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Biochemistry

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Published: August 20, 2018 doi: 10.3791/58167
Automatic Translation
1,2,3, 2, 1,3, 3, 2, *4, *1,3
1Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Munich University of Applied Sciences, 2FG Protein Biochemistry & Cellular Microbiology, Munich University of Applied Sciences, 3Center for Nano Science, Ludwig-Maximilians-Universität München, 4Klinik für Unfallchirurgie, Orthopädie und Plastische Chirurgie, University Medical Center Göttingen
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Abstract

En los últimos años, microscopía de fuerza atómica (AFM) basado en espectroscopia de fuerza sola molécula (SMF) ampliada nuestra comprensión de las propiedades moleculares y funciones. Nos dio la oportunidad de explorar una multiplicidad de mecanismos biofísicos, por ejemplo, cómo bacteriana adhesinas atar a receptores de superficie de host más detalladamente. Entre otros factores, el éxito de los experimentos de SMF depende la inmovilización funcional y nativa de las biomoléculas de interés sobre las superficies sólidas y puntas de AFM. Aquí, describimos un protocolo sencillo para el acoplamiento covalente de las proteínas a las superficies de silicio utilizando silano-PEG-carboxyls y la química de N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) establecida en orden para explorar la interacción de la adhesina de pilus-1 RrgA la bacteria grampositiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) con la matriz extracelular proteína fibronectina (Fn). Nuestros resultados muestran que la funcionalización superficial conduce a una distribución homogénea de la Fn en la superficie de vidrio y a una concentración adecuada de RrgA en la punta del voladizo AFM, evidente por el valor objetivo de hasta un 20% de los eventos de interacción en SMF mediciones y reveló que RrgA se une a Fn con una fuerza media de 52 pN. El protocolo puede ajustarse a la pareja a través de sitio específico libre grupos tiol. Esto resulta en una orientación predefinida de proteína o molécula y es adecuado para otras aplicaciones biofísicas además las SMF.

Introduction

Al lado de pinzas ópticas y magnéticas, la fuerza atómica (AFM) de microscopio1,2 ha surgido como una herramienta útil para analizar y manipular moléculas y probe sus propiedades y funciones, incluyendo su respuesta a la fuerza externa3 ,4. En cambio métodos como el enzima del inmunosorbente enlazado ensayo (ELISA), superficie de resonancia de plasmon (SPR) o cristal de cuarzo las configuraciones de microbalanza (QCM), AFM permite medir las interacciones a nivel de célula única (FCE)6 y sola molécula (SMF)5 . Estas tecnologías dado información valiosa sobre mecanismos vinculantes como los bonos de captura para la interacción de e. coli proteína pilus que fimh con manosa7, o el tándem β-cremallera repite formada por proteínas de unión de Fn de S. aureus en enlace a Fn8. Recientemente pudimos demostrar que la adhesina de pilus-19,10 de la bacteria grampositiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 es capaz de unirse a fibronectina12 RrgA con sus dos dominios terminales. Esto reveló un nuevo mecanismo de unión de dos dominios que difiere el tándem β-cremallera y puede permitir que los neumococos piliated formar y mantener un host contacto que contiene fibronectina transitoria superficies13.

El éxito de los experimentos de SMF depende críticamente de la inmovilización funcional y nativa de las biomoléculas en las superficies sólidas y puntas de AFM. Como las fuerzas altas pueden ocurrir durante las mediciones de la SMF, las proteínas deben preferiblemente covalente acoplarse a la superficie. Hay un gran número de métodos de acoplamiento para la inmovilización de proteínas y otras biomoléculas, así como células enteras en superficies sólidas (inorgánicas), nano-partículas y aparatos descritos en la literatura14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Estos protocolos suelen hacen uso de sustancias peligrosas, son difíciles de realizar y requieren de equipo especial (por ejemplo, limpiador de plasma). Una manera simple de moléculas de pareja al vidrio es adjuntar una capa más gruesa del polímero de heterobifunctional reticulados con un grupo silano reactivo en un lado y un grupo amina reactiva en su otro lado. Dependiendo de la aplicación, pueden constar de los agentes de acoplamiento flexibles hidrocarburo cadenas de longitud variable, por ejemplo., polietilenglicol (PEG). Suprimir las interacciones no específicas de las superficies modificadas (por ejemplo, hidrofóbicas, electrostáticas e interacciones de van-der-Waals) y puede proporcionar la libertad rotacional de la molécula acoplada.

Aquí, describimos un protocolo general para el acoplamiento covalente de las proteínas que contienen uno o más grupos amino libres (-NH2) superficies de vidrio y puntas de nitruro de silicio AFM vía un heterobifunctional etoxi silano-PEG-carboxilo (-COOH). Este protocolo se puede utilizar en experimentos de SMF, que ejemplo es basados en la interacción de la proteína de matriz extracelular Fn y RrgA (ver figura 1 para un resumen).

