Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Syntese, karakterisering og anvendelse af superparamagnetiske jernoxid nanosonder til ekstrapulmonal tuberkulosedetektion

Published: February 16, 2020 doi: 10.3791/58227
Automatic Translation
1, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 2,5,9
1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, 2Department of Research and Department of Dentistry, Taipei Medical University / Shuang-Ho Hospital, 3Department of Pathology, Taipei Medical University, 4Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 5McLean Imaging Center, McLean Hospital/Harvard Medical School, 6Department of Physical Medicine and Rehabilitation, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Department of Medicine, Mackay Medical College, 8Department of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, 9Graduate Institute of Clinical Medicine, Taipei Medical University

Summary

For at forbedre serologiske diagnostiske test for Mycobacterium tuberkulose antigener, vi udviklet superparamagnetiske jernoxid nanosonder til at opdage ekstrapulmonal tuberkulose.

Abstract

En molekylær billeddannelsesonde bestående af superparamagnetiskjernoxid (SPIO) nanopartikler og Mycobacterium tuberculosis overfladeantistof (MtbsAb) blev syntetiseret for at forbedre billeddannelsefølsomheden for ekstrapulmonal tuberkulose (ETB). En SPIO nanosonde blev syntetiseret og konjugeret med MtbsAb. Den rensede SPIO-MtbsAb nanosonde var karakteriseret ved hjælp af TEM og NMR. For at bestemme sondens målretningsevne blev SPIO-MtbsAb nanosonder inkuberet med Mtb til in vitroimaging analyser og injiceret i Mtb-inokulerede mus til in vivo-undersøgelse med magnetisk resonans (MR). Kontrastforbedringsreduktionen på magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) af Mtb- og THP1-celler viste proportional med SPIO-MtbsAb nanosondekoncentrationen. Efter 30 min intravenøs SPIO-MtbsAb nanosonde injektion i Mtb-inficerede mus, signalintensiteten af granulomatøse site blev forbedret med 14 gange i T2-vægtede MR-billeder sammenlignet med at modtage mus PBS injektion. MtbsAb nanosonderne kan bruges som en ny modalitet for ETB-detektion.

Introduction

På verdensplan udgør ekstraulattuberkulose (ETB) en betydelig andel af tuberkulosetilfælde. Ikke desto mindre, ETB diagnose er ofte savnet eller forsinket på grund af sin snigende kliniske præsentation og dårlige resultater på diagnostiske tests; falske resultater omfatter spytudstrygninger negative for syre-hurtig bacilli, mangel på granulomatous væv på histopatologi, eller manglende kultur Mycobacterium tuberkulose (Mtb). I forhold til typiske tilfælde forekommer ETB mindre hyppigt og indebærer ringe befrielse af Mtb bacilli. Desuden er det normalt lokaliseret på vanskelige at få adgang til websteder, såsom lymfeknuder, lungehinde, og osteoartikulære områder1. Invasive procedurer for opnåelse af passende kliniske prøver, hvilket gør bakteriologisk bekræftelse risikabel og vanskelig, er således væsentlige2,3,4.

Kommercielt tilgængelige antistofdetektionstest for ETB er upålidelige til klinisk påvisning på grund af deres brede følsomhed (0,00-1,00) og specificitet (0,59-1,00) for alle ekstrapulmonale steder tilsammen5. Enzym-linked immunospot (ELISPOT) analyser for interferon-γ, kultur filtrate protein (CFP), og tidlig sekretorisk egenogen mål (ESAT) er blevet brugt til diagnosticering latent og aktiv TB. Resultaterne varierer dog mellem forskellige sygdomssteder for diagnosticering af ETB6,7,8. Desuden gav ppd (renset proteinderivat) og QuantiFERON-TB ofte falske negative resultater9. QuantiFERON-TB-2G er en fuldblodsanalyse af blodimmunreaktivitet, som ikke kræver en prøve fra det berørte organ, og dette kan være et alternativt diagnostisk værktøj6,10,11. Andre diagnostiske metoder, der typisk anvendes til TB meningitis, såsom polymerase kædereaktion, er stadig for ufølsom til trygt udelukke klinisk diagnose12,13. Disse konventionelle tests viser utilstrækkelige diagnostiske oplysninger til at opdage den ekstrapulmonale infektion site. Der kræves således klinisk nye diagnostiske metoder.

