Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para cultura tridimensional de células de glioblastoma paciente-derivado dentro ortogonalmente sintonizáveis biomateriais projetados para imitar a matriz do cérebro. Essa abordagem fornece uma em vitro, plataforma experimental que mantém muitas características de na vivo glioblastoma células tipicamente perdidas na cultura.
Abstract
Glioblastoma (GBM) é o câncer mais comum, ainda mais letal, do sistema nervoso central. Nos últimos anos, muitos estudos têm focado como a matriz extracelular (ECM) do ambiente exclusivo do cérebro, como o ácido hialurónico (HA), facilita a invasão e a progressão do GBM. No entanto, a maioria em vitro cultura de modelos incluem células GBM fora do contexto de um ECM. Xenografts murino de células GBM são usados geralmente também. No entanto, na vivo modelos dificultam a isolar as contribuições das características individuais do microambiente do tumor complexo comportamento do tumor. Aqui, descrevemos uma plataforma de base de hidrogel, tridimensional (3D) cultura HA que permite que os pesquisadores independentemente alterar a rigidez e a concentração de HA. Alto peso molecular HA e polietileno glicol (PEG) compõem o hidrogel, que são a quitosana através da adição de Michael-tipo na presença de células vivas. Culturas de hidrogel 3D do paciente-derivado viabilidade de exposição de células GBM e proliferação taxas tão bom quanto, ou melhor, quando cultivadas como padrão gliomaspheres. O sistema de hidrogel também permite a incorporação de peptídeos ECM-mimética para isolar os efeitos de interações específicas célula-ECM. Hidrogel é opticamente transparente para que células vivas podem ser fotografadas na cultura 3D. Finalmente, HA hidrogel culturas são compatíveis com as técnicas convencionais para análises moleculares e celulares, incluindo PCR, mancha ocidental e cryosectioning seguido por mancha da imunofluorescência.
Introduction
Sistemas tridimensionais (3D) cultura recapitulate interações entre células e a sua envolvente da matriz extracelular (ECM) em tecidos nativos melhores que seus bidimensional (2D) homólogos1,2. Avanços na engenharia de tecidos têm rendido plataformas sofisticada cultura 3D que permitem investigações controladas em componentes 1) como químicas e físicas da matriz microambiente afetam célula comportamentos e 2) a eficácia de novas terapêuticas estratégias para uma série de doenças, incluindo câncer2. Enquanto modelos em vitro não podem considerar fatores sistêmicos, tais como sinais do sistema endócrino e imunes e, portanto, não podem substituir completamente modelos na vivo , eles fornecem várias vantagens, incluindo a reprodutibilidade, controle experimental, acessibilidade e velocidade. Aqui, descrevemos o uso do cérebro-mimética hidrogel em 3D que culturas de células de tumor de cérebro de paciente-derivado capturar muitos aspectos da fisiologia de tumor, em particular, a dinâmica de aquisição de resistência do tratamento3. Em comparação com outros métodos em vitro , essas culturas melhor representam modelos de tumor na vivo e observações clínicas3.
Glioblastoma (GBM) é o câncer mais frequente e letal, originários do cérebro, com uma sobrevida média de apenas 1-2 anos,4,5. Nos últimos anos, muitos estudos têm incidido sobre a influência do ambiente de matriz de tumor em GBM6,7,8. O único cérebro ECM tem sido relatado para afetar resistência terapêutica6,7,8,9,10,11 , proliferação e migração de células GBM , 12. ácido hialurônico (Ah) é um glicosaminoglicano abundante (GAG) no cérebro, onde ele interage com outros GAGs e proteoglicanos para formar um hidrogel, como malha13. Muitos estudos têm relatado a superexpressão de HA em tumores GBM e seus efeitos subsequentes sobre câncer progressão8,9,13,14,15,16 ,17. Outros componentes de ECM também afetam GBM tumor crescimento e invasão6,7,15,18. Por exemplo, fibronectina e vitronectina, que normalmente são overexpressed em GBM, induzem a heterodimerization de receptores de superfície integrinas celular através da ligação à sequência de "RGD" e iniciar o complexas cascatas de sinalização que promovem a sobrevivência de tumor19 ,20,21. Além de influências bioquímicas, propriedades físicas da matriz de tecido também afetam GBM progressão22,23.