El primer paso es la silanización de la superficie28,29,30,31. Consiste en la hidrólisis de los grupos etoxi del agente de acoplamiento para formar grupos de SiOH altamente reactivos. Estos pueden reaccionar con los grupos de SiOH sobre el sustrato. En una condensación primaria paso, estos enlaces de hidrógeno de forma silanoles y difunda en el sustrato. En una reacción de condensación secundario (que requiere generalmente calor o vacío para eliminar el agua), se forman enlaces siloxano. Esto resulta en una capa de silano de organo covalentemente unido.

El segundo paso es el acoplamiento de las proteínas a la funcional (-COOH) grupos que se extienden desde el polímero32. En primer lugar, se convierte el ácido en un éster N-hydroxysuccinimid (NHS) reactivo intermedio, que es adquirido a través de la NHS/EDC bien establecida (1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimid química33 y se somete a sustitución nucleofílica para finalmente formar un enlace amida con aminas primarias de las proteínas.

De esta manera, RrgA fue junto a puntas de AFM de nitruro de silicio y humano Fn a substratos de vidrio en una orientación al azar y se analizaron sus fuerzas de interacción en el nivel de molécula única. Nuestros resultados demuestran que la química superficial descrita conduce a una distribución homogénea de la Fn en la superficie de vidrio y a una concentración adecuada de RrgA en la punta, evidente por el valor objetivo de un 20% de los eventos de interacción durante las mediciones de SMF. Esta química reduce las interacciones de fondo no específica, está sujeto a poca alteración durante la adquisición de datos y por lo tanto ideal para experimentos precisos de SMF.

Protocol

1. inmovilización de proteínas a través de agentes de acoplamiento de silano funcional

Nota: La figura 1 presenta un resumen sobre la química de superficie aplicada en el presente Protocolo.

PRECAUCIÓN: En el siguiente protocolo, se utilizan diversos productos químicos corrosivos y piel irritante propiedades. Adecuada (resistente al ácido) guantes, gafas y abrigo de laboratorio y trabajar bajo campana extractora preparando soluciones para evitar la inhalación de los vapores.