Molekylær billeddannelse har til formål at designe nye værktøjer, der direkte kan screene specifikke molekylære mål for sygdomsprocesser in vivo14,15. Superparamagnetisk jernoxid (SPIO), et T2-vægtet NMR kontrastmiddel, kan i væsentlig grad øge specificiteten og følsomheden af magnetisk resonans (MR) imaging (MR)16,17. Denne nye funktionelle billeddannelse modalitet kan præcist skitsere væv ændringer på molekylært niveau gennem ligand-receptor interaktioner. I denne undersøgelse blev en ny molekylær billeddannelsessonde bestående af SPIO nanopartikler syntetiseret til konjugat med Mtb overfladeantistof (MtbsAb) til ETB-diagnose. SPIO nanosonder er minimalt invasive over for væv og organer, der undersøges18,19. Desuden kan disse nanosonder demonstrere præcise MR-billeder ved lave koncentrationer på grund af deres paramagnetiske egenskaber. Desuden synes SPIO nanosonder fremkalde mindst allergiske reaktioner, fordi tilstedeværelsen af jernioner er en del af normal fysiologi. Her blev følsomheden og specificiteten af DE SPIO-MtbsAb nanosonder, der er rettet mod ETB, evalueret i både celle- og dyremodeller. Resultaterne viste, at nanosonderne var gældende som ultrafølsomme billeddannelsesmidler til ETB-diagnose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller vedrørende dyreforsøg følger standardprocedurerne for laboratoriedyravl i overensstemmelse med De Nationale Sundhedskontorer for Pleje og Anvendelse af Forsøgsdyr (8. udgave, 2011) og er godkendt af institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg.

1. SPIO nanopartikelsyntese

  1. Forbered dextran-belagte jernoxid magnetiske nanopartikler ved kraftigt omrøring en blanding af dextran T-40 (5 ml; 50% w / w) og vandig FeCl3× 6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) og FeCl2× 4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) opløsninger ved stuetemperatur.
  2. Tilføj NH4OH (10 ml; 7,5% v/v) hurtigt.
  3. Rør yderligere den sorte affjedring i 1 time; derefter centrifugeres ved 17.300 x g i 10 min. og derefter fjernes aggregaterne.
  4. Adskil de endelige SPIO-produkter fra ubundet dextran T-40 ved gelfiltreringskromatografi20.
  5. Reaktionsblandingen (totalvolumen = 5 ml) lægges i en 2,5 cm × 33 cm kolonne og elute med en bufferopløsning, der indeholder 0,1 M Naacetat og 0,15 M NaCl ved pH 7.0.
  6. De rensede dextranbelagte jernoxidmagnetiske nanopartikler opsamles i tomrummet og analysen af søjlen for jern og dextran ved henholdsvis 330 og 490 nm ved hjælp af saltsyre og fenol-/svovlsyremetoderne20.

2. SPIO-MtbsAb syntese

  1. Syntetiseret SPIO-konjugeret EDBE ved hjælp af tidligere rapporterede metoder21,22.
  2. Synthesize SPIO-EDBE-kortfattet anhydrid (SA).
    1. Alkalisk opløsning (5 M NaOH; 10 ml)) af SPIO-EDBE og SA (1 g; 10 μmol) ved stuetemperatur i 24 timer.
    2. Dialyze opløsningen med 20 ændringer af 2 L destilleret vand ved hjælp af molekylærporøse membranslanger (12.000-14.000 MW cutoff). 6 timer for hver ændring.
  3. Endelig tilsættes 100 μL SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml Fe) til 400 μL 4,5 mg/mL MtbsAb for at syntetisere SPIO-MtbsAb ved ved hjælp af 1-hydroxybenzotriazol og (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphphat som katalysatorer og rør opløsningen ved stuetemperatur i 24 timer.
  4. Endelig adskilles opløsningerne fra det ubundne antistof gennem gelfiltreringskromatografi.
  5. Reaktionsblandingen (5 ml) indlæses på 2,5 cm × 33 cm kolonne og elute ved hjælp af en PBS-buffer. Bekræft Ab-nanopartikel kompleks (dvs. nanosonde) ved hjælp af en bicinchoninic syre protein analyse kit23.

