Summary
为了改进结核分枝杆菌抗原的血清学诊断测试，我们开发了超副磁性氧化铁纳米探针来检测肺外结核病。
Abstract
合成了一种分子成像探针，包括超副磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒和结核分枝杆菌表面抗体（MtbsAb），以提高肺外结核（ETB）的成像灵敏度。合成了SPIO纳米探针，并与MtbsAb结合。纯化SPIO-MtbsAb纳米探针采用TEM和NMR进行特征。为了确定探针的靶向能力，SPIO-MtbsAb纳米探针与Mtb一起孵育，用于体外成像测定，并注射到Mtb接种小鼠体内进行磁共振（MR）的体内调查。Mtb和THP1细胞磁共振成像（MRI）的对比度增强降低与SPIO-MtbsAb纳米探针浓度成正比。在30分钟静脉注射SPIO-MtbsAb纳米探针注射Mtb感染小鼠后，与接受PBS注射的小鼠相比，在T2加权MR图像中，肉芽肿位位的信号强度提高了14倍。MtbsAb 纳米探针可用作 ETB 检测的新方式。
Introduction
在全球范围内，肺外结核病（ETB）占结核病病例的很大比例。然而，ETB诊断往往错过或延迟，因为它的阴险的临床表现和诊断测试的不良表现;错误的结果包括痰涂片对酸快杆菌的阴性，缺乏组织病理学上的肉芽肿组织，或未能培养结核分枝杆菌（Mtb）。与典型病例相比，ETB发生频率较低，并且很少涉及 Mtb 杆菌的释放。此外，它通常被本地化在难以接近的部位，如淋巴结，胸膜，和骨关节区域1。因此，侵入性程序，以获得足够的临床标本，这使得细菌确认的风险和困难，是必不可少的2，3，4。
市售的ETB抗体检测测试在临床检测中不可靠，因为它们的灵敏度范围广泛（0.00-1.00）和所有肺外位点结合的特异性（0.59-1.00）。5 。干扰素β、培养性滤蛋白（CFP）和早期分泌抗原靶点（ESAT）的酶相关免疫点（ELISPOT）检测已用于诊断潜伏和活性结核病。然而，结果因诊断ETB6、7、8的不同疾病部位而异。此外，皮肤PPD（纯化蛋白衍生物）和昆蒂弗龙-结核病经常提供假阴性结果9。QuantiFERON-TB-2G是一种全血免疫反应测定，不需要从受影响的器官标本，这可能是一个替代诊断工具6，10，11。其他通常用于结核病脑膜炎的诊断方法，如聚合酶链反应，仍然过于麻木不仁，无法自信地排除临床诊断12，13。这些常规测试表明，没有足够的诊断信息来发现肺外感染部位。因此，临床上需要新的诊断模式。
分子成像旨在设计新的工具，可以直接筛选体内疾病过程的特定分子靶点14，15。超副磁性氧化铁（SPIO），一种T2加权NMR造影剂，可以显著提高磁共振（MR）成像（MRI）16、17的特异性和灵敏度。这种新的功能成像模式可以通过配体受体相互作用在分子水平上精确绘制组织变化草图。在这项研究中，合成了一种新的分子成像探针，包括SPIO纳米粒子，与Mtb表面抗体（MtbsAb）结合，用于ETB诊断。SPIO纳米探针是微创对组织和身体在检查18，19。此外，这些纳米探针由于其顺磁特性，可以在低浓度下显示精确的MR图像。此外，SPIO纳米探针似乎引起最少的过敏反应，因为铁离子的存在是正常生理的一部分。在这里，在细胞和动物模型中评估了针对ETB的SPIO-MtbsAb纳米探针的灵敏度和特异性。结果表明，纳米探针可作为超敏感成像剂用于ETB诊断。
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Protocol
所有有关动物实验的协议均遵循美国国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》（2011 年第 8 版）的标准实验室动物育种操作程序，并经机构动物护理和使用委员会。
1. SPIO纳米粒子合成
- 在室温下大力搅拌 Dextran T-40 （5 mL; 50% w/w） 和水性 FeCl3±6H2O （0.45 g; 2.77 mmol） 和 FeCl2×4H2O （0.32 g; 2.52 mmol） 溶液的混合物，制备涂有氧化铁的磁性纳米颗粒。
