Summary
Canais de íon Mechanosensitive muitas vezes são estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com gravação de remendo-braçadeira. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados no fluxo fluidos-regulamentos de canais iônicos pode ser errôneo. Aqui, nós fornecemos métodos de prevenção e corrigir esses erros com uma base teórica.
Abstract
Fluxo de fluido é um importante estímulo ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo fluido/não são totalmente compreendidos, fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon pode contribuir criticamente. Portanto, sensibilidade de força fluido fluxo/tesoura de canais iônicos tem sido estudada usando a técnica patch-clamp. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados e a interpretação dos dados podem ser errôneas. Aqui, apresentamos a evidência experimental e teórica para erros relacionados ao fluxo fluidos e fornecer métodos para estimar, prevenindo e corrigindo esses erros. Alterações na junção potencial entre o eletrodo de referência Ag/AgCl e banho líquido foram medidas com uma pipeta aberta cheia de 3 M KCl. escoamento de fluidos pode, em seguida, deslocar o mV de potencial de aproximadamente 7 junção metal líquido. Por outro lado, medindo-se a mudança de tensão induzida pelo fluxo de fluido, estimamos a concentração do íon na camada limite unstirred. Na condição estática, as concentrações de íon real adjacentes para a entrada do canal eletrodo ou íon da referência do Ag/AgCl na superfície da membrana celular podem chegar tão baixo como aproximadamente 30% do que na condição de fluxo. Colocando um agarose 3M ponte de KCl entre o eléctrodo de referência e fluido banho pode ter evitado este problema de deslocamento potencial de junção. No entanto, o efeito de camada unstirred adjacente à superfície da membrana celular não poderia ser fixado desta forma. Aqui, nós fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta, enfatizando a importância do uso de um sal de agarose-ponte enquanto estudava fluido Regulamento induzida pelo fluxo de correntes de íon. Portanto, esta nova abordagem, que leva em consideração a concentração real de íons na camada limite unstirred, pode fornecer uma visão útil no delineamento experimental e interpretação de dados relacionados ao regulamento de tensão de cisalhamento fluido de canais iônicos .
Introduction
Fluxo de fluido é uma importante sinalização ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido e fluido cisalhamento força dependente vascular remodelação e desenvolvimento1,2, 3,4,5. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo de fluido não são totalmente compreendidos, acredita-se que o fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon criticamente pode contribuir para respostas induzidas pelo fluxo fluido5 , 6 , 7 , 8. por exemplo, a ativação do retificador endotelial para dentro Kir2.1 e Ca2 +-ativado K+ (KCa2.3, KCNN3) canais depois de Ca2 + influxo pelo fluxo de fluido tem sido sugerido para contribuir ao fluido vasodilatação induzida pelo fluxo6,7,8. Portanto, muitos canais iônicos, canais especialmente ativado mecanicamente ou - inibidas, têm sido estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com o remendo-braçadeira técnica6,9,10 , 11. no entanto, dependendo do protocolo experimental realizado durante a gravação da remendo-braçadeira, resultados e interpretação dos dados sobre o fluxo de fluido-regulamentos de canais iônicos podem ser errônea10,11.
Uma fonte de fluido induzida por fluxo artefatos em gravação de remendo-braçadeira é de potencial entre o fluido de banho e de eletrodo de referência Ag/AgCl11da junção. Geralmente acredita-se que a junção de metal líquido potencial entre o banho fluido e o eletrodo de Ag/AgCl é constante como a concentração de Cl– do banho líquido é mantida constante, considerando a resposta química entre a solução do banho e o eletrodo de Ag/AgCl para ser:
AG + Cl–↔ AgCl + elétron (e–) (equação 1)
No entanto, em um caso onde a reação global eletroquímica entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl (equação 1) procede da esquerda para a direita, a concentração de Cl– do banho fluido adjacente para o Ag/AgCl referência eletrodo (camada de limite unstirred12,13,14,15) pode ser muito menor do que a granel de banhar a solução, a não ser suficiente convecçao transporte é assegurada. Usar um eletrodo de Ag/AgCl velho ou não-ideal com cloração inadequada do Ag pode aumentar esse risco. Este artefato relacionados ao fluxo de fluido para o eletrodo de referência, na verdade, pode ser excluído, simplesmente colocando uma ponte de agarose-sal convencional entre o banho fluido e referência eletrodo, desde que o artefato é baseado em alterações na real Cl– concentração adjacente para o eletrodo de Ag/AgCl11. O protocolo apresentado neste estudo descreve como impedir que as alterações de potencial de junção de fluxo-relacionados e medir as concentrações de íon real na camada limite unstirred.