Aquisição contínua de resistência às terapias é um dos principais motores do GBM letalidade4. Mostrando resultados promissores em modelos 2D ou gliomasphere de drogas falharam em estudos subsequentes em animais e casos clínicos3, indicando que os efeitos dos fatores microenvironmental contribuíram significativamente para GBM tumor resposta1. Enquanto modelos animais podem fornecer um 3D, fisiologicamente adequadas microambiente para xenografted células doentes e gerar resultados clinicamente relevantes24,25, a complexidade do cérebro microambiente na vivo torna-se desafiador para determinar quais recursos, incluindo interações célula-matriz, são os resultados-chave para específica biológicos. Identificação de novos alvos terapêuticos beneficiará da utilização de plataformas de cultura simplificado de propriedades bioquímicas e biofísicas definidas.
Ao contrário dos modelos anteriormente relatados biomaterial do GBM tumor microambiente26,27 que não alcançaram o verdadeiro controle ortogonal sobre características físicas e bioquímicas individuais de ECM, a plataforma de biomateriais relatados aqui permite desacoplamento das contribuições dos vários recursos independentes de fenótipo de células GBM. Aqui, apresentamos um sistema de hidrogel HA-based, ortogonalmente ajustáveis, para cultura 3D do paciente-derivado de células de GBM. Hidrogel é formados a partir de dois componentes de polímero: HA 1) biologicamente ativo e 2) biologicamente inerte polietileno glicol (PEG). PEG é um material biocompatível e hidrofílico amplamente utilizado com adsorção de baixa proteína e imunogenicidade mínimo28. Aqui, cerca de 5% de partes de ácido glicurônico HA correntes são acrescida com grupos tiol para habilitar ligando para um comercialmente disponível 4-braço-PEG finalizado com maleimides através da adição de Michael-tipo. Na sua forma mais comum no corpo, HA existe em cadeias de alto peso molecular (HMW). Aqui, um baixo grau de modificação de HMW HA (500-750 kDa) ajuda a preservar interações nativas de HA e seus receptores celulares, incluindo CD4429. Substituindo PEG-tiol para HA-tiol, mantendo uma constante relação molar de tióis totais de maleimides, HA concentração pode ser dissociada da propriedades mecânicas de hidrogel a resultante. Além disso, controles estequiométricos podem ser usados para conjugar terminada em cisteína peptídeos para um número definido de médio de braços maleimide terminada em cada 4-braço-PEG. Incorporação de peptídeos derivados de ECM, adesivos permite interações com integrinas em culturas de células, através do qual os sinais bioquímicos e químicos são transduzidas1. Adição de maleimide-tiol ocorre muito rapidamente em condições fisiológicas, minimizando o tempo necessário para encapsulamento de célula e maximizando a sobrevivência de células derivadas de paciente. Além disso, culturas de hidrogel podem ser tratadas como amostra de tecido típico e são compatíveis com as técnicas de caracterização padrão incluindo mancha ocidental, citometria de fluxo e mancha da imunofluorescência. O protocolo seguinte descreve os procedimentos para a fabricação de hidrogel, estabelecer 3D culturas de células GBM derivado de paciente e técnicas de análise bioquímica.
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Protocol
Todas as etapas de coleta de tecido humano foram realizadas sob protocolos aprovados institucionalmente.
1. Thiolation de ácido hialurônico
Nota: Rácios Molar são demonstrados em relação ao número total de grupos carboxilato, a menos que especificado de outra forma.
- Dissolva 500 mg de hialuronato de sódio (HA, 500-750 kDa) 10 mg/ml em água destilada, deionizada (DiH2O) em uma autoclave esterilizada, Erlenmeyer de 250 mL. Agite a solução (~ 200 rpm) à temperatura ambiente por 2 horas para dissolver totalmente HA. Use uma barra de agitação e placa de agitação magnética para manter a reação mexendo durante procedimento de thiolation.
- Usando 0.1 M ácido clorídrico (HCl), ajustar o pH da solução a 5,5 HA. Pese 69,6 mg (0,25 x razão molar) de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC).
Nota: Embora não dissolvido EDC pode ser adicionado diretamente para a solução HA, é normalmente mais fácil dissolver EDC primeiro em 1 mL de DiH2O e em seguida, adicione rapidamente a solução EDC para a solução HA. Pré-dissolução em 1 mL de DiH2O também pode ser feito com a N-Hidroxisuccinimida (NHS) e cystamine dihydrocholoride antes de adicionar a reação em etapas 1.3 e 1.4. - Adicione 17,9 mg (0,125 x razão molar) de NHS para a reação. Ajustar o pH da solução de reação de 5.5 usando 0.1 M HCl e incubar a reação à temperatura ambiente durante 45 minutos.