- 快速添加 NH4OH （10 mL; 7.5% v/v）。
- 进一步搅拌黑色悬浮液1小时;随后，在17，300 x g下离心10分钟，然后取出骨料。
- 通过凝胶过滤色谱20将最终的SPIO产品与未绑定的D-40分离。
- 将反应混合物（总体积 = 5 mL）装入2.5厘米×33厘米柱中，在pH 7.0下加入含有0.1M Na醋酸和0.15 M NaCl的缓冲液。
- 在空隙体积中收集纯化的氧化铁磁性纳米颗粒，分别使用盐酸和苯酚/硫酸方法测定330和490nm的铁和dextran的柱。
2. SPIO-MtbsAb合成
- 合成SPIO结合EDBE使用先前报告的方法21，22。
- 合成SPIO-EDBE-琥珀氢化物（SA）。
- 在室温下搅拌SPIO-EDBE和SA的碱性溶液（5M NaOH;10 mL）24小时。
- 使用分子多孔膜管（12，000-14，000 MW 截止）对2L蒸馏水进行20次变化。每次更换 6 小时。
- 最后，将100μL的SPIO-EDBE-SA（4毫克/毫克铁）加入400μL的4.5毫克/mL MtbsAb，使用1-羟基苯甲酸酯和（苯甲酰胺-1-yloxy）三重磷酸二磷酸二铵作为催化剂，在24h室内搅拌溶液。
- 最后，通过凝胶过滤色谱法将溶液与未结合抗体分离。
- 将反应混合物（5 mL）加载到2.5厘米×33厘米柱上，并使用PBS缓冲液洗脱。使用双辛酸酸蛋白测定试剂盒23确认Ab_nano粒子复合物（即纳米探针）。
3. 粒子形态观察和松弛层测量
- 在100kV电压下使用透射电子显微镜检查平均粒径、形态和尺寸分布。
- 将复合色散滴铸到 200 个网状铜格栅上，并在室温下干燥，然后再将其加载到显微镜上。
- 在 20 MHz 和 37.0 °C 和 37.0 °C ± 0.1 °C 下使用 NMR 松弛计测量纳米探针的松弛时间值（T1和T2）。
- 每次测量前校准松弛计。
- 分别记录通过反转恢复和Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列生成的8个数据点的r1和r2值，以确定r1和r2放松度20。
4. 细胞成像
- 在 RPMI 1640 中培养人单核细胞 THP-1，在 37°C 下 5% CO2培养箱中培养 10% 的胎儿牛血清、50 μg/mL 金霉素硫酸盐、100 单位/mL 青霉素 G 钠、100 μg 链霉素硫酸盐和 0.25 μg/mL 真菌区。
- 用106个菌落形成单元（CFU）孵育SPIO-MtbsAb纳米探针（2 mM），在37°C的5%CO2培养箱中孵育1×107活性单核细胞，在37°C下孵化1小时。
- 在200 x g下离心管，并丢弃上清液。在介质（200 μL）中重新溶解颗粒。
- 使用快速梯度回波脉冲序列扫描样本（重复时间 （TR） = 500;回波时间 （TE） = 20;翻转角度 = 10°）通过3.0-T MRI来确定纳米探针的特异性和灵敏度21，22。
5. BCG（卡尔梅特-盖林）接种
- 重建冻干疫苗或细菌库存在Sauton的介质，然后用盐水稀释股票，直到正确分散，如前所述24。
- 接种从ADIMMUNE（台湾台北）获得的M.bovis BCG活衰减应变（康诺特菌株;ImmuCyst Aventis， 巴斯德·梅里厄斯） 在 0.1 mL/鼠标 （即 107 CFU） 的体积在贸易到小鼠的左或右背颈皮，如前面描述的23。将盐水注射到小鼠体内作为阴性对照。BCG 接种后，每天监测动物。
- 使用二氧化碳安乐死在细菌接种后1个月牺牲动物。从内皮接种部位收获组织。将组织固定在10%的形式素中，并嵌入石蜡的序列部分在5-10μm. 染色组织部分与血氧林/eosin和Ziehl-Neelsen染色酸快细菌24和柏林蓝色铁铁25。
6. 体内核磁共振成像
- 将氯胺酮（80毫克/千克体重）和木兰辛（12毫克/千克体重）分皮注射到小鼠体内进行动物麻醉。