Depois de colocar um ponte de KCl entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl de agarose, há outro fator crucial que deve ser considerado: apenas como referência o eletrodo de Ag/AgCl atua como um eletrodo de Cl– , os canais iônicos também podem funcionar como um eletrodo íon-seletivo. A situação de uma camada de limite unstirred entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl surge durante o movimento de íons entre as soluções extracelulares e intracelulares através dos canais de íon de membrana. Isto implica que o cuidado deve ser usado quando interpretar o Regulamento do íon canais pelo fluxo de fluido. Conforme discutido no estudo anterior11, o movimento de íons através de uma solução em que se encontra um gradiente electroquímico pode ocorrer através de três mecanismos distintos: difusão e convecção, onde a difusão é o movimento de migração induzida pelo gradiente de concentração, a migração é o movimento impulsionado pelo gradiente elétrico e convecção é o movimento através de fluxo de fluido. Entre esses mecanismos de três transporte, modo convecção contribui mais para o movimento de íons11 (> 1.000 vezes maiores do que a difusão ou migração sob configurações do remendo-braçadeira habitual). Isto constitui a base teórica por potenciais entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl junção pode muito sob diferentes condições estáticas e fluxo de fluido11.
Conforme a hipótese acima proposta, alguns efeitos facilitatórios do fluxo do fluido no canal iônico atual podem ser inferidos a partir da restauração convectiva das concentrações do íon real adjacentes à entrada do canal, na superfície da membrana (camada de limite unstirred) 10. neste caso, os efeitos de induzida pelo fluxo de fluido em correntes do canal de íon simplesmente surgiram de eventos eletroquímicos, não do Regulamento de retenção de canal de íon. Uma ideia semelhante foi anteriormente sugerida por Barry e colegas12,13,14,15 com base em Considerações teóricas rigorosas e evidência experimental, também conhecida como a camada de unstirred ou efeito do número de transportes. Se alguns canais de íon tem suficiente condutância de canal único e bastante aberto-tempo para fornecer taxas de transporte suficiente através dos canais (um ritmo mais rápido transporte na membrana do que na superfície da membrana unstirred), um efeito de camada limite podem surgir . Assim, o transporte de convecção-dependente pode contribuir para as eventuais facilitações fluido fluxo-induzida do íon atual10,12,13,14,15.
Neste estudo, enfatizamos a importância de usar um ágar ou agarose sal-ponte enquanto estudava fluido fluxo-induzida pelo Regulamento das correntes de íon. Nós também fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred adjacente para os canais de íon da eletrodo e membrana da referência do Ag/AgCl. Além disso, a interpretação teórica do fluido modulação induzida pelo fluxo das correntes do canal de íon (ou seja, a hipótese de convecção ou camada unstirred transporte número efeito) pode fornecer informações valiosas para a concepção e interpretação de estudos sobre o cisalhamento força-regulamento de canais iônicos. De acordo com o efeito de número de transporte camada de limite unstirred, prevemos que as correntes de canal de iões através de todos os tipos de canais iônicos de membrana podem ser facilitadas pelo fluxo de fluido, independente de sua sensibilidade biológica à força de cisalhamento fluxo fluido, mas somente se os canais de íon tem suficiente condutância de canal único e aberto-tempo. Maiores densidades de corrente de canal de íon pode aumentar o efeito unstirred da camada limite na superfície da membrana celular.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da Universidade de Konkuk.
1. Agarose pontes de sal entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl
Nota: Agarose 3M KCl pontes de sal são produzidos como anteriormente descrito12 com pequenas variações.
- Formação de pontes
- Dobre os tubos capilares de vidro de fogo para formar uma U-forma conforme apropriado. O diâmetro interno dos capilares deve ser grande o suficiente para reduzir a resistência série, durante a gravação de correntes grandes do íon. Tubos de 2 a 5 mm de diâmetro interno são geralmente aceitáveis.
- Preparação da solução de KCl 3M agarose
- Preparar 100 mL de solução de KCl 3M (1 M ou 2 M também é aceitável).
- Pese 3 g de agarose.
- Dissolver o agarose em 100 mL de KCl (ou seja, 3% agarose) sobre uma chapa quente entre 90 e 100 ° C.
- Carregando as pontes com agarose de KCl 3M
- Para facilitar o carregamento, mergulhe as pontes de vidro em forma de U na solução de agarose-KCl.
Nota: É fácil de escavar as pontes de vidro, se a solução de agarose-KCl está contida em um recipiente raso e amplo. - Mantê-los durante a noite em temperatura ambiente (RT) para a agarose definir e endurecer.
- Cuidadosamente Escave para fora as pontes de vidro de agarose-KCl-carregado do conjunto/endurecido agarose-sal.
- Para facilitar o carregamento, mergulhe as pontes de vidro em forma de U na solução de agarose-KCl.
- Armazenar as pontes
- Prepare-se volume suficiente (ou seja, 500 mL) da solução KCl 3M em uma todo o gargalo da garrafa.
- Armazene as pontes de sal-agarose preparadas o frasco no frigorífico.
2. a aplicação da força de cisalhamento do fluxo de fluido para células em uma câmara de Patch-aperto
Nota: Um diagrama esquemático da montagem da experiência da remendo-braçadeira é mostrado na Figura 1.