3. Partikelmorfologi observation og afslapning tier måling

  1. Undersøg gennemsnitlig partikelstørrelse, morfologi og størrelsesfordeling ved hjælp af transmissionselektronmikroskop ved en spænding på 100 kV.
    1. Drop-cast den sammensatte spredning på en 200-mesh kobber gitter og lufttør ved stuetemperatur, før du lægger det på mikroskopet.
  2. Nanosondernes afslapningstidsværdier (T1 og T2)måles ved hjælp af NMR-relaxometeret ved 20 MHz og 37,0 °C ± 0,1 °C.
    1. Kalibrer relaxometeret før hver måling.
    2. Optag r1 og r2 værdier fra de otte datapunkter genereret gennem inversion-recovery og Carr-Purcell-Meiboom-Gill puls sekvens, henholdsvis at bestemme r1 og r2 relaxivities20.

4. Cellebilleddannelse

  1. Dyrk humanmonocytter THP-1 i RPMI 1640 med 10% føtal kvægserum, 50 μg/ml gentamycinsulfat, 100 enheder/mL penicillin G natrium, 100 μg streptomycinsulfat og 0,25 μg/ml fungizone i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C.
  2. Inkubte SPIO-MtbsAb nanosonder (2 mM) med 106 kolonidannende enheder (CFU) af Mycobacterium bovis BCG præinkuberet med 1 × 107 aktiverede monocytter i mikrocentrifugerør (1 mL) i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C i 1 time.
  3. Centrifugerør ved 200 x g og kassér supernatanten. Opløs pellets i mediet (200 μL).
  4. Scan prøverne ved hjælp af en hurtig gradient ekko puls sekvens (Gentagelse tid (TR) = 500; Echo-tid (TE) = 20; Spejlvendevinkel = 10°) til og med 3,0-T MR for at bestemme nanosondens specificitet og følsomhed21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette-Guérin) vaccination

  1. Rekonstituere den lyofileized vaccine eller bakterielle lager i Sauton's medium og derefter fortynde bestanden med saltvand, indtil korrekt spredt som tidligere beskrevet24.
  2. Vaccinere en levende svækket stamme af M. bovis BCG, fremstillet af ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (Connaught stamme; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) ved et volumen på 0,1 ml/mus (dvs. 107 CFU) intradermally ind i musnes venstre eller højre rygskappe, som beskrevet tidligere23. Injicer saltvand i mus som negativ kontrol. Overvåg dyr dagligt efter BCG-vaccination.
  3. Ofre dyr 1 måned efter bakterier ipodning ved hjælp af kuldioxid dødshjælp. Høst vævet fra det intradermale vaccinationssted. Fastgør vævet i 10% formalin og indlejre i paraffin for serielle sektioner på 5-10 μm. Pletvæv sektioner med hæmatoxylin /eosin og Ziehl-Neelsen pletter for syre-hurtige bakterier24 og med Berlin blå for ferrijern25.