- 将SPIO-TbsAb探针（2 nmol/200μL）注射到小鼠的尾静脉中。MR图像小鼠在探针注射前后，然后每5分钟30分钟获得T2加权快速自旋回波图像（TR = 3000;TE = 90;视场 = 8）。
- 使用信号强度 （SI） 定量分析所有 MR 图像，这是 Mtb 肉芽肿中心与肉芽肿区域相邻的背部肌肉的可比位置的测量目标区域。
- 使用 SI 测量值计算相对信号增强功能，在使用公式注入造影剂之前（SIpre;控制）和 0-3 小时后（SIpost） 注入对比度代理
[（SIpost - SIpre）/SIpre] = 100
其中SIpre是病变的SI在预增强扫描和SIpost是增强后扫描21，22的病变的SI。
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Representative Results
SPIO-MtbsAb 纳米探针合成和表征
SPIO纳米粒子被设计成与MtbsAb结合。稳定在SPIO纳米粒子表面的dextran被上氯二苯并联。SPIO纳米粒子随后与EDBE结合，以激活dextran端的初级胺功能组。SA 然后被结合形成 SPIO-EDBE-SA。SPIO-MtbsAb 纳米探针在耦合剂存在的情况下，通过 MtbsAb 与 SPIO-EDBE-SA 结合，在最后一步中形成。SPIO-MtbsAb纳米探针的TEM图像（图1）表明SPIO-MtbsAb纳米探针的外观分布良好。SPIO-MtbsAb 纳米探针芯的平均尺寸为 3.8 × 0.4 nm（200 个粒子计算）。
在水溶液中，纳米探针的松弛度值r1和r2分别为23×3和151×8mM-1s-1，分别为20 MHz和37.0°C~0.1°C。SPIO-MtbsAb纳米探针的r1/r2比与Resovist相似;然而，Resovist的r1和r2（分别为26和164mM-1s-1）略高于SPIO-MtbsAb纳米探针。
体外SPIO-MtbsAb纳米探针表征和成像
首先，我们通过Ziehl_Neelsen染色（图2A）检测出M.bovis BCG，一种酸性快速细菌。细菌被分离出来，然后用含有铁铁的探针培养，通过柏林蓝色染色可以识别（图2B）。通过T2加权核磁共振成像确定SPIO-MtbsAb纳米探针的Mtb靶向度;负增强与附着在细菌细胞上的探针量成比例。在纳米探针存在的情况下，SI的降低以浓度相关的方式发生（图2C）。在 2、1 和 0.5 mM 时，与 Mtb 结合的纳米探针表现出 97.67 ± 3.05、131.67 × 4.51 和 257.33 = 5.03 的 SI，均高于 1 mM 非共聚纳米探针的 90.75 ± 2.47 的 SI。与 PBS（SI = 1073.43 = 13.62）相比，仅 TB 组（SI = 957.33 = 12.53）几乎没有信号降低。因此，SPIO探测器专门针对Mtb杆菌;此外，在增强的MR图像上，SI随着SPIO纳米粒子量的增加而降低。
同样，在用纳米探针培养THP-1单核细胞后1小时，在增强型MR图像上的SI减少被注意到。与仅使用PBS（SI = 1005.33 = 16.74）或未使用纳米探针的组相比，使用1 mM（SI = 225.33 = 8.58）和2 mM（SI = 104 = 2.16）的纳米探针浓度显著降低。obe （SI = 991 = 8.98）。Mtb组1个和2个mM纳米探针的MRI SI减少与单1 mM纳米探针组（SI = 112.33 = 3.68）的MRI SI减少量相当。根据上述结果，SPIO-MtbsAb纳米探针可以帮助监测纳米探针激活的THP-1单核细胞贩运。
体内 SPIO-MtbsAb 纳米探针成像
细胞成像后，我们确定了体内MRI对ETB的疗效。SPIO-MtbsAb纳米探针被静脉注射给Mtb感染的小鼠。注射后0.5小时，在Mtb肉芽肿区注意到一个清晰可见的MR信号;然而，在注射1小时后观察到最高SI到背景。在Mtb肉芽肿区（图3）中，MR信号显著减少。SI在（SIpre）和（SIpost）造影剂注射后进行测量。探针注入一小时后，Mtb粒体区域信号还原的T2加权增强（图3B）比控制部位高约14倍（图3A;-1.68%=1.32%和-23.43%=7.24%;p < 0.001）。
