - tillsammans med en förklaring av deras innebörd - ges av Dalal o.a. 8
Den ljusstyrka ε är proportionell mot Oligomera staten sprida enheter: ε kommer vara dubbelt så stor för dimerer som för monomerer, tre gånger så stor för trimerer som för monomerer, dubbelt så stor för hexamers som för trimerer och så vidare. På detta sätt mäta den ljusstyrka ε, kan man kvantifiera någon typ av multimerization.
Om det finns en blandning av Oligomera stater närvarande, antal och ljusstyrka är inte klarar av att återställa enskilda Oligomera stater närvarande. Detta är en begränsning för tekniken.
Detrend algoritm och nandb programvara
Vikten av att korrigera för fotoblekning har betonat tidigare9. Fotoblekning oundvikligen inträffar under ljusmikroskop experiment i time-lapse läget. både i levande celler och in vitro. Många metoder har beskrivits i litteraturen att korrigera för blekning7. Den exponentiella filtrering tekniken med automatisk val av detrending parametern T är den nuvarande bäst. Det är integrerat i fri, öppen källkod programvara nandb9. Faktiskt, programvara som kräver att användaren manuellt välja deras detrending parametern kan leda till felaktiga resultat eftersom denna parameter val kommer sannolikt att vara godtycklig och felaktig. Den automatiska algoritmen inspekterar data och bestämmer lämpliga parametern för det, utan att användaren ingripande9. Även med det bästa valet av utjämnande parameter, detrending har sina begränsningar och fungerar väl bara med fotoblekning procentandelar lägre än 25%, som visas med simuleringar9. Intressant, när du använder den automatiska detrending rutinen, dess riktighet är sådan att man kan arbeta med låg ljusstyrkevärden (även B < 1,01), och därmed låg intensitet, och fortfarande vara tillräckligt exakta för att kvantifiera homo-dimerization.
Fotoblekning orsakar också ett annat problem: förekomst av photobleached fluorophores i en komplex multimer. Detta gör exempelvis en trimer visas som en dimer när en av de tre enheterna i trimer är icke-fluorescerande. Hur och Mueller10 visade hur att rätta till detta och denna korrigering betonades också i en senare översyn7. Nandb programvaran innehåller denna korrigering9.
FKBP12 F36V systemet
FKBP12F36V är ett protein som inte naturligt oligomerize men det är känt att dimerize vid tillsats av AP20187 drogen (colloquially kallas BB dimerizing ligand)11,12. Detta gör det en perfekt testfall för nummer och ljusstyrka: med märkta FKBP12F36V, en fördubbling av Oligomera staten bör observeras vid tillägg av BB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. FKBP12 F36V - mVenus rening
- Omvandla (DE3) pLysS celler med pET22b vektor som innehåller monomerized mänskliga FKBP12F36V12 och N-terminala His6 och mVenus Taggar (vector tillgänglig på begäran). Platta celler på LB agar kompletterad med 50 µg/mL Ampicillin och 34 µg/mL kloramfenikol.
- Överföra transformerade kolonier i 100 mL LB förrätt kultur och växa för 16-20 timmar vid 37 ° C under skakning.
- Späd täta starter kultur (OD600 > 1) 1: 100 i LB medium (2 x 500 mL partier) och växa för 2-3 timmar till OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
- Cool kulturer på is. Inducera med 250 µM IPTG och växa för 16-20 timmar vid 21 ° C, 200 rpm.
- Skörda celler genom centrifugering vid 2000 x g i 20 minuter.
- Återsuspendera pelleten i 40 mL IMAC buffert (20 mM natriumfosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 3 mM Imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol) kompletteras med EDTA-fria proteashämmare (1 tablett per cellpelleten).
- Sonikera celler (500 watt, 20 kHz, 40% amplitud, 9 s på, 11 s off för 15 min) på isen och skörd lösliga material genom centrifugering vid 20 000 x g.
- Överföring lösliga lysate till en kolv och tillsätt 2 mL av harts (se Tabell för material). Inkubera i 1 timme med 105 rpm rotation
Obs: Nickel sepharose kan också användas för detta IMAC steg. - Skörda harts och tvätta med 250 mL IMAC buffert A följt av 500 mL IMAC buffert B (20 mM natriumfosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM Imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol).