6. In vivo MR

  1. Tilføres ketamin (80 mg/kg kropsvægt) og xylazine (12 mg/kg kropsvægt) subkutan tyngde i mus til animalsk anæstesi.
  2. Injicer SPIO-TbsAb sonder (2 nmol/200 μL) i halevener af mus. MR-billedmus før og umiddelbart efter sondeinjektion og derefter hver 5 min i 30 minutter for at erhverve T2-vægtede hurtige spin-echo-billeder (TR = 3000; TE = 90; synsfelt = 8).
  3. Kvantitativt analysere alle MR-billeder ved hjælp af signalintensitet (SI), en måling af definerede regioner af interesse i sammenlignelige steder i en Mtb granulom center og rygmusklen støder op til et granulomatøst område.
  4. Beregn relative signalforbedringer ved hjælp af SI-målingen før (SIpre; kontrol) og 0-3 timer efter (SIpost) injektion af kontraststofferne ved hjælp af formlen

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100

    hvor SIpre er SI af læsionen på den forøgede scanning og SIpost er SI af læsionen på den post-forstærkede scanning21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SPIO-MtbsAb nanosonde syntese og karakterisering
SPIO nanopartikler var designet til at konjugere med MtbsAb. Dextran stabiliseret på overfladen af SPIO nanopartikler blev krydsforbundet af epichlorohydrin. SPIO nanopartikler blev efterfølgende indarbejdet sammen med EDBE for at aktivere primære aminfunktionelle grupper i dextranenderne. SA blev derefter konjugeret til at danne SPIO-EDBE-SA. SPIO-MtbsAb nanosonder dannet i det sidste trin gennem konjugering af MtbsAb med SPIO-EDBE-SA i tilstedeværelse af koblingsmidler. TEM-billedet af SPIO-MtbsAb nanosonder (figur 1) viser, at SPIO-MtbsAb nanosonderne havde et godt spredt udseende. Den gennemsnitlige størrelse af SPIO-MtbsAb nanosondekernen var 3,8 ± 0,4 n m (200 partikelberegning).

I vandig opløsning var nanosondernes afslappende værdier, r1 og r2,henholdsvis 23 ± 3 og 151 ± 8 mM-1s-1ved 20 MHz og 37,0 °C ± 0,1 °C. R1/r2 forholdet mellem SPIO-MtbsAb nanosonder svarede til Resovist; R 1 og r2 af Resovist (henholdsvis 26 og 164 mM-1s-1)var dog noget højere end SPIO-MtbsAb nanosondernes.

In vitro SPIO-MtbsAb nanosonde karakteristik og billeddannelse
Først opdagede vi M. bovis BCG, en syre-hurtige bakterier, gennem Ziehl-Neelsen farvning (Figur 2A). Bakterierne blev isoleret og derefter dyrket med sonder, der indeholder ferrijern, der kan identificeres gennem Berlin blå farvning (figur 2B). Den Mtb-målretningsgrad for SPIO-MtbsAb nanosonde blev bestemt ved hjælp af T2-vægtet MRI; negative ekstraudstyr blev proportioneret med mængden af sonder knyttet til bakteriecellen. Faldet i SI i tilstedeværelse af nanosonderne forekom på en koncentrationsafhængig måde (figur 2C). Ved 2, 1 og 0,5 mM udstillede nanosonderne konjugerede med Mtb SI'er på henholdsvis 97,67 ± 3,05, 131,67 ± 4,51 og 257,33 ± 5,03, alle højere SI på 90,75 ± 2,47 for 1 m ikke-konjugeret nanosonde. Sammenlignet med PBS (SI = 1073,43 ± 13,62) blev der næsten ikke konstateret nogen signalreduktion i TB-gruppen (Kun SI = 957,33 ± 12,53). Således, SPIO sonder specifikt målrettet Mtb bacilli; På de forbedrede MR-billeder faldt SI desuden med en stigning i mængden af SPIO nanopartikler.

Tilsvarende blev reduktionerne i SI på forbedrede MR-billeder noteret 1 time efter dyrkningen af THP-1 monocytter med nanosonderne. En betydelig reduktion i SI i TB-gruppen blev bemærket, da 1 mM (SI = 225,33 ± 8,58) og 2 mM (SI = 104 ± 2,16) koncentrationer af nanosonderne blev anvendt sammenlignet med de grupper, der kun blev administreret med PBS (SI = 1005,33 ± 16,74), eller som ikke blev administreret med nanopr obe (SI = 991 ± 8,98). MRI SI-reduktionen i Mtb-grupperne for 1 og 2 mM nanosonder var sammenlignelig med reduktionen i den positive 1 mM nanosonde alene gruppe (SI = 112,33 ± 3,68). Ifølge ovenstående resultater kunne SPIO-MtbsAb nanosonderne hjælpe med at overvåge den nanosondeaktiverede MENNESKEHANDEL med aktiverede THP-1 monocyt.