  1. Funcionalización de superficies de vidrio y voladizo de nitruro de silicio con agentes de acoplamiento de silano
    1. Eliminar el polvo grueso y contaminaciones de portaobjetos de vidrio con isopropanol y precisión pelusa limpia y cortar las diapositivas en tamaño deseado (opcional).
      Nota: Al lado de cristal, la superficie sólida puede ser sílice, cuarzo y óxidos de aluminio, cobre, estaño, titanio, hierro, cromo, circonio, níquel y zinc.
      Atención: Corte las laminas de vidrio puede causar bordes afilados.
    2. Lugar el vidrio se desliza en una jarra de tinción lleno de ácido clorhídrico (33% HCl) diluido con agua bidestilada (ddH2O) 3-5% (v/v), cerrar el frasco con la tapa correspondiente y colocarlo en un baño ultrasónico durante 90 minutos a temperatura ambiente.
      Nota: El frasco usado tiene un diámetro de 6 cm y un tamaño aproximado de 65-70 mL. Es de un volumen adecuado del ácido clorhídrico diluido para el tarro de 50 mL que contiene 5 mL 33% HCl y 45 mL de ddH2O. El HCl efectivamente elimina los iones del metal no vinculante, sobre todo sodio, potasio y calcio y el silicio reduce para producir una superficie de vidrio saturada de hidróxido.
      PRECAUCIÓN: el ácido clorhídrico es corrosivo e irritante de la piel. Guantes resistentes a los ácidos adecuada, gafas de seguridad y laboratorio de la capa y trabajan bajo campana extractora mientras se prepara la solución para evitar la inhalación de los vapores.
    3. Coloque el nitruro de silicio AFM voladizo sondas en un portaobjetos limpio de vidrio con la punta hacia arriba e irradiar con luz desde arriba por al menos 90 min ultra violeta.
      Nota: Para espectroscopia de fuerza sola molécula, voladizos con una constante de resorte nominal de 0,01 a 0,1 N m-1 son adecuados. Irradiación de la superficie del macetero con luz UV se eliminar los contaminantes orgánicos, principalmente sustancias grasas y hacerla hidrofílica en un lado. Si el otro lado se contamina pesadamente - que no debe ser el caso, o si las sondas del voladizo se utilizan frescas fuera de caja de los proveedores - puede afectar la medición de SMF. Una limpieza profunda de la viruta de todo voladizo usando solución de piraña, que se ha utilizado en muchos estudios34, puede ayudar.
      PRECAUCIÓN: La luz ultravioleta es perjudicial para los ojos; por lo tanto, la irradiación de las sondas de voladizo debe llevarse a cabo en una cámara impermeable luz UV. Solución Piraña es altamente reactivo y puede quemar la piel, papel y otros materiales orgánicos. No utilice recipientes de plástico. Si se coloca en platos o recipientes incluso con pequeñas cantidades de contaminación superficial orgánica (por ejemplo, del uso anterior), puede reaccionar rápidamente.
    4. Reemplazar el ácido clorhídrico en la jarra de tinción con ddH2O sin dejar que la superficie seque y vuelva a colocar el frasco en el baño de ultrasonidos durante otros 10 minutos reemplazar el agua dos veces más de 10 minutos respectivamente lavar correctamente el clorhídrico ácido.
    5. Mientras tanto, disolver ácido etoxi (o metoxi) de glicol de polietileno por silano (Si (OC2H5)3-clavija-COOH) en una mezcla de etanol y ddH2O (v/v 95% / 5%, pH 4.6 ajustado con ácido acético) a una concentración final de 0,1 mg mL -1. Almacenar la solución herméticamente sellada para evitar la evaporación del etanol.
      Nota: Agentes de acoplamiento de silano son sensibles a la humedad y temperatura. Por lo tanto, deben ser almacenados bajo gas inerte (N2), a baja temperatura (-20 ° C) y bajo condiciones secas. Antes de abrir el frasco, asegúrese de que los silanos han alcanzado temperatura para minimizar la hidratación y estabilización de grupos reactivos. Agentes de acoplamiento Heterobifunctional PEG están disponibles con numerosas espaciador diferentes longitudes y diferentes grupos funcionales. Al azar inmovilización de proteínas a través de sus grupos aminos libres (NH2), como se describe en este protocolo, el grupo funcional adicional a la silano etoxi/methoxy deben ser un éster de NHS. Al lado de la compra de un agente de silano con éster de NHS, una forma sencilla de obtener tal ester NHS es activar un grupo carboxilo (-COOH) con 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) y NHS (ver 1.2.1. y 1.2.2.).
      PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable e irritante de la piel. El ácido acético es inflamable y corrosivo. Tenga cuidado de no para conseguir silanos reactivos sobre la piel o en ojos. Guantes adecuados, gafas de seguridad y laboratorio de la capa y trabajan bajo campana extractora para evitar la inhalación de los vapores.
    6. Vierta la solución de silano en dos placas de Petri separadas, las sondas de voladizo preparado y portaobjetos en una placa de Petri respectivamente, sellar herméticamente (por ej., parafilm) para evitar la evaporación del etanol e incubar inmóvil durante 90 minutos a temperatura de ambiente.
      Nota: El tamaño óptimo de la placa de Petri depende el número de sondas de voladizo y el tamaño de las diapositivas de cristal que debe ser funcionalizados. Un tamaño de diámetro para el buen manejo y el volumen de reactivo bajo es de 50-60 mm. Para evitar la flexión indeseada de la micropalanca mientras penetra a través de la interfaz de aire agua el voladizo se celebrara en un ángulo de 90° a la interfaz aire-agua. Opcionalmente se puede realizar la incubación de los portaobjetos de vidrio (pero no las sondas de voladizo) en un agitador orbital.
    7. Enjuague los portaobjetos vidrio y voladizo en tres vasos consecutivos que contengan etanol puro a lavar completamente los compuestos de silano.
      Nota: Para evitar la flexión indeseada del voladizo mientras penetra a través de la interfaz de agua del aire, el voladizo se celebrara en un ángulo de 90°.
    8. Coloque el portaobjetos funcionalizados en la jarra de tinción y el voladizo en un portaobjetos de vidrio limpio y cura a 110 ° C durante 30 minutos.
      Nota: Curado con calor induce la formación de enlaces covalentes siloxano y el retiro del agua. Como los portaobjetos fueron funcionalizados sólo por un lado, asegúrese de indicar correctamente el lado revestido.
    9. Almacenar las muestras de vidrio silanizada y sondas de voladizo en un desecador de vacío durante una semana.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
  2. Al azar inmovilización de proteínas en voladizo de nitruro silicio y vidrio silanizada
    Nota: Para evitar la flexión indeseada del voladizo, la sonda de voladizo se celebrara en un ángulo de 90° mientras penetra cualquier interfaz aire-agua.
    1. Preparar una solución que contiene 42 mg mL-1 de EDC y 20 mg mL-1 NHS en estándar tamponada de fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
      PRECAUCIÓN: EDC es corrosivo e irritante de la piel y puede causar daño ocular grave. Use guantes adecuados y gafas de seguridad capa de laboratorio.
    2. Cubrir el portaobjetos de vidrio silano cubierto con la solución y silanizada voladizo sondas en una gota de la solución EDC/NHS e incubar 10 min a temperatura ambiente.
      Nota: Para la incubación de las sondas de voladizo, la caja original del voladizo es conveniente. Para acoplar las proteínas a través de sus grupos aminos libres a los carboxyls (-COOH) de los agentes de silano-PEG heterobifunctional, el grupo - COOH se activa con la química EDC/NHS ampliamente utilizada. EDC parejas NHS al ácido carboxílico, formando un éster de NHS "estable" que permite la eficiente verbal a aminas primarias a pH fisiológico en un siguiente paso.
    3. Enjuague los portaobjetos voladizo y vidrio con PBS en tres vasos consecutivos para lavar completamente excesiva EDC/NHS.
      Nota: Este paso de lavado es crucial como quedan las proteínas de la reticulación EDC/NHS puede y así alterar su funcionalidad.
    4. Incube los portaobjetos de vidrio activado con y el voladizo sondas en una gota de la solución de la proteína deseada en una cámara húmeda a temperatura ambiente. El tiempo de incubación y la concentración de proteína debe ser adaptado para cumplir los requisitos del experimento. En general, una concentración entre 0.5 a 1 mg mL-1 e incubación tiempos de 30 min a 2 h son adecuados para la mayoría de las proteínas. En el caso de punta de pilus-1 proteína RrgA (en voladizo) y fibronectina (sobre portaobjetos de vidrio), una concentración molar de 1,5 μm y 3 μm, respectivamente y un tiempo de incubación de 2 h son suficientes.
    5. Lavar los portaobjetos de vidrio y voladizo sondas completamente con PBS en tres vasos consecutivos para lavar proteínas.
    6. Saturar el éster restante del NHS con tris (hidroximetil)-aminomethan colocando las puntas de prueba en salina tamponada con tris (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) por 20 min a temperatura ambiente.
      Nota: Este paso reduce indeseado acoplamiento covalente de proteínas entre la superficie funcionalizada de la punta AFM y el vidrio, porque los grupos aminados de Tris pueden enlazar a los restantes grupos COOH activados en la superficie del macetero y sustrato.
    7. El voladizo sondeos completamente con PBS y tienda en distintos platos de Petri cubiertas en PBS hasta su uso y lave los portaobjetos de vidrio.
      Nota: Las muestras deben ser preparadas recién y utilizan el mismo día.