Obs: Öka till 50 mM Imidazol om använder Nickel sepharose harts. - Eluera His6-taggade protein med IMAC buffert C (20 mM natriumfosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol).
- Injicera på en storlek uteslutning kolumn (se Tabell för material) jämviktas i 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V har sin peak eluering vid 87.71 mL på kolumnen vi använt.
- Bedöma renhet via SDS-PAGE och pool och koncentrat som krävs.
2. beredning av rundbottnade plattan Array
- Tina den renade FKBP12F36V (eller märkta proteinet av intresse) från-80 ° C.
- Bered en lösning av 100 nM renat FKBP12F36V (medium, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonikera och centrifugera (snabb spinn på 13.000 rpm) för att förhindra bildandet av aggregat.
- Pipettera 100-200 µL till en 8 väl observation kammare med glas botten.
- Lägga till den BB-dimerizer slutliga koncentrationer av 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 och 500 nM12,13.
- Som referens, bereda en lösning av 100 nM mVenus ensam för att utvärdera potentiella aggregering och nederbörd effekter och återställa ett intensitetsvärde för monomeren med samma förvärv inställningar.
3. kalibrering-fri Confocal förvärv
- Starta confocal systemet (figur 1). Något ljus skanning Mikroskop confocal system utrustade med digitala detektorer eller välkarakteriserad analoga detektorer8, och klarar av att hålla en konstant fördröjningstiden för varje pixel som förvärvat skulle fungera.
- Ange sökväg till excitation-beam:
- Slå på 514 nm laser och ställ det på 20-100 nW driva vid utloppet av målet (för FKBP12F36V-mVenus).
- Välj syftet 63X1.4NA eller ett krage korrigering vatten nedsänkning mål utformade för FCS.
- Aktivera en HyD, APD eller kalibrerad PMT detektor. Detektorer kan fotonräknande är att föredra, som i detta fall, beräkning av S, offset och σ02 är onödiga.
- Välj fönstret utsläpp från 520-560 nm
- Ange pinhole 1 luftiga enhet för den motsvarande utsläpp ~ 545 nm.
- Ställ in förvärv på 16 x 16 bildpunkter
- Ange den pixel dwell time tuppehålla mig så att det uppfyller tram >> TD >> tbor, där D är uppehållstid av diffuserande protein och t ram är bildhastigheten. Detta motsvarade att ställa in varaktigheten till ~ 13 µs.
Obs: Vissa kommersiella tillverkare hade skannrar som inte höll dwell-tid per pixel konstant. Denna kontinuitet är avgörande för metoden att arbeta. - Ställ in pixelstorleken på ~ 120 nm.
- Välj xyt förvärv läge och välj antalet bildrutor som ska förvärvas per förvärv och väl (till exempel 5000).
- Om systemet är utrustat med hög genomströmning mode, införa koordinaterna för varje brunn och antalet förvärv per brunn för att automatisera processen.
Obs: Var noga med att säkerställa att förekomsten av en Vattenautomat för om använder en nedsänkning målsättning. - Om systemet är utrustat med ett system för perfusion, Ladda BB lösningen och programmera perfusionen att starta rätt-efter 5000th ramen att utvärdera kineticsen av dimerization medan exempelvis 10.000 bilder.
- Tillsätt en droppe olja i oljeimmersionsobjektivet / vatten om utnyttja en krage korrigering vatten nedsänkning mål utformade för FCS.
- Montera 8 väl observation kammaren i scenen.
- Välj rätt väl och fokusera på lösningen.
Obs: Viktigt: Undvik fokusera nära botten glaset för att undvika reflektion och spridning. När fokusera djupare in i lösningen, koppla bort alternativet automatisk fokus. - Starta förvärvet och spara den resulterande stacken bilder i TIFF-format.
4. detrend och ljusstyrka analys med den R Package nandb
- Som en förbehandling kvalitetskontroll, använda ImageJ14 att ta en titt på bilderna och återställa den intensitet profilen, som visas i figur 2en. Detta är användbart till avgöra huruvida eller inte för mycket fotoblekning har skett. Om det finns för mycket blekning, passar inte data för vidare analys.