In vivo SPIO-MtbsAb nanosonde billeddannelse
Efter cellebilleddannelse har vi bestemt effekten af in vivo MR-scanning for ETB. SPIO-MtbsAb nanosonder blev intravenøst injiceret til Mtb-inficerede mus. Der blev observeret et klart påviseligt MR-signal i Mtb granulomatous arealet 0,5 timer efter injektionen. den højeste SI til baggrund blev dog observeret efter 1 time injektion. Der blev konstateret en betydelig reduktion i MR-signaleringen i mtbgranulomatet område (figur 3). SI blev målt før (SIpre) og efter (SIpost) kontrastmiddel injektion. En time efter sondeinjektionen var den T2-vægtede forbedring af signalreduktionen ved Mtb granulamatous-områderne (figur 3B) ca. 14 gange højere end på kontrolstederne (figur 3A; -1,68% ± 1,32% og -23,43% ± 7,24%. p < 0,001).

Histologisk og immunhistokemisk vurdering af SPIO-MtbsAb nanosonder
En subkutan granulom blev udviklet 1 måned efter infektion i C57BL/6 mus. Ny blod vaskularisering blev bemærket i disse læsioner sammen med lymfocyt og epithelioid-makrofag aggregater. Den organiserede granulom var vokset gradvist (figur 4A). Korrelationen mellem TB-læsioner med SPIO-MtbsAb MR-signaler blev yderligere bestemt gennem Mtb-overfladeantigenets immunhistokemiske reaktion med anti-MtbsAb. Positiv MtbsAb udtryk blev afsløret i granulomatøse områder(figur 4B),med syre-hurtig bacilli farvning positiv på læsionsitet (figur 4C). Berlin blå, en ferric jern-positiv plet, blev brugt til at bestemme følsomheden af sonder ne til Mtb. Berlin blå-positive SPIO sonde blev fundet på samme sted som MtbsAb (Figur 4D). Alle colocalized par blev vist i figur 4A-D.