2. microscopía de fuerza atómica basada espectroscopia de fuerza sola molécula

Nota: En este trabajo, se utilizó un microscopio de fuerza atómica de JPK Instruments y el sistema de ups para obtener las curvas de fuerza-distancia se definió con la fuerza de RampDesigner.

  1. Calibración de voladizo con el método de ruido termal35
    Nota: Para la calibración de voladizo, siga los pasos en el manual del fabricante. Más voladizo estado proveedores una constante aproximada de primavera, que generalmente se calcula de la forma nominal voladizo (longitud, anchura, espesor) y por lo tanto no es muy confiable. Como la constante de resorte correcto es crucial, es recomendable llevar a cabo la calibración de voladizo que se describe a continuación por triplicado y utilizar los valores promedio de sensibilidad de la palanca óptica y constante del resorte. Puede ser útil registrar la deflexión del cantilever en voltios (V) durante el experimento y convertir a la fuerza (pN) luego, utilizando la sensibilidad óptica palanca y resorte constante significa valores. La sensibilidad de la palanca óptica y constante de resorte se puede determinar antes o después del experimento, siempre y cuando no se cambia la posición del láser en el voladizo (se puede reajustar la posición del láser reflejado sobre el fotodiodo).
    1. Fijar un portaobjetos de vidrio limpio y fresco en el portamuestras AFM y cubrirla con tampón PBS.
      Nota: La calibración debe llevarse a cabo sobre una superficie dura (por ejemplo, vidrio) y en el mismo buffer como los experimentos reales.
    2. Fijar la sonda voladizo preparado en el soporte de voladizo, coloque en la cabeza AFM y mojado con cuidado el voladizo con una gota de tampón PBS.
      Nota: La adherencia de soldadura del voladizo reduce la tensión superficial durante la penetración en el tampón de PBS sobre el portaobjeto de calibración y doblar tal modo indeseable del voladizo.
    3. Mueva lentamente el voladizo hacia la superficie de calibración hasta que el voladizo se sumerge completamente en el tampón de PBS, pero todavía lejos de la superficie de la calibración.
    4. Utilizar el microscopio óptico la vista superior de la AFM o (si está disponible) el microscopio invertido por debajo de la AFM para posicionar el laser de la AFM en la parte trasera del voladizo. Coloque el láser punto cerca del extremo del voladizo cerca de donde se encuentra la punta.
      Nota: El foco del láser debe estar ubicado cerca del extremo del voladizo, pero todavía debe estar totalmente en voladizo. Si no hay microscopio óptico está disponible, utilice un trozo de papel para diodos de láser visible o una tarjeta de detector láser de diodos de láser infrarrojos, ponerlo debajo del cabezal AFM y mover el foco del láser hacia el borde del voladizo-chip, donde se encuentran los voladizos , hasta el punto en la tarjeta de papel o detector. Luego mueva el láser paralelo al borde. Cuando desaparece el punto, es en un brazo en voladizo. Para voladizos lineales, mover el punto hacia el final de la palanca hasta que aparezca en la tarjeta de papel/detector y mover hacia atrás hasta que quede otra vez en el brazo de palanca (desaparece de la tarjeta de papel). Para triangular el lugar en el centro entre dos brazos del voladizo y muévala hacia el extremo del voladizo, hasta que desaparece de la tarjeta de papel. Comprobar que está en medio de la micropalanca moviendo el punto perpendicular al eje largo del voladizo.
    5. Ajuste la posición del cuatro cuadrante detector fotodiodo de la AFM de tal manera que el rayo láser reflejado es colocado en el centro del fotodiodo.
      Nota: Siga estos pasos: Utilice los tornillos de micrómetro cerca el diodo detector para mover el diodo en horizontal y en dirección vertical, hasta que la señal de la suma de los cuatro cuadrantes se maximiza. Luego mueva el diodo en la dirección vertical, hasta que la señal de deflexión vertical es cero y el diodo se mueven en dirección horizontal, hasta que la señal de deflexión lateral es cero. Voladizos de nitruro de silicio generalmente tienen una capa del oro y por lo tanto un bimetal con dos coeficientes diferentes de expansión térmica. Esto resulta en una deriva térmica (aparente en la señal de deflexión vertical) especialmente en solución. Para reducir esta deriva durante las mediciones, que todo el sistema equilibre durante unos minutos antes de iniciar la calibración.
    6. Abra el administrador de calibración en el software AFM y calibrar la sensibilidad de voladizo y la constante elástica del voladizo con el método de ruido termal como sigue.
    7. Acercarse a la superficie del sustrato y registrar una curva de fuerza-distancia.
    8. Determinar la sensibilidad de la palanca óptica en nm/V ajustando una línea recta a la parte más escarpada de la curva de la fuerza de contracción, donde la punta está en contacto con la superficie del sustrato. La sensibilidad permite convertir la constante de resorte voladizo a pN/nm.
      Nota: La pendiente de la curva de contracción es el piezo viajar distancia vs. el cambio en voltaje de fotodiodo (medido en nm/V).