Obs: ImageJ kan också vara användbart att konvertera bilder till TIFF från kommersiella format. Programvaran nandb som beskrivs nedan kan endast arbeta med TIFF-filer. - Hämta och installera R och RStudio15,16. Det är bäst att ladda ner och installera R först, sedan RStudio.
Obs: Vad som följer är en beskrivning av hur man använder nandb R-paketet. Kunskap i R-språket krävs inte att använda nandb, men det kommer göra livet lättare. - Installera nandb paketet.
- Öppna RStudio och i konsolen, skriv install.packages("nandb") och vänta tills installationen.
- Lär känna nandb
- Granska de manuella17.
- Granska den inbyggda RStudio hjälpen för olika funktioner. Mest sannolikt funktionen ska användas kommer att använda kommer att vara brightness(). Visa hjälpfilen för denna funktion genom att skriva? Brightness() på konsolen.
- Beräkna ljusstyrka
- Säga en har en bildfil på skrivbordet kallas img001.tif (Observera att 'nandb' endast fungerar med TIFF-filer). Man kan beräkna att bildens ljusstyrka:
b <-ljusstyrka (”~/Desktop/img001.tif”, tau = ”auto”)- Här tilldelas bilden ljusstyrka till variabel b i R. Tau = ”auto” säkerställer att bilden är korrekt detrended före ljusstyrka beräkning. Det vanligaste man kan göra här är att beräkna medelvärdet eller medianen ljusstyrkan i bilden. Man kan göra detta genom att skriva mean(b) eller median(b). Man kan också skriva bildens ljusstyrka på skrivbordet med
ijtiff::write_tif (b, ”~/Desktop/whatever_img_name”)
- Här tilldelas bilden ljusstyrka till variabel b i R. Tau = ”auto” säkerställer att bilden är korrekt detrended före ljusstyrka beräkning. Det vanligaste man kan göra här är att beräkna medelvärdet eller medianen ljusstyrkan i bilden. Man kan göra detta genom att skriva mean(b) eller median(b). Man kan också skriva bildens ljusstyrka på skrivbordet med
- Säga har en mapp full med bilder images_folder på skrivbordet och man behöver beräkna ljusstyrka av dessa bilder och skriva ljusstyrka bilderna som TIFF-filer. Sedan se? brightness_folder(). Här funktionen bearbetas en hela mappen på en gång:
brightness_folder (”~/Desktop/images_folder”, tau = ”auto”)
Detta är särskilt bra för dem som har en programvara som de föredrar att R, eftersom alla filer bearbetas i ett enda kommando, och sedan en kan arbeta med utgång ljusstyrkan TIFF bilder i deras valda programmet ImageJ14 , Python eller något annat.
- Säga en har en bildfil på skrivbordet kallas img001.tif (Observera att 'nandb' endast fungerar med TIFF-filer). Man kan beräkna att bildens ljusstyrka:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detrending och monomer ljusstyrka
När data har förvärvats, kan man börja ljusstyrka beräkningar för att fastställa tillståndet Oligomera av proteinet sevärdheter i lösningen. Även om effekten av blekning i lösning inte kanske lika drastiskt som det kan vara i vivo, intensitet spårningen har fortfarande förmodligen inte stationära menar, möjligen på grund av photophysical effekter relaterade till fluorophore,18 men orsakerna bakom detta inte är helt klarlagda. Detta påverkar beräkningen av ljusstyrkan; När du försöker avgöra monomer-dimer övergångar, är denna aspekt avgörande. Genom att tillämpa automatiskt detrend algoritm för att de data som visas i figur 2en, intensitet tracen korrigeras ordentligt, ger ett mer exakt värde för ljusstyrkan på FKBP12F36V-mVenus i lösning. Innan tillsats av BB, utan detrending, B = 1,026, medan efter detrending, B = 1.005 (figur 2b).