Figure 1
Figur 1: Gennemsnitlig kernestørrelse af SPIO-MtbsAb nanosonder i TEM. Den gennemsnitlige størrelse af SPIO-MtbsAb nanoprobe kernen var 3,8 ± 0,4 nm, målt ved hjælp af TEM billedanalyse (200 partikel beregning). Skalabjælke = 15 nm. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere undersøgelse26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: In vitro karakterisering af SPIO-MtbsAb nanosonde. Den syrehurtige bacilli identificeres gennem (A) Ziehl-Neelsen farvning ogb) bøjningen af nanosondens ferrijern til bakterier identificeret gennem Berlinblå farvning. C) T2-vægtet MR-scanning med negativ forbedring efter SPIO-MtbsAb nanosonderne er inkuberet med Mtb. Eliminering af SI, der forekommer dosisafhængig efter inkorporeringen af nanosonderne med Mtb: (1) 90,75 ± 2,47 (1,0 mM-sonde) 2) 97,67 ± 3,05 (Mtb + 2,0 mM-sonde) 3) 131,67 ± 4,51 (Mtb +1,0 mM-sonde) 4) 257,33 ± 5,03 (Mtb + 0,5 mM Sonde) 5) 957,33 ± 12,53 (Mtb +0 mM-sonde) (6) 1073,43 ± 13,62 (PBS). Der er ikke angivet nogen signalreduktion i PBS-kontrolgruppen. (D) Dosisafhængig negativ forbedring i THP-1 monocytter 1 time efter inkubation med nanosonderne. Skalastængerne i (C) og (D) er 5 mm. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere undersøgelse26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: In vivo SPIO-MtbsAb nanosonder i subkutane ETB-læsioner af C57BL/6-mus. A) Kontrol ogb) Mtb granulomatøse arealer. Der findes en betydelig 14 gange reduktion i MR-signalering i Mtb granulomatområderne sammenlignet med kontrolområderne 1 time efter sondeadministration (-1,68 % ± 1,32 % mod -23,43 % ± 7,24 %, p < 0,001). Resultaterne gives som middel ± SD'er. Statistiske sammenligninger anvendte to-tailed Student's t-tests. p < 0,05 blev anset for at være signifikant. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere undersøgelse26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Korrelationer mellem histologi, immunhistokemi, syre-hurtig, og Berlin blå farvning. Histologi af Mtb granulomatøse områder overvejende demonstrere lymfocytter og epitelioid makrofager. Neovaskularisering og rigelig sammenlægning af lymfocytter og epitelilære makrofager observeret i disse læsioner. (A) Organiseret granulomer synes at udvikle sig gradvist. B) Immunhistokemisk farvning, der viser MtbsAb-udtryk i granulomate læsioner, mens syrehurtigt bacilli(C)er spredt inden for de samme områder. (D) Berlin blå farvning SPIO sonder findes i de colocalized MtbsAb områder. Berlin blå farvning for ferrijern viser sonde bøjning til Mtb. Skala barer er 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere undersøgelse26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I lighed med relevante undersøgelser viste vores resultater vedrørende SPIO-MtbsAb nanosonder en betydelig specificitet for Mtb27,28. Den subkutane Mtb granulom blev fundet 1 måned efter TB injektion i musemodeller. Den typiske TB granulomatøse histologi resultater omfattede lymfocyt infiltration, tilstedeværelse af epiteliier makrofager, og neovaskularisering. Syre-hurtig bacilli blev spredt i TB læsioner, bekræfter MtbsAb immunhistokemi resultater. Dette indicerede en immunologisk reaktion mellem Mtb overfladeantigen og MtbsAb. Berlin blå fremhævede de samme områder med MtbsAb, bekræfter sondernes specificitet for bøjning med syre-hurtig Mtb.

Navnlig var omfanget af negativ kontrastforbedring på MR-scanning for Mtb- og monocytiske THP1-celler proportionalt med koncentrationen af SPIO-MtbsAb nanosonde. Når mus med Mtb granulomer blev administreret SPIO-MtbsAb nanosonder, en 14-fold signal reduktion på granulomatøse site blev noteret på T2-vægtede MR-billeder i forhold til et modsatrettede sted med PBS injektion. Dette indikerer en betydelig akkumulering af kontrastmidlet. Resultaterne viser en mulighed for at opnå specifik målretning af kontrastmiddel, hvilket kan reducere dosiskravet for klinisk diagnose.

Vores resultater viser, at disse nanosonder ophobes en påviselig volumen i Mtb granulomatøse læsioner. Disse resultater kan bekræftes ved at udvikle en SPIO nanosonde ved hjælp af anti-hMtbsAb. Da SPIO's magnetiske jernoxidkerne er blevet anvendt til at fremkalde T2-afkortning i MR-kontrastmidler, tyder resultaterne på en praktisk og noninvasive tilgang til at opdage lignende celleadfærd til kliniske diagnoseapplikationer.