- Adicione 70,0 mg (0,25 x razão molar) de dicloridrato de cystamine para a solução de reação. Use 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) para ajustar o pH a 6.25. Incube a reação na temperatura de quarto durante a noite, agitando.
- No dia seguinte, use 1 M de NaOH para ajustar o pH da solução de reação de cerca de 8. Adicione 192 mg (4 x razão molar) de ditiotreitol (DTT) para a reação. Ajustar o pH volta a 8 após a adição da TDT e deixar a agitação por 1-2 horas à temperatura ambiente.
- Use 1 M de HCl para ajustar o pH para 4. Transfira a mistura de reação inteira em membrana de diálise previamente embebido (corte de peso molecular em torno de 13 kDa) e urinar contra DiH2O pré-ajustada a pH 4.
Nota: O volume de DiH2O para diálise deve ser pelo menos 40 vezes o volume da solução de HA (por exemplo, amostra de 50 mL em 2 L de DiH2O, pH 4) reagiram. - Substitua a solução de diálise (DiH2O, pH 4) duas vezes diariamente por 3 dias à temperatura ambiente.
- Filtre a solução dializada através de uma membrana de 0,22 µm, filtro controlado por vácuo. Flash congelar a solução de thiolated HA em nitrogênio líquido. Use um Liofilizador para congelar amostras secas durante 2 dias. Thiolated HA no formulário seco pode ser armazenado em um dessecador selado a-20 ° C durante pelo menos 6 meses.
- Para determinar o grau de thiolation, use o teste do Ellman e/ou proton NMR espectroscopia30,31.
2. preparação de materiais de reticulação
- Dissolva thiolated HA na concentração desejada (no exemplo, 13,3 mg/mL) em solução salina tampão HEPES (20 mM HEPES buffer de solução salina sal equilibrado (HBSS) do Hank, ajustado para cair dentro de um pH de 8-9) em um frasco âmbar para minimizar a exposição à luz ambiente. Conservar a solução, agitando constantemente.
Nota: A formação de ligações dissulfureto entre tióis conjugados a HA pode ocorrer se o pH estiver acima de 8, a concentração da solução é muito alta, ou a solução é deixada mexendo por muito tempo antes da gelificação. Para evitar esse problema, use abaixo de 15 mg/mL de thiolated HA e dissolver thiolated HA dentro de 2 horas de formação de hidrogel. - Dissolva 4-braço-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) e 4-braço-PEG-tiol (PEG-tiol, 20 kDa) em salina tamponada fosfato (PBS), pH 7,4, para preparar a 50 mg/mL PEG-Mal e PEG-tiol soluções estoque.
Nota: Demora pelo menos 1 hora para dissolver totalmente PEG reagentes. - Se adicionando peptídeos derivados de ECM, dissolva cisteína contendo peptídeos em PBS para preparar uma solução de reserva.
Nota: Utilize uma concentração das ações de 2-4 mM. - Borracha de silicone de imersão moldes em etanol pelo menos 20 min para limpa-los e, em seguida, autoclave-los para a esterilização.
3. hidrogel reticulação e encapsulamento da célula
Nota: como exemplo aqui, o encapsulamento de quatro indivíduos, 80 µ l hidrogel com 0,5% (p/v) HA e módulo de elasticidade à compressão de 1 kPa é descrito3. Por favor, consulte a tabela 1 para receitas de exemplo que rendem hidrogel com propriedades diferentes: dois hidrogel incorporando a integrina-ligação peptídica RGD e dois hidrogel incorporando tampões de cisteína como um controle negativo para a atividade de peptídeo. Concentração de células GBM paciente-derivado de semeadura é 500.000 células/mL.
- Dilua o PEG-Mal solução (50 mg/mL, da etapa 2.2) a 12,5 mg/mL, adicionando 40 µ l da solução-mãe de 120 µ l PBS. Dividi a solução diluída em dois tubos de 1,5 mL microcentrifuga para que cada tubo tem 80 µ l.
- Adicione 16 µ l de solução RGD (2,8 mM, da etapa 2.3) para um tubo de estoque e 16 µ l da solução estoque de cisteína (2,8 mM, da etapa 2.3) para o segundo tubo. Vórtice de misturar. Coloque as soluções PEG-Mal-RGD ou PEG-Mal-CYS no gelo até o uso na etapa 3,9.