SPIO-MtbsAb纳米探针的组织学和免疫组织化学评价
C57BL/6小鼠感染1个月后，出现皮下肉芽肿。新的血液血管化在这些病变内与淋巴细胞和上皮体-巨噬细胞聚集物一起被注意到。有组织的肉芽肿已逐渐生长（图4A）。通过Mtb表面抗原与抗MtbsAb的免疫性化学反应，进一步确定了结核病病变与SPIO-MtbsAb MR信号的相关性。在肉芽肿区（图4B）中显示阳性MtbsAb表达，在病变部位呈阳性（图4C）。柏林蓝色，铁质阳性的污渍，被用来确定探测器对Mtb的敏感性。 柏林蓝正SPIO探头被发现在同一位置与MtbsAb（图4D）。所有共位化对如图4A-D所示。
图1：TEM中SPIO-MtbsAb纳米探针的平均核心尺寸。SPIO-MtbsAb 纳米探针芯的平均尺寸为 3.8 ± 0.4 nm，使用 TEM 图像分析 （200 粒子计算）进行测量。刻度条 = 15 nm。这个数字已由我们先前的研究26修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：SPIO-MtbsAb纳米探针体外表征。酸速杆菌通过（A） 齐尔-内尔森染色和 （B） 纳米探针铁铁与通过柏林蓝色染色识别的细菌的偶联物进行识别.（C） T2 加权 MRI 在 SPIO-MtbsAb 纳米探针用 Mtb 孵育后呈负增强。（2） 97.67 × 3.05 （Mtb = 2.0 mM 探头）;（3） 131.67 × 4.51 （Mtb ±1.0 mM 探头）;（4） 257.33 × 5.03 （Mtb = 0.5 mM 探头）;（5） 957.33 × 12.53 （Mtb +0 mM 探头）;（6） 1073.43 × 13.62 （PBS）。PBS 对照组中未发现可检测到的信号减少。（D） 在用纳米探针孵育后1hh的THP-1单核细胞中剂量依赖性负增强。（C） 和 （D） 中的刻度条为 5 mm。这个数字已由我们先前的研究26修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：C57BL/6小鼠皮下ETB病变的体内SPIO-MtbsAb纳米探针。（A） 控制和 （B） Mtb 肉芽肿区域.与探针给药后1小时的控制区域相比，Mtb肉芽肿区域MR信号显著减少14倍（-1.68% = 1.32% vs. -23.43% = 7.24%，p < 0.001）。结果以SD为手段给出。统计比较使用双尾学生的t测试。p < 0.05 被认为是重要的。这个数字已由我们先前的研究26修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：方法学、免疫性化学、酸速和柏林蓝色染色的相关性。Mtb肉芽肿区的主要症状是淋巴细胞和上皮体巨噬细胞。在这些病变中观察到淋巴细胞和上皮性巨噬细胞的新血管化和大量聚集。（A） 有组织状的肉芽肿似乎逐步发展.（B） 免疫组织化学染色在肉芽肿病变中表现出MtbsAb表达，而（C）酸快杆菌则分散在同一区域。（D） 柏林蓝色染色SPIO探头在共位MtbsAb区域被发现.铁铁的柏林蓝色染色表明探针与Mtb结合。刻度条为100μm。这个数字已由我们先前的研究26修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
与相关研究类似，我们对SPIO-MtbsAb纳米探针的发现表明Mtb27、28具有显著特异性。在小鼠模型中注射TB后1个月，发现了皮下Mtb肉芽肿。典型的结核肉芽肿学发现包括淋巴细胞渗透、上皮性巨噬细胞的存在和新血管化。酸速杆菌分散在结核病变中，证实了MtbsAb免疫性化学发现。这表明Mtb表面抗原和MtbsAb之间的免疫反应。柏林蓝突出显示了与MtbsAb相同的区域，证实了探头与酸速Mtb结合的特异性。
值得注意的是，Mtb和单细胞THP1细胞MRI的负对比度增强程度与SPIO-MtbsAb纳米探针浓度成正比。当携带Mtb肉芽肿的小鼠施用SPIO-MtbsAb纳米探针时，在T2加权MR图像上注意到，与使用PBS注射的对立面位相比，在肉芽肿位上的信号减少14倍。这表示对比度代理的大量累积。结果表明，获得对比剂特定靶向的可能性，可降低临床诊断的剂量要求。
我们的发现表明，这些纳米探针在Mtb肉芽肿病变中积累可检测的体积。这些结果可以通过开发使用抗hMtbsAb的SPIO纳米探针来证实。由于SPIO的磁性氧化铁芯已应用于诱导MRI造影剂中的T2缩短，研究结果为临床诊断应用检测类似细胞行为提供了一种实用且非侵入性的方法。
在这里，我们提供由两部分组成的协议：第4至6节是细胞和动物成像。这些技术包括细胞培养、动物实验和光学成像。第 1 到 3 节是探测合成。一些关键步骤将有助于复制实验。SPIO纳米粒子合成的关键步骤是制备涂有dextran涂层的氧化铁磁性纳米粒子;在室温下大力搅拌并完全混合 dextran T-40、水性 FeCl3-6H2O 和 FeCl2-4H2O 溶液至关重要。第2节，SPIO-MtbsAb合成的关键步骤是将MtbsAb与SPIO-EDBE-SA结合，以合成SPIO-MtbsAb。选择合适的催化剂并在室温下充分搅拌溶液也至关重要。第 3 节，粒子形态观察和松弛层测量的关键步骤是在每个测量之前校准松弛计。为了精确计算探头的大小，松弛计的校准也至关重要。
在这项研究中，使用了M.bovis BCG和兔子抗Mtb。牛和兔源的交叉反应被认为是温和的，尽管数据证明MtbsAb结合的SPIO揭示了与M.bovis BCG的强相互作用。我们的发现表明SPIO纳米探针特别针对结核病。纳米探针和Mtb细菌的孵育呈负增强方式，剂量依赖性，而MRI上SPIO纳米探针的增强与SPIO颗粒的存在相关。根据我们的数据，进一步研究，以探索可能的抗体结合方法，以提高纳米探针的特异性将是受欢迎的。
先前的研究表明，SPIO显示最小的细胞毒性，而不改变细胞活性在在这项研究中使用的浓度29，30。与先前的研究一致，我们的研究结果显示SPIO纳米探针对THP-1细胞的影响最小。THP-1细胞用SPIO纳米探针与细菌结合孵育1小时。与没有纳米探针处理或PBS的对照组相比，SI在浓度为1 mM或2 mM纳米探针的Mtb组显著下降。该结果支持SPIO纳米探针的安全性，欢迎更多应用其他细菌负荷来验证纳米探针灵敏度的研究。
我们研究的一个局限性是，我们没有量化小鼠SPIO-MtbsAb纳米探针的生物分布。此外，我们没有研究纳米探针的血管内半生和肝脏沉积，这可能改变探针对位于Mtb病变的THP-1细胞的暴露时间。有必要对生物降解进行进一步研究。此外，MRI无法区分SPIO纳米探针能否与细菌或单核细胞具体结合，或者这些探针是否被内分泌。
总之，我们开发了一种清晰可行的方案，用于制备和表征生物相容性SPIO-MtbsAb纳米探针。这些纳米探针是亲水性的，在生理条件下分散良好;它们在低浓度下是最小的细胞毒性。此外，这些SPIO-MtbsAb纳米探针能够定位和检测Mtb感染，我们的体外和体内研究证明了这一点。因此，SPIO-MtbsAb 纳米探针可作为 MRI 造影剂用于 ETB 检测。
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Disclosures
作者对本研究中审查的材料没有任何专有兴趣。
Acknowledgments
作者感谢台湾经济部（NSC-101-2120-M-038-001，MOST 104-2622-B-038-007，MOST 105-2622-B-038-004）的财政支持，以开展此项研究工作。这份手稿由华莱士学术编辑编辑编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
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