    9. Grabar varios espectros de ruido térmico del voladizo con el voladizo aproximadamente 100 μm o más lejos de la superficie con el fin de excluir cualquier superficie de amortiguación.
    10. Determinar la constante elástica del voladizo en el pN/V instalando un oscilador armónico, proporcionado por el software AFM para los espectros de ruido térmico.
    11. Poco a poco retraer el voladizo y retirar de la solución.
    12. Sustituir la superficie de vidrio utilizado para la calibración de voladizo con la superficie de la muestra que contiene las proteínas inmovilizadas. Asegúrese de que el voladizo y la superficie de la muestra (y de tal modo las proteínas) no se seque mientras se cambian las diapositivas de cristal.
  2. Experimentos en el nivel de proteína solo de la fuerza de interacción
    1. Mueva lentamente el voladizo húmedo hacia la superficie de la muestra hasta el voladizo está cubierto completamente por tampón PBS pero todavía lejos de la superficie del sustrato.
      Nota: Para reducir la deriva térmica durante el experimento, que todo el sistema establecido durante unos minutos antes de iniciar las mediciones de espectroscopía de fuerza.
    2. Acercarse a la superficie y grabar múltiples curvas de fuerza-distancia (≥ 500) en diversas localizaciones de la superficie de la muestra, con una fuerza de contacto de pN 250, un tiempo de contacto de 1 s, una longitud de contracción de 2 μm y una velocidad de retracción de 1 μm s-1.
      Nota: Para ajustes de espectroscopia de fuerza general, seguir el manual del fabricante. Variaciones: La velocidad puede variar entre 0.1 y 5 μm s-1 para calcular datos cinéticos dependiendo de la carga cada vez mayor de la fuerza. El tiempo de interacción se puede variar para analizar tiempo fortalecimiento de vínculo dependiente. En lugar de mantener la velocidad constante, se puede tener la fuerza constante (modo de pinza de fuerza).
  3. Análisis de datos
    Nota: Análisis de datos se realizó utilizando el software de procesamiento de datos. Dependiendo de las proteínas inmovilizadas, el tiempo de contacto o la velocidad de contracción, si constituyó una huella o no y otros parámetros variable, las curvas de fuerza-distancia indicaciones múltiples diferentes. Interpretación y análisis de datos pueden variar considerablemente entre diferentes experimentos de SMF y por lo tanto no pueden ser descritos en detalle aquí. En cuanto a la interacción de RrgA y Fn, el siguiente protocolo puede ser un primer paso para el análisis de los datos SMF.
    1. Abrir los archivos de la curva de fuerza medidos seleccionando el icono Abierto lote de obligar a escanear y procesar las curvas de fuerza-distancia como sigue:
    2. Convertir la deflexión del cantilever (V) a la fuerza directamente proporcional (F) seleccionando el icono de (Re) calibrar la deflexión V por la constante de resorte y ajuste de sensibilidad .
      Nota: Si voladizo calibración se llevó a cabo antes del experimento, los valores se guardan en los archivos de exploración de fuerza y se utilizan automáticamente durante la calibración de la desviación del V. Si la calibración se llevó a cabo después de la experiencia, el software utiliza los valores por defecto, que pueden ser cambiados a los valores medidos.
    3. Reste la línea base de la canal de retracción en una región de la curva de fuerza lejos de la superficie para establecer el nivel de fuerza cero seleccionando el icono Línea base resta.
      Nota: En algunos casos, la retracción puede no tener el mismo valor de fuerza constante y la curva podría mostrar una inclinación lineal, que puede eliminarse seleccionando Offset + inclinación.
    4. Definir el punto donde la punta entra en contacto con la muestra seleccionando el icono de Determinación de punto de contacto .
    5. Convertir la señal de la altura a la separación de la punta-muestra seleccionando el icono de Muestra de punta de separación . Además de restar la posición del punto de contacto, este procedimiento resta el voladizo de flexión para calcular la distancia entre la superficie del sustrato y punta de AFM.
      Nota: Para el montaje de modelos elástico polímero, como el modelo extensible de gusano-como cadena y la determinación de longitudes de la interacción, la separación de la muestra de punta, que se corrige para la flexión del cantilever, es necesaria. Para determinar la fuerza de carga del índice de la pendiente de la curva de la fuerza y la velocidad z-piezo, deben utilizarse las curvas de fuerza sin corregir.
    6. Los rastros de la fuerza-distancia para picos de fuerza que ocurren en las longitudes de ruptura por encima de 70 nm (longitud del espaciador PEG estirado)36 resolver interacciones no específicas y aplicar el modelo de gusano-como cadena extensible a los picos seleccionados mediante la selección de la pantalla el Icono de ajustar un modelo de la cadena de polímero y eligió el Extensible gusano-como cadena modelo. Los picos en la curva de la fuerza de contracción se instalarán con este modelo y se obtienen longitudes y fuerzas de ruptura, junto con los parámetros elásticos del polímero.
    7. Mostrar los datos como histogramas que muestran las distribuciones de fuerza y longitud. Utilizar al menos 100 eventos de desvinculación de los histogramas.