Nota: O procedimento conforme descrito aqui rendimentos hidrogel com ~ 140 µM de peptídeo. Isso é equivalente a aproximadamente 1 em cada 8 braços de PEG disponíveis, sendo ocupada com um peptídeo. Isto pode ser variado, alterando a relação molar de peptídeos cisteína-terminada a grupos de maleimide disponível. Em geral, uma concentração máxima de 280 µM de peptídeo pode ser conseguida ao mesmo tempo deixando um número suficiente de maleimide grupos disponíveis para reticulação de hidrogel. - Dilua a solução-mãe PEG-tiol (50 mg/mL, da etapa 2.2) a 5 mg/mL misturando 4 µ l de 50 mg/mL solução estoque com 36 µ l de PBS. Adicione 120 µ l de dissolvido, thiolated HA da etapa 2.1 à mistura.
Nota: Soluções de HMW HA são muito viscosas. Assim, recomendamos o uso de ponta de todo o orifício micropipeta para transferir soluções. Pipeta lentamente para evitar solução aderindo às paredes da ponta da micropipeta e para melhorar a precisão de medição. - Coloque os moldes limpos e secos (preparados na etapa 2.4) em cada poço de uma cultura de não-tecidos Tratado 12 placa. Usando a extremidade romba, limpa de uma ponta da pipeta, pressione o molde de gel e faça uma verificação dupla vedação entre moldes e inferior da placa bem.
Nota: Verifique o selo novamente antes do encapsulamento para evitar fugas. - Passagem de culturas de células de GBM, dissociar a células únicas e determinar a concentração de células como descrito anteriormente3.
Nota: Algumas linhas GBM não podem ser dissociadas de células únicas. Neste caso, toda gliomaspheres pode ser encapsulado. No entanto, prepare células únicas dissociadas depois de célula precisa contar melhorar a reprodutibilidade. O protocolo para gliomasphere passagem varia entre diferentes laboratórios, e muitos destes são provavelmente compatível com encapsulamento de hidrogel.- (Recomendado) Centrífuga gliomaspheres a 500 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante e adicionar 1 mL de enzima de dissociação de célula para o centrifugado. Em seguida, incube durante 5 min, batendo suavemente o tubo para agitar.
- Adicione 4 mL de meio de cultura completo (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µ g/mL heparina, suplemento G21 e 1% penicilina/estreptomicina em DMEM/F12) para as células.
- Centrifugar novamente a 500 x g durante 5 min e retirar o sobrenadante. Finalmente, Ressuspender as células em 1 mL do meio de completa e passar a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm. Lavagem (recomendada) o filtro com um adicional 4 mL do meio de completa para maximizar o número de células se recuperou.
- Estime a concentração de células na suspensão usando um hemocytometer. Dividi a suspensão de eritrócitos em 2 tubos de centrífuga, onde cada tubo contém células ~ 80.000. Centrifugar a 500 x g por 5 min; Geralmente, 80.000 células compõem 2 80 µ l hidrogel.
- Remover o sobrenadante e ressuspender uma pelota em 80 µ l de solução de PEG-MAL-RGD e uma segunda pelota em 80 µ l de solução de PEG-MAL-CYS (preparada no passo 3.1).
- Usando um 200 µ l, ponta da micropipeta largo-orifício, dispense a 40 µ l de solução HA (de etapa 3.3 acima) em cada molde de silicone de borracha (como preparado no passo 3.4).
- Usando um 200 µ l, ponta da micropipeta largo-orifício, misture a 40 µ l de solução de célula PEG-MAL-RGD com a solução HA no molde ou PEG-MAL-CYS. Pipete sobem e descem rapidamente não mais que 10 vezes. Repita para cada cultura gel sendo preparada.
Nota: Este passo requer prática, como a gelificação inicial ocorre rapidamente (dentro de 30 s). Pipete acima e para baixo enquanto se move a ponta para diferentes locais em moldes para garantir mistura mesmo. Mantenha sempre a ponta abaixo do nível líquido para evitar a formação de bolhas de ar. Não misture a solução muitas vezes como gel pode se formam no interior da micropipeta dica de fazer. PEG-MAL-CYS e PEG-MAL-RGD podem ser combinados em proporções diferentes para atingir a concentração desejada de peptídeos RGD. - Coloque a placa bem-contendo células gel encapsulado em uma incubadora de cultura de célula de 37 ° C por 5-10 minutos garantir a conclusão da reação.
- Adicione 2-2,5 mL de meio de cultura para cada poço com géis formados. Use um estéril, a ponta da pipeta 2 µ l ou microespátula, para separar com cuidado o molde e o gel. Use fórceps pré-esterilizados para remover o molde da placa de bem. Coloque a placa bem voltar à incubadora de célula (37 ° C e 5% CO2) para a cultura e as experiências futuras.
Nota: Puxe o molde verticalmente para cima para evitar prejudicar as culturas de gel. Em geral, médio em gel de culturas deve ser substituído a cada 3-4 dias. Tome cuidado para não aspirar hidrogel ao remover médio. Se isto for um problema, recomendamos que usando uma pipeta de transferência plástica. Se bioluminescência imaging para rastrear o número do celular é planejada, células GBM devem ser transfectadas com lentivirus constitutivamente codificação expressão luciferase antes de encapsulamento, como descrito anteriormente3. Para a imagem latente de bioluminescência, adicione 1 mM de D-Luciferina de meio de cultura 1h antes da imagem latente de luminescência.
4. lisada preparação para a mancha ocidental
- Fica frio tubos de 1,5 mL microcentrifuga no gelo (1 por gel de amostras). Legal centrifugar a 4 ° C.
- Retire médio chapas bem. Transferi géis para tubos microcentrifuga prechilled.
- Adicione 100 µ l de tampão RIPA com inibidores de protease/fosfatase 1 x.
- Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha 20g, acaba com o gel, empurrando a mistura inteira através de agulha de pelo menos 20 vezes.
- Flash girar a amostra usando banco microcentrifuga superior e coloque a amostra de volta no gelo.
- Vórtice amostras brevemente cada 5 min. para um total de 20 min.
- Centrifugar as amostras a 14000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para tubos microcentrifuga novo, pre-refrigerados e armazenar a-20 ° C (curto prazo) ou e -80 ° C (longo prazo). Realize a eletroforese em gel utilizando procedimentos padrão, como descrito anteriormente3.
5. extrair células únicas de hidrogel culturas por citometria de fluxo
- Retire médio e transferência de cultura de gel (da etapa 3.11) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Incube gel com 500 µ l de enzima de dissociação celular (por exemplo, TrypLE Express) a 37 ° C por 5 min, ocasionalmente, passando rapidamente o tubo para agitar.
- Transfira a mistura em um tubo de centrífuga de 50 mL com 5 mL de meio completo. Coloca o tubo no gelo.
- Anexe uma agulha 20g em uma seringa de 10 mL. Puxe delicadamente a suspensão de células acima e para baixo através da agulha 8 vezes.
- Fluxo da mistura através de 70 µm filtro de célula para um novo tubo de centrifugação de 50 mL. Aplica um adicional 5 mL de meio completo através do filtro para coletar as células restantes.
- Centrifugar a amostra a 400 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado no buffer desejado por citometria de fluxo (usando protocolos padrão3).
6. criopreservação de hidrogel para seccionamento
- Remova o meio de culturas de gel (da etapa 3.11).
- Incube as culturas de gel com 2 mL de paraformaldeído 4% (PFA) a 4 ° C durante a noite.
Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. - No dia seguinte, retire o PFA. Adicionar 2 mL de 5% de sacarose em PBS para géis e incube por 1h à temperatura ambiente.
- Substitua a solução de sacarose 5% com 2 mL de 20% de sacarose em PBS e incube por 30 min.
- Substitua a solução de sacarose com 2 mL de fresco 20% de sacarose em PBS e incubar por um adicional 30 min.
- Pela terceira vez, substitua a solução de sacarose com 2 mL de fresco 20% de sacarose em PBS. Incube a 4 ° C durante a noite.
- Prepare-se 20% de sacarose em composto de temperatura de corte ideal (OCT).
Nota: Devido à viscosidade do OCT, dissolução de sacarose pode levar algum tempo (até durante a noite). Recomendamos colocar a mistura em um abanador durante dissolução para manter a agitação. - No dia seguinte, retire a solução de sacarose 20% e delicadamente despeje a 20% de sacarose em solução OCT sobre o gel. Certifique-se de cobrir o gel todo. Incube a 4 ° C por 3 h.
- Transferir o gel para o centro de um molde de encastre usando uma espátula grande e plana; Isso deve ser feito com cuidado para não danificar o gel.
- 2-methylbutane legal dentro de uma câmara com um excesso de gelo seco.
- Encha o molde de encastre com OCT pura (sem sacarose). Encha logo abaixo a borda superior do molde.
- Congelar a amostra de hidrogel por imersão em refrigeração 2-methylbutane e prossiga até a corte.
- Seção da amostra usando um criostato; espessura de corte de 10-18 µm e a temperatura de corte de cerca de-26 ° C são recomendados.
- Execute procedimentos de imunocoloração padrão na cultura de gel seccionado, como descrito anteriormente3.
Nota: PFA é conhecido irritante e cancerígeno. Por favor Manuseie e elimine PFA-de acordo com os regulamentos e normas aplicáveis localmente.
7. extração de RNA total de amostras em hidrogel
Nota: Aqui, descrevemos um protocolo utilizando um comercial kit (veja a tabela de materiais) para extrair o RNA total de células cultivada de hidrogel. Os buffers e todo o material estão disponíveis dentro do kit usado.
- Remova o meio de cultura. Use uma pipeta de transferência P1000 com ponta larga-furo para transferir a cultura de hidrogel no tubo de 1,5 mL microcentrifuge.
- Adicione 350 µ l de tampão RLT para a cultura de hidrogel.
- Usando uma agulha 20g anexada a uma seringa de 1 mL, Desfie o gel, empurrando a mistura inteira através de agulha de pelo menos 20 vezes.
- Transfira a mistura toda em uma coluna de homogeneizador colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugar a 13.000 x g por 2 min.
- Transferi o sobrenadante para um tubo de microcentrifuga limpa 1,5 mL. Tenha cuidado para não perturbar o precipitado de gel na parte inferior.
- Misture a amostra lisada com 350 µ l de etanol 100%. Transferi toda a amostra para um lugar de coluna (do kit) de rotação em um tubo de coleta de 2 mL. Centrífuga para 1 min a 13.000 x g.
- Para as etapas subsequentes para purificação de RNA por PCR, segui o protocolo geral fornecido pelo fabricante do kit.
Nota: Uma vez que o RNA é extraído, protocolos padrão para o PCR podem ser usados.
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Representative Results
Para cada lote de thiolated HA, o grau de thiolation deve ser verificado usando H1-NMR ou teste de um Ellman. HA modificação usando o procedimento descrito aqui consistentemente gera ~ 5% thiolation (definido como a razão molar de tióis de dissacarídeos HA) (Figura 1).
Configurando esta nova plataforma de cultura vai exigir cada laboratório para realizar testes rigorosos para assegurar a viabilidade da cultura boa antes da implementação de experimentos em grande escala. Nossos 80 µ l hidrogel com uma semeadura densidade 500.000 células/mL (40.000 células/gel) consistentemente resulta em taxas de proliferação comparável, ou melhor, gliomasphere culturas (Fig. 2A-2 C). Como HA/PEG hidrogel é opticamente transparente, comportamentos de célula podem ser observados diretamente em culturas ao vivo, 3D usando microscopia de contraste ou fluorescência de fase. A figura 3A mostra que, quatro dias depois de encapsulamento, células GBM em hidrogel contendo RGD exibem um fenótipo invasivo, enquanto as células cultivadas em hidrogel usando PEG-MAL-CYS controles têm uma morfologia esférica.
Como é típico de modelos de enxerto heterólogo em que os investigadores devem aguardar dias a meses até tumores implantados alcançar crescimento progressivo24,32, células do paciente-derivado também leva tempo para se adaptar a um novo ambiente de cultura. Assim, recomendamos que o cultivo de 4 a 8 dias antes de iniciar os experimentos, tais como tratamento medicamentoso, para garantir que a maioria das células ter entrado na fase de crescimento exponencial. Além de tratamentos com drogas, reagentes como solúvel cyclo-RGD, que competitivamente interrompem interações célula com RGD em hidrogel, podem ser adicionados ao meio de cultura (Figura 3A).
Nosso sistema de hidrogel é compatível com muitos métodos comuns para investigar a biologia celular de glioma. Utilizando imagens de bioluminescência, que é comumente usada para monitorar tumores de roedores xenoenxertos, número relativo de células viáveis pode ser observado em culturas de hidrogel durante o curso do tratamento. Figura 3B fornece um exemplo desse método, onde os efeitos do tratamento de erlotinib em células de GBM hidrogel-cultivadas foram avaliados durante 6 dias. Em geral, culturas de hidrogel podem ser tratadas como amostras de tecido ao preparar lysates para Western blot ou PCR. Análise ocidental do borrão de polymerase de ADP clivada poli indica que grau relativo de apoptose em células de knockdown CD44 tratadas é maior do que as células GBM sua culta em 0,5% hidrogel HA (Figura 3). Da mesma forma, suspensões celulares único podem ser preparadas de culturas de hidrogel para análise através de citometria de fluxo, usando protocolos padrão para libertar células únicas de tecidos intactos (Figura 2). Além dos recursos do celular, cryosections de culturas com base em hidrogel, 3D preservar ECM depositado por células cultivadas. Por exemplo, padrões de deposição de turno de colágeno tipo IV tratamento de erlotinib das culturas de hidrogel (Figura 3D).
Figura 1 : H representante 1 Espectro -NMR de ácido hialurônico de thiolated. Integrado de picos indicam que aproximadamente 5% dos grupos de ácido glicurônico HA foram modificados com um tiol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Proliferação de células de hidrogel-encapsulado. A) imagens de exemplo de fabricados 80 géis de µ l em placas 12-boas. Após a reticulação, hidrogel estava inchados em meio de cultura celular. B) resultados representativos da taxa de proliferação medido utilizando citometria de fluxo. Células GBM (HK301) foram incubadas com 1 µM EdU (5-ethynyl-2-desoxiuridina) para 2,5 h no quarto dia após o encapsulamento ou passagem. Uma clique-reação foi usada para conjugar tintura fluorescente para EdU incorporada, conforme detalhado em Xiao et al . 2017.3 controles negativos, onde nenhuma EdU foi adicionado às culturas, foram incluídos. Imagens de microscopia confocal C) representante de vivem (verde) e mortos (vermelho) células 24 horas depois de hidrogel culturas de células GBM (HK157) foram estabelecidas. Escala de barras = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Caracterização. A) imagens de contraste de fase representativo de 0,5% (p/v) HA células de hidrogel-cultivadas sob condições variáveis por 8 dias depois de encapsulamento. As setas indicam as células com uma morfologia invasiva. B) imagens representante do sinal de bioluminescência medido após 15 dias de tratamento com 1 µM erlotinib ou veículo (DMSO). 1 mM D-luciferina foi adicionado ao meio de cultura celular 1 h antes da imagem latente. As células foram transfectadas com lentivirus codificação para expressão constitutiva de luciferase de vaga-lume antes do encapsulamento. C) representante imune-blot imagens analisando clivada expressão poli ADP polimerase (PARP-cl), em células GBM (HK301) cultivado em hidrogel com 0,5% (p/v) HA e 1 módulo de compressão kPa. Toda recortada imagens mostradas foram de blot mesmo. D) representante coloração de colagénio IV (verde) e Hoechst 33342 (azul) em hidrogel-cultivadas HK301 células 12 dias após o tratamento com 1 µm erlotinib ou veículo (DMSO). Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo gel | Parte um (40 µ l cada) | Parte B (40 µ l cada) | ||||
| 4Arm-PEG-MAL (50mg/mL) | Cisteína ou RGD (2,81 mM) | PBS (pH 7,4) | 4Arm-PEG-tiol (50mg/mL) | PBS (pH 7,4) | HA-S (13,3 mg/mL) | |
| 1kPa HA de 0,5% (p/v) | 10 Μ l | Μ l 4.00 | Μ L 26 | Μ l 1,00 | Μ l 9,00 | 30,0 Μ l |
| 2kPa HA de 0,5% (p/v) | 20,0 Μ l | Μ l 4.00 | Μ l 16,0 | Μ l 8.00 | Μ l 2,00 | 30,0 Μ l |
| 1kPa HA de 0,1% (p/v) | 10 Μ l | Μ l 4.00 | Μ L 26 | Μ l 8.00 | 26,0 Μ l | Μ l 6.00 |
Tabela 1. Formulações de hidrogel rendendo controle independente da concentração de HA e propriedades mecânicas.
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Discussion
Geração de dados podem ser reproduzidos usando este sistema de cultura 3D requer: 1) consistente para lotes thiolation de HA, 2) prática para atingir eficiente mistura de precursores de hidrogel e manipulação de hidrogel culturas para evitar danos e 3) otimizado de semeadura densidade para cada linha de celular usada.
Quando uma porcentagem de peso específico de HA é desejada no hidrogel, o grau de thiolation de HA determina a densidade de ligação cruzada. Recomendamos usar uma quantidade consistente de HA para cada reação thiolation para minimizar a variação de lotes. Sugerimos que pelo menos 300 mg de HA ser usado para cada reação thiolation para que o mesmo lote de thiolated HA pode ser usado para várias repetições experimentais. A relação molar de tióis a maleimide grupos no cabide 4-braço deve ser sempre ser 1.1:1 para assegurar a eficiência máxima de reticulação. Assim, se o grau de thiolation é variado, então a quantidade de PEG-Mal adicionado deve ser ajustada em conformidade. Quando peptídeos são conjugados a maleimides antes da formação do gel, o número estimado de PEG braços com peptídeos amarrados deve ser subtraído o número total de maleimides disponíveis para este cálculo. Além disso, é recomendável manter o grau de thiolation HA, abaixo de 10-15% para evitar a formação de ligação dissulfeto que impedirão a dissolução e gelificação consistente.
A reação de adição de Michael-tipo entre grupos tiol e maleimide garante que a gelificação ocorre em menos de um minuto. Enquanto esta rápida gelificação minimiza a quantidade de tempo que as células suspendidas em hidrogel precursores são sem meio completo, o que pode comprometer sua viabilidade, o processo de encapsulamento requer experiência com toda a pipetagem e mistura passos para alcançar Resultados reprodutíveis. Normalmente, temos novos estagiários praticar várias rodadas de gelificação sem células antes de realizar experimentos de encapsulamento "real".
Dois fatores podem ser ajustados para modular a velocidade de gelificação: pH temperatura e precursor de reação. Abaixando a temperatura de reação, colocando a placa bem no gelo enquanto mistura retarda a reação e prevê maior tempo misturar soluções de precursor. No entanto, isso deve ser feito sob condições estéreis, usando técnicas assépticas apropriadas. Da mesma forma, o pH das soluções de precursor pode ser alterado para aumentar ou diminuir o tempo de reação usando pH superior ou inferior, respectivamente. Desde que thiolated HA é diálise contra água ácida para evitar a formação de ligação dissulfeto, reconstituído thiolated HA renderá pH menor do que o contrário seria esperado. Em geral, a reconstituição em 20 mM HEPES buffer de HBSS, ajustado ao pH 9, produzirá um pH perto quando 7 15 mg/mL de thiolated HA (thiolated ~ 5%) é dissolvido. Nós recomendamos usar pH 6,8-7 thiolated HA solução para permitir que mesmo mistura de solução de gel maximizando a saúde da célula.
Densidade de semeadura durante o encapsulamento é fundamental para a viabilidade celular e reprodutibilidade experimental. Recomendamos que a propagação na faixa de 100.000 a 2.000.000 células/mL. Encontramos que esta gama é ideal para viabilidade da maioria dos tipos de célula, evitando acabou-confluência dentro de um prazo experimental pelo menos 3 semanas. A densidade de semeadura inicial que otimiza a viabilidade deve ser determinada experimentalmente para cada tipo de pilha usado.
Extremo cuidado deve ser tomado quando se muda o meio celular a fim de evitar danificar culturas de hidrogel. Em particular, tome cuidado para não aspirar o hidrogel para a pipeta. Assim, não usar aspiração vácuo e em vez disso, use uma pipeta de transferência estéril para aspirar manualmente. Também pode ajudar a mudar apenas metade meio em uma cultura bem cada vez.
Em geral, esta técnica requer prática para alcançar o necessária destreza manual e consistência. Uma vez estabelecido um protocolo específico de laboratório, o sistema de cultura 3D permite que o pesquisador usar muitos métodos de caracterização como típico para cultura de células e tecidos explantados. Aqui, descrevemos várias técnicas para análise, incluindo imunofluorescência, citometria de fluxo, mancha ocidental e imagem latente de bioluminescência das culturas ao vivo, 3D (Figura 2-3). Para protocolos mais detalhados dos métodos de caracterização, por favor consulte Xiao et al . 20173. Finalmente, como HA/PEG hidrogel é opticamente transparente, técnicas de microscopia de luz padrão, incluindo a imagem latente confocal, podem ser usadas para monitorar ao vivo, 3D culturas.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado com recursos do NIH (R21NS093199) e prêmio do UCLA ARC 3R. Nossos sinceros agradecimentos vão para o laboratório do Dr. Harley Kornblum para fornecimento das linhas celulares HK301 e HK157. Agradecemos também núcleo de patologia laboratório de UCLA tecido (TPCL) para cryosectioning, instalação de núcleo de microscopia de luz avançado/espectroscopia (ALMS) em Califórnia nanosistemas Institute (CNSI) na UCLA para uso do microscópio confocal, UCLA Crump Instituto para Imagem molecular para o uso de sistema de imagem IVIS, UCLA Molecular instrumentação Center (MIC) para fornecer a espectroscopia de ressonância magnética e fluxo Cytometry núcleo em Jonsson abrangente Cancer Center (JCCC) na UCLA para fornecimento de instrumentação para o fluxo de citometria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Holland, E. C.
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
- Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
- Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
- Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
- Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H.
- Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
- Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
- Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
- Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
- Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
- Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
- Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
- Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
- Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
- Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
- Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
- Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).