Bestämning av FKBP12 F36V -mVenus monomer-dimer övergångar in vitro-
Sekvenser av 20.000 bilder av renat FKBP12F36V - mVenus i 100 nM lösning förvärvades som anges i avsnittet protokoll. Efter 10.000 bilder förvärvades, lades homodimerizer drogen BB till lösningen samtidigt förvärva. Varje efterföljande rad 5.000 ramar analyserades (figur 3). Den genomsnittliga ljusstyrkan 5 minuter efter BB tillägg var B = 1.010, vilket är en 2-faldig ökning, som anger en FKBP12F36V dimer. Kinetiken för processen visas i figur 3b; fördröjningen mellan BB tillägg till full FKBP12F36V dimerization var ungefär 2 minuter.
Identifiering av protein aggregat
Ett antal protein aggregat har upptäckts både i ett begränsat antal ramar och även i intensitet tracen (figur 4). Dessa aggregat förekommer naturligt i lösning när du arbetar med proteiner och kan elimineras genom sonicating eller öka protein utspädning. Dock i vissa biologiska problem behöver man upptäcka övergångar mellan monomerer och stora aggregat. Figur 4 visar ett exempel där ett FKBP12F36V protein sammanlagda diffust genom observation volymen (bilder 16 x 16); för våra tidigare beräkningar som dessa data kasseras, men visas ett exempel i figur 4 att visa att dessa aggregat kan upptäckas och kännetecknas genom att använda samma inställningar och synsätt. Vid första anblicken, när du utvärderar de 5000 bilderna, man kan återställa den genomsnittliga ljusstyrkan för FKBP12F36V-mVenus behandlas med BB (B = 1.010). Visning av rå ljusstyrka bilden, kan man tydligt se, dock, en region av intresse på cirka 8 pixlar med ett högt värde av B ≈ 1.080. Denna region av intresse sammanfaller med ett fåtal bildrutor vid t = 34-37 s där ett FKBP12F36V aggregat sprids runt området observation. Sammanlagt kvar inte i observation volymen för länge nog att exakt bestämma dess storlek.
Figur 1 . Tillämpningen av N & B att upptäcka protein monomer-dimer övergångar i lösning. (a) förenklad optisk väg av en laser skanning Mikroskop (LSM) utrustad med en laserkälla (inställd på 514 nm vid mVenus märkt proteiner) riktad (blå pilar) mot en nedsänkning mål (i vårt fall en 63X1.4NA olja) lysande en 100 nM lösning av FKBP12F36V-mVenus lösning. Utsläpp fluorescensen (gröna pilar) passerar genom en dichroic spegel och är riktad mot ett bandpassfilter som rengör lampan utsläpp och ett hål på 1 luftiga enhet ligger precis innan en punkt digital detektor kan photon counting. (b) en confocal volym av belysning söks genom 16 x 16 bildpunkter lysande enda FKBP12F36V-mVenus-molekyler som ange och avsluta Gaussisk form confocal volymen producera en rad fluorescens intensitet fluktuationer. (c) bild serie förvärvade med tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Automatisk detrending som behövs för att noggrant mäta en befolkning av monomerer i lösning. (a) en stack av 5000 16 x 16 pixel bilder förvärvades enligt protokollet avsnitt. Intensiteten i den första bildrutan visas tillsammans med den genomsnittliga tid-löst intensiteten profil, som visar länge termen fluktuationer som kan relateras till blekning och andra lösningsmedel och/eller photophysic effekter. Oavsett orsaken för dessa långsiktiga fluktuationer, de påverkar beräkningarna av ljusstyrka och därmed kräver detrending. Utan automatisk detrend, man får B = 1,026, medan efter automatisk detrending, B = 1.005. Även ljusstyrkan utan (vänster paneler, andra raden) och med (höger paneler, andra raden) slät filtrering visas. (b) samma data presenteras i (a) var detrended och resultaten uttryckta med intensitet och ljusstyrka visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . In vitro-N & B är kunna lösa övergången mellan FKBP12F36V monomerer och dimerer i realtid. Tillägg av dimerizer drogen BB resulterade i en två-faldig ökning i sann ljusstyrka direkt efter 2 min (från 0,005 till 0,010 i sann molekylär ljusstyrka). (a) intensiteten i den första bildrutan visas tillsammans med den genomsnittliga intensitet profilen av detrended bilden. Ljusstyrka utan (vänster paneler, andra raden) och med (höger paneler, andra raden) slät filtrering visas. (b) menar ljusstyrka ritas (varje 5000 ramar) använder den sanna molekylär ljusstyrka ε. Dimerization uppstår 2 minuter efter BB tillägg (t = 1 min) vid