Representative Results

El protocolo había descrito aquí resultados de una inmovilización covalente de las proteínas a través de sus aminas primarias accesibles con orientación al azar (figura 1). Figura 2 muestra una imagen AFM de una superficie de vidrio silanizada con (izquierda) y sin (derecha) Fn inmovilizada, grabado después de la deshidratación de las muestras bajo una corriente suave de nitrógeno. La capa de polímero del silane muestra sólo pequeñas corrugaciones superficiales con una altura de aproximadamente 2-5 nm (figura 2, derecha), mientras que en la superficie funcionalizada con Fn, aproximadamente 10 nm alta Fn moléculas son evidentes (figura 2, izquierda). En primeros planos, se puede reconocer la estructura dimérica del Fn. Las moléculas de Fn parecen ser compacto, con una altura de 4-5 nm por encima de la capa superficial de la PEG con una longitud de ~ 120 nm (ver insertos).

Para investigar las fuerzas de interacción de RrgA con Fn, que recientemente fue descrita en detalle por nuestro grupo13, RrgA fue acoplada a una punta AFM de nitruro de silicio y humano Fn para el substrato de cristal (figura 3a). Consejo representativo la figura 3 muestra las curvas de separación de la muestra de la interacción de RrgA con Fn grabado a una velocidad de tracción de 1 μm s-1. La química de superficies usada conducido a una interacción de bajo fondo y eventos bien en forma individual (o doble) interacción (figura 3a), que fueron cabidos con un gusano extensible como modelo de la cadena (eWLC) (curvas rojas). Trazar los resultados del ajuste (fuerza de ruptura y longitud, ver figura 4) muestra que después de superar la interacción superficial inespecífica entre Punta AFM y sustrato y estirar los enlazadores de PEG (> 70 nm), hasta ~ 19% de las curvas de fuerza presentó ruptura eventos con una ruptura media fuerza para RrgA - interacción de Fn de ~ 52 pN en una punta-muestra distancias de unos 100 nm. En contraste, una química superficial inaplicable (aquí, amortiguamiento omitida con Tris amortiguada salina figura 3b) obstaculizará una evaluación clara de los eventos de interacción único debido a las interacciones inespecíficas, múltiples proteína vinculante (trace 2 y 3) o acoplamiento covalente de proteínas entre la superficie de la muestra y la punta AFM voladizo. Esto nos lleva a las fuerzas de ruptura alta (trace 1) posiblemente acompañadas por el despliegue de los dominios de la proteína (Fn) (rastro 4 y 5).