Her leverer vi protokollen bestående af 2 dele: afsnit 4 til 6 er celle- og dyrebilleder. Teknikkerne dækker celledyrkning, dyreforsøg og optisk billeddannelse. Afsnit 1 til 3 er sondesyntheseer. Nogle vigtige trin vil bidrage til at kopiere eksperimentet. Det kritiske trin i SPIO nanopartikelsyntese er at forberede en dextran-belagt jernoxid magnetiske nanopartikler; det er afgørende at kraftigt røre og helt blande dextran T-40, vandig FeCl3-6H2O, og FeCl2-4H2O løsninger ved en rumtemperatur. Det kritiske trin for afsnit 2, SPIO-MtbsAb syntese, er konjugerende MtbsAb til SPIO-EDBE-SA at syntetisere SPIO-MtbsAb. For at vælge de relevante katalysatorer og i tilstrækkelig grad røre opløsningen ved stuetemperatur er kritiske så godt. Og det kritiske trin for afsnit 3, partikelmorfologi observation og afslapning tier måling, er at kalibrere relaxometer før hver måling. For præcist at beregne størrelsen af sonder, en kalibrering af relaxometer er afgørende så godt.

I denne undersøgelse blev M. bovis BCG og kanin anti-Mtb brugt. Krydsaktiviteten af kvæg- og kaninkilder blev anset for at være mild, selv om dataene viste, at MtbsAb-konjugerede SPIO afslørede stærke interaktioner med M. bovis BCG. Vores konklusion antydede, at SPIO nanosonder målrette TB specifikt. Inkubationen af nanosonde og Mtb-bakterier viste en negativ forbedring småde dosisafhængig, mens faldet i forbedringen observeret for SPIO nanosonder på MR-scanningvar korreleret med eksistensen af SPIO partikler. Baseret på vores data, yderligere forskning for at udforske mulige antistof-bøjning tilgange til at øge specificiteten af nanosonden ville være velkommen.

Tidligere undersøgelser viser , at SPIO udviser minimal cytotoksicitet uden at ændre celleaktivitet ved en koncentration , der blev anvendt i denne undersøgelse29,30. I overensstemmelse med tidligere forskning viste vores resultater minimal effekt af SPIO nanosonder til THP-1-celler. THP-1 celler blev inkuberet med SPIO nanosonder med bakterier bøjning i 1 time. SI præsenterede et betydeligt fald i Mtb-grupperne med koncentration på 1 mM eller 2 mM nanosonder, sammenlignet med kontrolgruppen uden nanosondebehandling eller PBS alene. Resultatet understøtter sikkerheden af SPIO nanoprobe, og flere undersøgelser anvender andre bakterielle belastninger til at validere følsomheden af nanosonden er velkommen.

En begrænsning af vores undersøgelse var, at vi ikke kvantificerede biodistributionen af SPIO-MtbsAb nanosonden i mus. Desuden undersøgte vi ikke nanosondens intravaskulære halveringstid og leveraflejring, hvilket kan ændre forsøgstiden for sonderne på THP-1-celler, der er placeret ved Mtb læsionerne. Yderligere forskning i bionedbrydning er berettiget. Desuden kunne MR-scanning ikke skelne, om SPIO nanosonder specifikt kunne binde sig til bakterier eller monocytter, eller om disse sonder blev endocytosed.

Afslutningsvis har vi udviklet en klar og gennemførlig protokol til at forberede og karakterisere biokompatible SPIO-MtbsAb nanosonder. Disse nanosonder er hydrofile og spredes godt under fysiologiske forhold; de er minimalt cytotoksiske ved lave koncentrationer. Disse SPIO-MtbsAb nanosonder muliggør også målretning og påvisning af Mtb-infektion, som det fremgår af vores in vitro- og in vivo-undersøgelser. Således kan SPIO-MtbsAb nanosonder anvendes som MR-kontrastmidler til ETB-detektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen af forfatterne har nogen egeninteresse i de materialer, der undersøges i denne undersøgelse.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for den finansielle støtte fra Økonomiministeriet Taiwan (tilskud NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) til at udføre dette forskningsarbejde. Dette manuskript blev redigeret af Wallace Academic Editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , Suppl 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Tags

Medicin Ekstrapulmonal molekylær billeddannelse Mycobaterium tuberkulose nanosonde diagnose Berlin blå plet Ziehl-Neelsen plet.
Syntese, karakterisering og anvendelse af superparamagnetiske jernoxid nanosonder til ekstrapulmonal tuberkulosedetektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C.… More

Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter