Summary
Vi presenterar användning av 2-foton mikroskopi att placera en mikropipett inom Bowmans urin utrymme i möss, kombinera 2 Grundläggande tekniker för nedsatt fysiologi. Användning av 2-foton mikroskopi övervinner kritiska begränsningar av konventionella mikroskopi för micropuncture nedsatt fysiologi studier.
Abstract
Nedsatt micropuncture och nedsatt 2-photon imaging är nyskapande tekniker i nedsatt fysiologi. Men micropuncture begränsas av beroendet av konventionella mikroskopi till ytan nefronet funktioner och 2-photon studier är begränsade i att interventioner kan endast bedömas vid orgeln, snarare än nivån nefronet. I synnerhet har micropuncture studier av glomeruli möss ifrågasatts av bristen på ytan glomeruli i möss. För att lösa denna begränsning för att fortsätta studier av aspirera från Bowmans utrymme i mus fysiologiska modeller, utvecklat vi 2-photon glomerulär micropuncture. Vi presenterar en ny kirurgisk beredning som tillåter laterala till njuren samtidigt krävs imaging vertikalpelaren för 2-foton mikroskopi. Administrering av hög molekylvikt fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran används för att återge nedsatt vaskulatur och därför glomeruli synliga för 2-photon avbildning. Quantum dot-belagd pipett sedan införs under stereotaktisk vägledning till en glomeruli utvalda från flera många som kan visualiseras i fönstret imaging. I detta protokoll ger vi Detaljer för förberedelse, material och metoder som är nödvändiga för att genomföra förfarandet. Denna teknik underlättar tidigare-omöjligt fysiologiska studie av njure, inklusive återvinning av filtratet från Bowmans utrymme och alla segment av nefronet inom imaging djup gräns, ca 100 µm nedanför nedsatt kapseln. Tryck-, laddnings- och flöde kan allt mätas som med introducerade pipetten. Här, ger vi representativa uppgifter från liquid chromatography/mass spectrometry utförs på aspirera från Bowmans utrymme. Vi förväntar oss att denna teknik att ha brett tillämplighet i nedsatt fysiologisk undersökning.
Introduction
Syftet med detta förfarande är att ge rutin micropuncture tillgång till Bowmans utrymme och andra glomerulär strukturer hos möss. Micropuncture studier för nedsatt fysiologi har varit begränsad till 1-foton mikroskopi, som endast kan bilden inom några mikrometer av njure ytan, och som erbjuder begränsad precision i z-dimensionen. Eftersom möss har några surface glomeruli, det är inte alltid möjligt att hitta en yta glomeruli av 1-foton mikroskopi, därför de flesta micropuncture studier har genomförts i München-Wistar råttor, som har mer talrika ytan glomeruli. Fördelarna med att arbeta i musmodeller har därför begränsats i micropuncture studier1,2,3. Senaste framstegen inom imaging teknik, inklusive mikro-CT4,5, nanopartiklar imaging6och imaging masspektrometri7 har kraftigt förbättrat utbudet av regler för glomerulär fysiologi, men Det finns fortfarande inget substitut för den unika möjligheten att ingripa och prova att micropuncture ger. Därför utvidga användningen av micropuncture med hjälp av tekniker som presenteras här förväntas underlätta roman nedsatt fysiologi studier, särskilt utvärdering av innehållet i nedsatt filtratet (dvs, metabolomik) och grundläggande fysiologi transgena möss, till exempel mätningar av filtratet trycket och kostnad, tidigare utförde endast hos råttor.
Den här tekniken tillåter användning av 2-foton mikroskopi visualisering och mikropipett tillgång till nedsatt strukturer upp till ca 100 µm nedanför nedsatt kapseln. Flera (5 – 10) glomeruli är därför tillgänglig för micropuncture i varje mus njure hittills avbildas. Även om denna teknik delar vissa funktioner med konventionella nedsatt micropuncture, det var utformade de novo och omfattande ändringar från konventionell teknik krävs. I detta protokoll vi demonstrera aspiration av vätska från Bowmans utrymme och visar exempel på resultat av efterföljande analys med masspektrometri (nanoproteomics)8,9,10,11. Efterföljande användning av masspektrometri kräver en specialiserad prov förberedelse arbetsflöde, vilket demonstreras också här.
Protocol
Alla förfaranden beskrivs häri godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén av Oregon Health & Science University.
1. inställning som används för Demonstration
- Använda ett upprätt 2-photon-Mikroskop, en 3-axlig scenen controller, en headstage/pipett hållare och en 3-axlig controller för headstage/pipett innehavaren. alla fyra av dessa objekt krävs.
Obs: Många liknande uppställningar finns och kommer att räcka så länge oberoende kvantitativa 3-axlig styrning av pipetten och Mikroskop scenen finns tillgängliga, och Mikroskop är inställd för i vivo upprätt imaging.
2. material krävs före start experimentella protokoll
- Använd FITC-dextran, 2.000.000 Da, 5% lösning i fysiologisk koksaltlösning eller fosfatbuffrad saltlösning injektionsvätska retroorbital att markera den renala kärlsystemet. Detta molekylvikt (MW) har valts eftersom det finns kvar i vaskulatur och filtrera inte.
- Maskinen-drog borosilikatglas Mikropipetter: dra Mikropipetter till 6 – 10 µm spets med lång-taper, sluten tip inställningar (t.ex. värme = 610, hastighet = 150, tid = 250 ms, loopas) på en mikropipett avdragare. Kantskär till 45° och flame-polska lätt.
- Kvantpricken beläggning av Mikropipetter: Coat mikropipett tips med kvantprickar enligt refererade protokoll. 12
- Polysiloxane njure stöd/spacer. Använda polysiloxane kitt för att farkosten en njure stöd/spacer. Mode en 1 x 1 cm2 av 5 mm tjock rätvinklig romboidformade (dvs, en stympad kub) från polysiloxane putty. Ta bort den mellersta 70% av polysiloxane från ena kanten och en cirkel bestående av ca 70% av centrera av romboidformade. Låt polysiloxane torka i 24 h. Se figur 1.
- Microinjector beredning: Prefill en längd av polyetylen (PE)-50 slangar och innehavaren av en mikropipett-loaded mikropipett med olja. Om masspektrometri är planerad, perfluorodecalin krävs, annars mineralolja kan användas. Ställ in microinjector med en gas-tight Hamilton-typ sprutan och fyll med perfluorodecalin. Detta kommer att anslutas till den PE-50 slangar och pipett hållare.
- Placera pipetten i pipett hållaren och framåt fylla PE-50 slangar och pipett, sedan bifoga den proximala änden av PE-50 slangar på oljefyllda Hamilton sprutan, skapa ett hydrauliskt system från pipetten att spruta.
3. lateral pipett tillgång till njuren nedanför en vätska som Imaging kolonnen via en ny operationsmetod
Obs: Montering av de imaging support system och kirurgiska prep visas i figur 1. Proceduren utförs på C57BL/6 möss som väger 20 – 25 g.
- Väga musen.
- Inducera anestesi med 4% isofluran och underhåll med 1,5 – 2,5% isofluran i luften och oxygen. Bekräfta att musen är sövd genom avsaknad av svar på smärtsamt stimulus och minskad andningsfrekvens.
- Smörja ögonen och placera den animaliska lateralen på en bottenplatta. Immobilisera 4 extremiteter med tejp.
- Injicera fysiologisk koksaltlösning, 200 µL, subkutant och placera en rektal temperatursond. Kontrollera temperaturen med en värme lampa under operationen och en värmedyna under imaging.
- Ta bort alla hår på vänster sida av musen med en hårborttagningsprodukter kräm.
- Leta upp mjälten, som syns under huden, och leta upp den vänstra njuren på rygg- och stjärtfena sida av mjälte.
- Göra en 0,5 cm snitt på huden och mindre snitt på bukhinnan, bara tillräckligt för att njuren att driva igenom enkelt.
- Extrudera njuren med lätt tryck. Placera njure stabilisator form med polysiloxane runt njure och fixa med cyanoakrylatlim. Linje njuren med mellanlägget så att laterala-mest ytan av njure sträcker sig utanför stabilisator med ca 1 mm.
- En huvud fästplatta till formuläret stabilisator med lim och montera huvud plattan till montering barer på bottenplattan.
- Fyller väl i den polysiloxane stöd kring njurarna med 1% agaros lösning och placera det 10 mm täckglaset på toppen och håll tills agaros är fast. Försegla täckglas till huvud plattan med lim och skapa en ring runt täckglaset med dentala cement.
- Injicera FITC-dextran (2.000.000 Da, 5% lösning, 100 – 150 µL) retro-orbitally och flytta musen och fixering plattan på 2-photon Mikroskop scenen snabbt, underhålla anestesi och säkerställa tillräcklig avfall gas rensning på Mikroskop scenen.
4. Val av en lämplig njure och pipett tillgång till Bowmans utrymme
-
Definitioner:
- Definiera X som vänster-höger på skärmen och vänster-höger vänd mikroskopet
- Läs SX (stadium X) från scenen controller
- Definiera PX som pipett X, på pipetten ringa controller
- Definiera Y som upp och ner på skärmen och framåt mot mikroskopet och tillbaka 2-photon setup
- Definiera Z upp mot taket, ner mot golvet, och mätt på scenen med målet Z position.
- Definiera S (O) Z som scenen (verkligen målsättningen) höjden.
-
Hitta njure, identifierbara med grönt fluorescerande protein (GFP) filterinställningar i okulära ytan. På grund av injektion av FITC-Dextran blir vaskulatur ljust grön.
- Identifiera en lämplig njure. Efter att identifiera ytan av njurarna med hjälp av okulära, växla till 2-fotonen (icke-scanning mode) och utforska fönstret imaging. Goda egenskaper för micropuncture är följande: lodräta avståndet nedanför täckglaset > 30 µm (för att förhindra kollision mellan pipett och täckglas under tillgång) och laterala avstånd från laterala njure kapseln till glomeruli < 400 µm (utöver detta avstånd avvikelsen av pipetten kan öka sannolikheten för en miss).
- Spela in laterala och vertikala avstånd till punkteringen punkt, en punkt på nedsatt kapseln direkt till pipett-sida i glomeruli.
- Höja den objektiva kontaktpunkten i vattenmassan, att hålla x och y scenkoordinaterna oförändrad, en sträcka på bara cirka en centimeter.
- Köra pipettspetsen i vattenmassan och slå på 4', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) excitation. Flytta pipetten i x och y dimensioner till peka av maximal fluorescens i spetsen, kommer detta vara mitten av målet. Att hitta pipetten i okulära är svårt utan denna precisa prepositioning. Eftersom kvantprickar fluorescerar vid den samma (i detta fall, röd) våglängden oavsett excitation våglängd, producerar DAPI magnetiseringen röd fluorescens som är hårt fokuserade på tipset, illustreras i figur 2.
- Ändra inställningen magnetiseringen till röd fluorescerande protein (RFP) och visualisera okulära pipetten, sedan exakt centrera det i vyn okulär.
- Växla till 2-photon och hitta pipetten under 2-photon, placera den exakt i mitten av bilden. Detta är den registrering positionen.
- Spara en bild av pipetten.
- Registrera scenen och mikropipett controller koordinaterna.
Obs: Använda kompletterande .html fil, som kommer att utföra beräkningar med hjälp av JavaScript-kod, (fördelaktiga på system som inte har installerat kalkylprogram) eller ett kalkylblad för att beräkna förskjutningen mellan scenen och pipett koordinater och att beräkna målet koordinaterna för pipetten styrenhet. - Ta bort pipetten från vattenmassan i x-axeln, att hålla z och y samma.
- Flytta pipetten Z till det målet glomeruli Z (dvs flytta pipetten ner i Z riktning under täckglaset)
- Flytta pipetten Y till målet glomeruli Y koordinat.
- Flytta 2-photon live-vyn till den mål glomeruli Z och sedan till kanten av njuren och notera SX.
- Beräkna njure kanten PX använder offset från registreringen SX.
- Flytta etappen mot pipetten (öka SX) så att kanten av njurarna är långt till vänster om skärmen, men fortfarande synliga.
- Förväg pipetten snabbt till ca 100 µm mindre än njure kanten PX som beräknats ovan.
- Placera pipettspetsen, avancera pipetten långsamt. Öka röd vinsten och titta på röd pixel histogrammet (de pixel distribution Skift innan pipetten är avbildade i fönstret, på grund av extrema ljusstyrka kvantprickar och off-target fluorescens).
- Avancera till njure kanten under live 2-photon imaging.
Obs: Innan nedsatt kapseln, det är möjligt att omdirigera pipetten i Y och Z dimensioner. Detta dock kan bryta pipettspetsen. En mer konservativ åtgärd, är om pipetten är släckt mål, att dra tillbaka i dimensionen X upp till 2 cm, omdirigering och sedan Retur i X dimensionen till njure kanten. När pipetten är inom vävnaden, rörelse i någon axel än X leder till pipetten flexion vilket kräver stor erfarenhet för att göra användningen av, och ofta leder till brott. - Kör pipetten i X-axeln långsamt till målet för glom PX, hålla ett öga på SX. (Det är bra att ibland gå tillbaka till den glomeruli att se om det har skiftat alls vid införandet av en mikropipett).
- När du är på rätt plats, dokument position med en z-stack.
Obs: Med en mikropipett på plats, droger, proteiner eller fluorescerande spårämnen kan injiceras, vätska kan vara aspirerade för senare analys eller tryck eller kostnad i förhållande till en annan elektrod kan mätas.
5. aspiration av vätska från Bowmans utrymme
- Ange micropump att injicera 100 nL av perfluorodecalin över 2 min att säkerställa patency av pipetten och minska confounding från pipett pluggning under posten. Reimage för pipetten position.
- Vänta 4-6 min för ytterligare filtrering.
- Ange micropump att aspirera upp till 300 nL med en hastighet på upp till 50 nL/min.
Obs: Förändringar i glomerulär morfologi observeras inte med denna takt tyder på det inte ändrar från leverans av vätska till utrymmet under aspiration. Eftersom det finns ingen olja block som i konventionella micropuncture, kan återvinning av denna volym, som behövs för masspektrometri, omfatta några av de injicerade perflourodecalin och möjligen tubulär vätska. För analyser som ion-känslig elektrod mätningar fluorescens-spektroskopi, polymeras-kedjereaktion och andra känsliga effektmått, kan lägre volymer användas. Om masspektrometri inte är slutstationen, kan mineralolja och standard micropuncture tekniker användas för att mäta aspirerade volymen före lagring. - Bild en gång till.
- Dra tillbaka pipetten och bevara provet, lägga till TRIS buffert och lagring vid-80 ° före analys.
- Avliva musen med hjälp av en överdos av isofluran eller annan godkänd metod.
Obs: Filtratet in utrymmet genom filtrering från glomerulär kapillärerna. Den enda-nefronet glomerulär filtrationshastigheten (SNGFR) hos möss har rapporterats mellan 8 – 14 nL/min.3 Starling krafter styr SNGFR, emellertid, och negativa hydrostatiska trycket i Bowmans utrymme därför kan öka SNGFR. Standard micropuncture metoder använder tubulär blockad med olja och neutrala tryck för tubulär vätska provtagning, men dessa föreningar störa masspektrometri (se nedan). den här tekniken förblir därför den tidiga proximala tubuli patent. Ytterligare, vid tidpunkten för aspiration, Bowmans utrymme innehåller en okänd, men positiva volym filtrat. Därför kan flytande aspiration överstiga SNGFR.
Obs: I de experiment som beskrivs här, målet var att få en större än vanligt prov av glomerulära filtratet för masspektrometri analys av nanoproteomik tekniker. Eftersom användning av masspektrometri utesluter användning av olja block med mineralolja eller vax (komplexa blandningar av organiska molekyler som minskar signalbruset: i masspektrometri) används perfluorodecalin att fylla mikropipett och spruta. Perflourodecalin är inte känt att blockera tubulär flöde, men är biologiskt inert och stör inte masspektrometri.
Representative Results
Detta förfarande kräver en unik kirurgisk beredning av njure för 2-photon imaging och tillgång, vilket illustreras i figur 1. Detta preparat som visas här tillåter en tänkbar vertikalpelaren med målet ovanför njurarna med några densiteten ändras för bästa möjliga optik för 2-foton mikroskopi samtidigt med laterala tillgång för pipetten, drivs uteslutande i vågrätt (x ) dimension. Partiell extrudering av njure förhindrar överflödigt spänningen på den renala BLOMSTJÄLK och bevarar vaskulär flöde, och byggandet av en anpassad njure stöd gör det möjligt för de två målen imaging och tillgång. Den andra utmaningen i den här proceduren är exakt positionering av pipetten inom njuren i 3 dimensioner, som kräver registrering av koordinatsystemen pipett och scenen. Det kritiska steget för denna process illustreras i figur 2, som visar pipetten att upptäckas i kolumnen vatten av 2-foton Mikroskop under DAPI-excitation. Att ange vattenmassan och registrera koordinaterna för pipetten till dem på scenen innan njurarna är avgörande för att aktivera exakt stereotaktisk positionering av pipetten inom de mål Bowmans utrymme. Pipetten träder imaging vattenmassan från höger. Röd quantum dot-belagd pipetten fluorescerar i ljust i de röd-orange med DAPI magnetisering aktiverat, och det kan placeras noggrant under mitten av målet. Magnetiseringen strålen passerar genom mitten av målet, förflyttas pipetten fritt att peka av maximal fluorescens, säkerställa att det kommer att vara synlig i okularet.
Korrekt pipett dra och glomeruli urval är avgörande för framgång i detta protokoll, som illustreras i figur 3, figur 4, figur 5. En korrekt-draget, röd fluorescerande quantum dot-belagda glas mikropipett avbildas i kolumnen vätska under pipetten registrering delen av förfarandet kan ses i figur 3A. Spetsen är 6 mikrometer i bredd. I figur 3Bvisas dåligt-drog pipett med 12 µm spets. Denna pipett kan inte tränga igenom nedsatt kapseln utan att orsaka vaskulär trauma på grund av 12 µm diameter och oregelbundna tip yta (Observera bur överst på avfasningen). I figur 3 c och 3Dvisas vikten av optimal positionering snarare än avbildning av den mål glomeruli. Den vackra, ytnära glomeruli illustreras i figur 3 c visar gynnsamma imaging (på grund av sin yta ståndpunkt vid 20 µm nedanför nedsatt kapseln) men skulle inte vara lämplig för åtkomst genom detta förfarande eftersom det är för nära ytan, och pipetten skulle slå täckglaset. I figur 3Dvisas optimalt placerade glomeruli. Notera de olika skala som används för att illustrera både glomeruli (skala barer är alla 50 µm). Dessa glomeruli visas mindre skarp på grund av refraktion orsakas av djup; denna bild togs på 70 µm nedanför nedsatt kapseln. Laterala njure kanten är 250 µm till höger, gör båda dessa glomeruli tillgänglig. Under ett förfarande för access imaging är hårt fokuserad på det målet glomeruli som i figur 4, och varje sekund bild förvärvandet används, så att utredaren uppmärksamma exakt positionering av pipetten i Bowmans utrymme.
Figur 4 illustrerar en typisk nedsatt post och resultatet, en pipettspetsen inom Bowmans utrymme. I figur 4Avisar en genomsnittlig intensitet projektion från ett z-stack med ortogonala visningar pipettspetsen i Bowmans utrymme. Observera att det finns röda pipett tip spektrala artefakt (rund boll av fluorescens) på grund av extremt ljusa fluorescens av kvantprickarna arrangerade på den koniska delen av spetsen. I figur 4Bvisar en volym projektion av z-stack data en annan pipett i Bowmans utrymme. Observera att pipetten släpade Bowman's kapsel i färdriktningen på posten, skapa uppenbara tält bakom spetsen som beskrivs i protokollet.
I figur 5visas resultaten av en misslyckad procedur som en pipett med en alltför stor öppning bröt vid nedsatt kapseln, orsakar blödning. Pipetten var alltför trubbiga; på försök att passera nedsatt kapseln, pressades kapseln före pipettspetsen tills brott inträffade. I denna bild är nedsatt kapseln synlig, förstärkt av subcaspular blödning, i FITC-fluorescerande grön. FITC signal är synliga inom pipetten själv, som visar att blod under tryck in pipett lumen. Pilen pekar många röda blodkroppar synliga inom pipett lumen som fylla defekter i den FITC-dextran.
Figur 6 visar representativa masspektrum erhållits från Bowmans utrymme aspirera, mus urin protein 17 (MUP17). Slutligen visar tabell 1 exempel på resultat av framgångsrika aspiration förfaranden, notering proteiner identifierats med nanoskala masspektrometri på aspirera samlas in under 6 minuter från varje 3 möss. I varje fall fotograferades pipetten som det drogs tillbaka från Bowmans utrymme, och ingen FITC fluorescens observerades inom Bowmans utrymme eller pipetten lumen, som anger brist på aspirera kontaminering med plasma. 17 proteiner, främst av låg molekylvikt, identifierades från minst 2 unika peptider per protein. Spektral räknas är låg, överensstämmer med tidigare uppskattningar av protein i glomerulära filtratet och känd filtrerade proteiner, såsom vitamin D-bindande protein (VTDB), albumin (ALBU), och stora urin protein 17 (MUP17) är närvarande.
Figur 1: partiell extrudering av njure med anpassad support och immobilisering för laterala åtkomst. Till vänster visas delarna av imaging kolumn och njure stöd med komplett montering i centrum. Till höger njure preparatet visas före (ovan) och efter (under) ansökan om stöd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: slutfört njure prep på pipetten registreringen steg protokoll. Här, används DAPI excitation för att placera mikropipett inom vattenmassan i mikroskopet 2 fotonen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: avbildning av pipetter och njuren efter injektion av FITC-dextran, visar lämpliga och olämpliga glomeruli för micropuncture. A. en väl drog pipett med 6 µm spets. B. en grov kanter, trubbig spets. C. detta glomeruli är väldefinierade, men alltför nära täckglaset för micropuncture. D. Lämpligt placerad glomeruli. Skala barer är alla 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: framgångsrika pipett passage leder till placering i Bowmans utrymme-vyer från 2 olika förfaranden. A. Z-stack med ortogonala projektioner visar pipettspetsen i Bowmans utrymme abutting glomerulär tofs. Skalstapeln är 50 µm. B. Volym rendering från z-stack visar likaså en pipett i Bowmans utrymme abutting glomerulär tofs. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: ett misslyckat förfarande på grund av en trubbig pipett, Riva nedsatt kapseln och leder till blödningar i pipett lumen. FITC fluorescens från extravasering plasma och röda blodkroppar (pil) är synliga inom pipetten. Pilen pekar mot röda blodkroppar synliga inom pipett lumen. Skalstapeln är 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: massa spektrumet för stora urin protein 17 (MUP17), erhålls från nanoskala liquid chromatography/mass spectrometry analys av Bowmans utrymme aspirera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protein | MW (kD) | Menar spektrala Count |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6,7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Tabell 1: Lista över proteiner identifierats i Bowmans utrymme aspirera från 3 möss.
Kompletterande Video 1: en volym rendering från en z-stack som förvärvats efter positionering en pipett i Bowmans rymden visar pipettspetsen inom det utrymme, abutting kapillär tofs. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Vi presenterar en metod för att komma åt Bowmans utrymme av icke-surface glomeruli i möss, underlättas av 2-foton mikroskopi. Vi utvecklade denna procedur för att ta itu med en viktig begränsning av glomerulär micropuncture, sällsynthet av surface glomeruli adresserbara av 1-foton mikroskopi hos möss, för att underlätta en experimentell målsättning, aspiration av vätska från Bowmans utrymme för efterföljande analys. Utveckling och praktik av denna teknik vilar på sex viktiga steg. Första måste romanen kirurgisk beredning noggrant utföras så att imaging vattenmassan körs inte utanför täckglaset och täckglaset sträcker sig över området i njure som är målet för pipetten. Andra måste glas pipetten används för micropuncture återges synligt för 2-foton mikroskopi, som åstadkoms med hjälp av kvantprickar. Tredje, stereotaktisk teknik krävs för att placera exakt en pipett i Bowmans utrymme i tre dimensioner, upp till 100 µm under njure ytan. Att registrera koordinatsystemen pipetten och scenen med precision är därför kritiska moment. Fjärde, noggrant urval av de mål glomeruli är nödvändigt att säkerställa tillgång till pipetten utan impingement av njure stödstruktur och imaging kolumn. Slutligen, noggrann hänsyn måste tas till de analytiska steg att följa förfarandet för förvärvet, och volym och tidpunkten för förvärvet av vätskeprover måste matchas till analysen och glomerulär fysiologi.
Vi utformade ett förvärv förfarande som kan förlängas till många analyser, inklusive traditionella micropuncture effektmått, såsom flamfotometri, ion-känslig elektrod mätningar eller mätningar av tryck, volym eller kostnad. Dessutom, tror vi att denna teknik kommer att vara mottagliga för romanen analytic endpoints inklusive polymeras-kedjereaktion (kanske efter omvänd Transkription för miRNA) och metabolomik nedströms av masspektrometri. De särskilda ändringar som används för att underlätta masspektrometri förtjänar ytterligare diskussion och de införa vissa begränsningar. Först även om masspektrometri är mycket känsliga, de låg proteinhalt och volymen av micropuncture prover återger analys av protein under det dynamiska intervallet av konventionella proteomiska utforskning och därför förenklade nanoproteomics var nödvändigt. 8 , 13 andra, för att optimera protein avkastning för tidiga analyser, vi fast beslutna att 200-300 nL av aspirera var nödvändigt, men de novo filtratet förvärv av denna volym skulle kräva kanske så länge som 20 minuter av aspiration om musen GFR är bara 8-14 nL / min3. Som Tojo och Endou visat att långvarig aspiration förändrar albumin innehållet i tidig proximala tubuli flytande14, valda vi att aspirera under 6 minuter; emellertid innebär detta att vår strävan hastighet överstiger inflödessats på filtratet. Användare av proceduren uppmuntras att överväga physiologyen av glomerulär filtration i deras experimentella system designa deras arbetsflöde. Masspektrometri, en känslig teknik, skulle bli överväldigade av signalen från en introducerade petroleum destillat såsom mineralolja, som vanligtvis används i micropuncture för att omfatta det hydrauliska systemet för aspiration och isolera segment av nefronen. Därför, vi kunde inte använda mineralolja för detta ändamål, eller sin andra gemensamma använder, kvantifiering av volym av nliter utbud prover. Istället fyller vi systemet med perfluorodecalin som är biologiskt inert, stör inte masspektrometri, och har goda optiska egenskaper. Vi tror de begränsningar av perfluorodecalin lösas och arbetar på ytterligare tekniska innovationer som vi förväntar oss kommer att tillåta mätning av provvolymen och blockad av tubulär segmentet.
De flesta micropuncture studier har utförts i München-Wistar råttor, som visar ökat antal ytan glomeruli, men denna kraftigt begränsade fysiologiska studie av tubulär transport och andra nedsatt fysiologi på grund av förlusten av grundläggande verktyg för molekylärbiologi, transgena möss2,3. Eftersom det underlättar mikropipett tillgång till Bowmans utrymme i möss, mildrar i ny teknik därför dessa kritiska begränsningar. Vi antog denna teknik för att få tillgång till nedsatt filtratet för proteomiska studier med hög känslighet masspektrometri, känd som nanoproteomics9. Det finns dock sannolikt ytterligare program. Till exempel har nedsatt fysiologiska studie av filtrerat protein varit kraftigt understödda av användning av fluorescerande spårämnen med 2-foton mikroskopi15,16,17. Tillägg av micropuncture till 2-foton mikroskopi erbjuder möjlighet att utföra singel-nefronet fysiologiska studie med fluorescerande molekyler, vilket gör att närliggande, icke-injiceras nephrons som kontroller. Förhoppningen är att denna tydliga förklaring av nödvändiga åtgärder kommer att tillåta brett antagandet i labs redan utrustade för 2-foton mikroskopi och/eller micropuncture. Men det är komplext, vi har nu utfört proceduren många gånger och de förbättringar som presenteras häri utgör en stabil plattform för fysiologiska upptäckt.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 till MPH. NIGMS P41 GM103493 RDS. Detta material är resultatet av arbete (genom MPH) som stöddes med resurser och användning av faciliteterna på den Portland Veterans Affairs Medical Center. Innehållet representerar inte åsikter US Department of Veterans Affairs eller Förenta staternas regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