Figure 1
Figura 1: Resumen sobre la química superficial. La hidrólisis de etoxi silano-PEG-carboxilo es seguida por su condensación en la superficie hidratada y la formación de reticulaciones de siloxano. La reacción de EDC con los grupos carboxilo resulta en un reactivo o- acylisourea, un intermedio reactivo amina con una vida media muy corta en solución acuosa (hidrólisis). El intermedio es estabilizado por la formación de un éster de NHS que se somete a sustitución nucleofílica para finalmente formar un enlace amida con aminas primarias de las proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Inmovilización de fibronectina en un cristal substrato vía heterobifunctional etoxi silano PEG agente del acoplador del carboxilo. Superficies de imágenes AFM de vidrio funcionalizado con (izquierda) y sin (derecha) FN números indican las moléculas individuales del Fn, que se distribuyen homogéneamente en la superficie del sustrato (insertos). Las moléculas adoptan una estructura dimérica y compacta con una altura de 4-5 nm por encima de la clavija de capa y una longitud de > 100 nm. Esto se asemeja a la estructura del Fn en la solución y es consistente con los datos anteriores AFM en otras superficies, por ejemplo, la mica (barra de escala de incrustaciones = 500 nm)37. Por debajo de la AFM imágenes son perfiles de altura a lo largo de la línea indicada en las imágenes AFM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: ilustración de un experimento de SMF y el representante de la fuerza las curvas de distancia de RrgA - interacción Fn. (a) RrgA y Fn fueron covalentemente enlazados por el silano de etoxi heterobifunctional PEG agente del acoplador del carboxilo a un nitruro de silicio AFM voladizo de punta y una superficie de vidrio, respectivamente. Representante SMFS distancia se muestran curvas obtenidas de RrgA - interacción Fn a una velocidad de retracción de 1 μm s-1 con la inmovilización descrita de RrgA y Fn de la fuerza. Curvas de rojo representan los ajustes extensible gusano-como cadena para obtener longitudes y fuerzas de ruptura. Se ha modificado la figura de Becke, et al., ACSnano 201813. (b) el representante SMFS fuerza curvas de distancia obtenidas de RrgA - interacción Fn sin amortiguamiento con tampón Tris salino. En este caso, la amina primaria de Tris estuvo ausente por lo que permanecen activos ésteres NHS quedaron insaturados durante el experimento. Esto condujo a múltiples proteínas vinculantes (trace 2 y 3) y la fijación de proteínas entre la superficie y la punta AFM que dio lugar a la ruptura alta las fuerzas de dominio acompañado por (Fn) despliegue (rastro 1, 4 y 5; tenga en cuenta las diferentes escalas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: distribución de fuerza y longitud de RrgA sola - interacciones Fn. Ruptura fuerza y correspondientes histogramas de longitud de ruptura de RrgA - mediciones de la interacción de funciones Fn (n = 1400) a una velocidad de retracción de 1 μm s-1. Los histogramas muestran un más probable ruptura fuerza fMP de 51,6 pN (ajuste de Gauss, línea negra) y una acumulación de longitudes de ruptura alrededor de 100 nm. Se ha modificado la figura de Becke, et al., ACSnano, 201813. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Desde la introducción del AFM basado en SMF, convertido en una técnica ampliamente utilizada para directamente sonda intra e intermoleculares fuerzas de proteínas individuales, ácidos nucleicos y otras biomoléculas3,4,5. Exitosos experimentos de SMF, una superficie apropiada estrategia de acoplamiento es un requisito previo. A prueba las fuerzas intramoleculares en polímeros naturales y sintéticos, los polímeros pueden acoplarse directamente a la superficie del sustrato y AFM punta36,38,39,40,41. Para la investigación de interacciones inter moleculares, tales como enlaces moleculares, sin embargo, es recomendable utilizar moléculas linker flexible como hetero-bifuncional enlazadores de PEG, o cadenas polipeptídicas, para unir a los socios de la interacción a la extremidad AFM y la superficie del sustrato, para permitir la correcta orientación de los socios de la Unión, para superar las fuerzas superficiales de corto alcance y para evitar la desnaturalización y desdoblamiento de las proteínas21,22,23, 24,25,26,27,42. Por lo tanto, nos describe un protocolo simple y sencillo para la inmovilización covalente de las proteínas a través de sus aminas primarias accesibles utilizando a espaciadores PEG hetero-bifuncional.

Hemos demostrado su aplicabilidad en la investigación de la interacción fuerzas entre la adhesina de RrgA de S. pneumoniae y la proteína de matriz extracelular Fn, como recientemente descrito en detalle en otra parte13.

La química superficial está bien establecida y enfoques analizados y similares se han utilizado con éxito en múltiples funciones experimentos19,42,43,44,45. El silylether utilizado para el acoplamiento con el polímero de silano a la superficie, está sujeto a hidrólisis. El grado de hidrólisis depende de la cantidad de bonos de siloxano formado, que pueden ser controlados durante el proceso de silanización. Si las fuerzas de interacción alto (≥ 1000 pN) se espera que durante las mediciones de la SMF, la silanización debe ser realizada a través de fase de vapor deposición30 que resulta en la formación de una capa continua de siloxanos. En cuanto a muchos experimentos (por ejemplo, muchas proteínas – las interacciones entre proteínas), las fuerzas de interacción están en el rango de unos cientos pN y el procedimiento descrito, en que siloxano formación se realiza por la deposición de una fase acuosa y desatada Organo-silanos son cuidadosamente lavada con etanol (paso 1.1.7) seguido por el curado con calor (paso de 1.1.8), es suficientes.

Otro paso importante es lavar la EDC restantes y moléculas NHS fuera de la superficie (paso 1.2.3), como sobras dará lugar a la activación de grupos carboxilo de las proteínas. Esto puede cualquier resultado en la reticulación de proteínas en la misma superficie, que pueden alterar su funcionalidad o covalente pareja activa proteínas a otras proteínas en la superficie opuesta. Esto puede conducir a la fijación de las proteínas entre la superficie y la punta AFM, que se traduce en fuerzas de ruptura alta posiblemente acompañadas por el despliegue de dominio (ver figura 3b, rastro 1, 4 y 5, despliegue de dominios Fn)46. Puede ocurrir el mismo problema, si los activos ésteres de NHS del espaciador PEG quedan insaturados. Por lo tanto, la incubación con solución salina tamponada con Tris se recomienda (paso 1.2.6), como la amina primaria de Tris sacia los aminos grupos reactivos restantes.

Siguiendo el protocolo paso a paso conduce a una distribución homogénea de Fn en el vidrio silanizada de la superficie (ver figura 2), dejando una forma dimérica de la proteína. Esto se asemeja a la estructura de Fn´s en solución y es consistente con los datos anteriores AFM en otros muestra superficies37. Además, se obtiene una concentración adecuada de RrgA en la punta AFM, que genera un valor objetivo de ~ 20% de los eventos de interacción bien definida durante las mediciones de SMF (figura 3 y figura 4). Otra forma elegante de controlar la cantidad de moléculas junto a la punta del sustrato y voladizo de muestra además variando los tiempos de la concentración o incubación de la proteína, es la combinación de silano-agentes con diferentes grupos funcionales secundarios. Cambiando la relación de grupos reactivos de la proteína que se extiende desde los polímeros de PEG, el número de proteínas inmovilizadas puede ser controlados15,16,17,18.

El protocolo descrito aquí puede también utilizarse para inmovilizar otras moléculas que contienen -NH2 o ajustarse a las proteínas par a otra superficie de óxido de silicio además de nitruro de silicio y vidrio. Dependiendo del diseño de la proteína, el grupo carboxyl reactivos de Amina se puede cambiar a un grupo reactivo sulfhidrilo (p. ej., maleimida o ortho-piridil disulfuro) para acoplar la proteína a través de su libre – grupos SH. Para Fn, esto resulta en una orientación predefinida13,17,20.

En Resumen, este protocolo puede ajustarse para atender a diferentes requerimientos y es adecuado para otras aplicaciones biofísicas además de experimentos de espectroscopia de fuerza sola molécula.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

TB y HG reconocen apoyo financiero a través del Consejo Europeo de investigación "Cellufuel, avanzado beca Nº 294438". HCS reconoce el apoyo financiero del Ministerio Federal de educación e investigación a través de la proteína de Technofunktionale de Innovationsallianz (TeFuProt), SS reconoce financiera apoyo del ministerio bávaro de estado de educación y ciencia mediante el enfoque de la investigación "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - CANTER". Agradecemos a Conny Hasselberg-Christoph y Martina Hörig para soporte técnico

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
2-Propanol Carl Roth 6752
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Sigma-Aldrich 03450 EDC
Acetic acid Carl Roth 3738 100 %; analytical purity
Doubly distilled water
Ethanol Carl Roth 9065 ≥ 99.8 %; analytical purity
Ethoxy silane polyethylene glycol acid Nanocs PG2-CASL-5k 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Hydrochloric acid Carl Roth X896 32 %
N-Hydroxysuccinimid Merck 804518 NHS; for synthesis
Phosphate Buffered Saline - Dulbecco Biochrom L1825 PBS
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma Sigma-Aldrich F1056
Probe molecule e.g. RrgA Produced in laboratory
Sodiumchlorid Carl Roth 9265 NaCl
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Carl Roth AE15 ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Beakers
Glass cutter
Glass slides Carl Roth 0656
Inert gas desiccator Sicco
Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200 Zeiss
JPK NanoWizard 1 JPK Instruments
JPK NanoWizard SPM and DP software JPK Instruments
Laboratory oven Binder
Magnetic stirrer IKA
Micro spatula
Microcentrifuge tubes
Microsoft Excel Microsoft
Parafilm M Brand 701606
Petri dishes
pH-meter Knick
Pipettes Starlab 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl
Precision balance Acculab
Silicon nitride cantilever - MLCT Bruker AXS S.A.S Spring constant ≤ 100 pN/nm
Sonication bath Bandelin
Staining jar
Stereo microscope - Zeiss Stemi Zeiss
Stir bar
Kimtech science precision wipes Kimberly-Clark
Twezzers
UV PenRay UVP, LLC 90-0012-01 Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm
Vacuum desiccator
Vacuum pump
Vortex mixer VWR
Weighing paper Carl Roth TP64

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Bioquímica número 138 inmovilización covalente de la proteína superficie silanización heterobifunctional reactivo PEG química EDC/NHS amina primaria atómica fuerza de espectroscopia de fuerza de sola molécula de microscopía AFM SMF
Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula
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Becke, T. D., Ness, S., Sudhop, S.,… More

Becke, T. D., Ness, S., Sudhop, S., Gaub, H. E., Hilleringmann, M., Schilling, A. F., Clausen-Schaumann, H. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e58167, doi:10.3791/58167 (2018).

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