t = 4 min. Monterade kurvan är en sigmoidal funktion att betona tendensen till dimerization efter tillsats av dimerizer drogen (BB). Felstaplar representera standardfelet för spridning av ljusstyrka vid varje tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . In vitro-N & B att lösa storleken på protein aggregat i lösning. a tid-löst intensitet detrended spår för förvärvet av FKBP12F36V-mVenus visas tillsammans med ljusstyrka bilder (andra raden). (b) tid-löst detrended intensitet spåret visar högst intensitet som är markerad med en röd streckad cirkel (övre vänstra panelen). Ramen för första intensitet som motsvarar just denna tid (t = 34 sekunder) visas och en röd pil visar en FKBP12F36V-mVenus samlade in området belysning. En närmare titt in i utjämnade ljusstyrka bilden visar en region av intresse som innehåller hög Oligomera staterna och resten av bilden innehåller en blandning mellan monomerer och dimerer med ett genomsnitt på B = 1.008. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B är en teknik för att upptäcka multimerization med kommersiella ljus skanning confocal Mikroskop utrustade med digitala detektorer. Detta tillvägagångssätt är ganska attraktivt jämfört enda punkt FCS, S.K. och smFRET eftersom det är kalibrering gratis och ljusstyrka beräkningen är okomplicerad och koncentration oberoende6. Det är av stor vikt, dock att korrigera för blekning och långsiktiga intensitet fluktuationer innan du utför ljusstyrka beräkningar9. en liten ökning av ljusstyrkan på grund av blekning och andra artefakter kan misstolkas som en förändring i Oligomera tillstånd (som kan ses i figur 2en) om detrending är försummat eller felaktigt utfört. Användningen av automatiskt detrend algoritm möjliggör korrekt ljusstyrka beräkningar.
Det är viktigt att följa ett antal regler när förvärva bilderna. Först, uppehållstid av molekylerna i confocal volymen, och därmed deras diffusion konstant bör vara känt för att ställa in rätt parametrar av confocal systemet; uppehållstid av märkta molekyler behöver vistas mellan pixeln uppehålla mig tid och ram tid7. Att välja rätt fluorophore är avgörande. En ljus och stabil fluorophore är nödvändigt för bra signal till brus och minimal fotoblekning. Lasereffekt bör hållas relativt låg för att undvika blekning. Photon räkningarna av 1 eller 2 per pixel är tillräckliga. Att hålla räknas låg är också avgörande att undvika detektor pile-up. Tekniken klarar låga photon budgetar bättre än vad det klarar med blekning. MVenus har varit anställd i detta protokoll; vilket är en relativt ljus fluorophore, jämförbar med andra19. Ett alternativ är att använda nanoboosters som är selektivt riktade ett fluorescerande protein. dessa kan vara mycket ljusare än traditionella fluorophores20.
När det gäller hårdvara, digitala fotonräknande detektorer underlätta kvantifiering, men N & B är möjligt med analoga detektorer, förutsatt att man har återhämtat sig vissa förvärv parametrar. 8
Även om andra metoder som anisotropi kan upptäcka homo-dimerization, med tillkomsten av ny programvara för att förenkla analys, står N & B ensam som en tillgänglig metod att påvisa och kvantifiera proteininteraktioner och oligomerisering, båda in vitro- och i levande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete har stötts av Wellcome Trust bevilja R.N. 105278/Z/14/2 Wellcome Trust Centre for Human Genetics finansieras av Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2. Arbetet i gruppen C.S. stöds av Cancer Research UK (C20724/A14414) och Europeiska forskningsrådet under EU: s Horizon 2020 forskning och Innovation-programmet Grant 647278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
- Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. , (2017).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
- Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. , (2017).
- Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
- Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
- Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. , (2017).
- RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. , (2016).
- Nolan, R. nandb R package. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
- Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).