- Lugar de um contêiner carregado com solução de banho (volume e altura já devem ser medidos) acima da câmara de remendo-braçadeira.
- Encha a câmara de remendo-braçadeira com a solução de banho por aspiração do tubo.
- Para parar o fluxo de fluido, cortar o tubo no lado do contêiner para bloquear o fluxo de fluido e, em seguida, cortar o tubo no lado da aspiração para parar a sucção ao mesmo tempo. Esta é a condição do controlo "estacionário".
- Para aplicar a força de cisalhamento do fluxo fluido, abra ambos os tubos dos lados do recipiente e sucção ao mesmo tempo.
- Antes ou depois de aplicar a força de cisalhamento do fluxo de fluido para a célula, medir a taxa de fluxo em mL/min.
- Calcule a taxa de fluxo, medindo-se a diminuição do volume de fluido ao longo de um determinado momento.
- Da taxa de fluxo medido e geometria (estrutura) da câmara de tomar banho, a força de cisalhamento aplicada à célula pelo fluxo do fluido deve ser estimada (consulte a seção de discussão).
- Como alternativa, para controlar a taxa de fluxo (para etapas 2.3-2.6), use uma bomba de perfusão. Neste caso, tenha cuidado para garantir uma constante, em vez de um fluxo pulsátil.
3. medir mudanças no potencial de junção Metal líquido pelo fluxo de fluido entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl (Figura 3A)
- Use o eletrodo de Ag/AgCl ou pellet, que está disponível a partir de produtos pré-fabricados, sem a ponte de sal de agarose.
- Prepare uma solução salina sal fisiológica normal para a câmara de banho (por exemplo, 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5mm HEPES, 0.5 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 11mm D-glicose; pH ajustado para 7,4 com NaOH).
- Coloque uma pipeta de patch, que contém uma solução de KCl 3M na câmara para minimizar a mudança de potencial de junção entre a pipeta e soluções de banho.
- Corrigir o amplificador de tensão-braçadeira para o atual modo de grampo ("eu = 0" ou "CC").
- Depois de anular o potencial de deslocamento inicial, medir as mudanças na tensão induzida por várias taxas de fluxo.
- Para verificar se as alterações na tensão são potenciais de junção do metal líquido, re-examine o efeito do fluxo de fluido sobre o potencial de junção usando a ponte de agarose-sal entre a solução do banho e o eletrodo de Ag/AgCl.
4. experimental estimativa da concentração Real Cl– na camada Unstirred adjacente ao eletrodo de Ag/AgCl sob condição estática (Figura 3B)
- Os resultados da etapa 3, desenhar as relações de taxa de fluxo de potencial de junção e estimar o valor máximo (saturação) do potencial mudança de junção pela taxa de fluxo de fluido supra.
- Preparar soluções com diferentes concentrações de Cl (i.e., 50, 99, 147, 195 e 288 mM de NaCl).
- Alterando o Cl– concentração no fluido balneares, desenhe a junção potencial [Cl–] relação. Note que a taxa de fluido deve ser constante e suficientemente alta (> 30 mL / min) para evitar a diminuição da concentração de Cl– , para que o eletrodo de referência Ag/AgCl adjacentes.
- De curvas de dois relação, estime as mudanças na concentração de Cl– a partir da mudança de potencial de junção medido.
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Representative Results
Toda célula dependentes de voltagem Ca L-tipo2 + canal (VDCCL) correntes foram gravadas nos rato enzimaticamente dispersos miócitos de arterial mesentérica, como descrito anteriormente,11. Os miócitos arteriais foram diálise com uma solução de pipeta Cs-rica sob a configuração de nistatina perfurado com solução de banho livre de cátion divalente, para facilitar o fluxo de corrente através de de11,VDCCL16. Breve despolarizante tensão de rampas ou degraus de tensão, em um potencial de exploração de -70 mV, foram aplicados para eliciar as correntes VDCCL . Uma representante de corrente-tensão (eu-V) relação em VDCCL na ausência e presença de fluxo de fluido (5 mL/min ou cerca de 0,004 m/s), gravado com um agarose ponte de KCl, é mostrado na Figura 2A. Fluxo de fluido aumentou ligeiramente o VDCCL atual de forma independente de tensão. Esse efeito facilitador do fluxo do fluido sobre o VDCCL atual está resumido na Figura 2B.
A facilitação de tensão independente da VDCCL atual pelo fluxo de fluido é uma resposta adequada do VDCCL à força fluido ou cisalhamento. A 5 mL/min, ou aproximadamente 0,004 m/s de fluxo de fluido na atual configuração experimental foi estimada para representar aproximadamente 0.1 dyn/cm2 em termos de força de cisalhamento (ver discussão). No entanto, quando o Ag/AgCl referência eletrodo foi directamente para o fluido de banho sem um ponte de KCl, a eu-V relação na presença de fluxo de fluido deslocado para a direita, comparada com a das correntes VDCCL sob um estático de agarose condição (Figura 2 e 2D). Isto resultou na inibição de VDCCL atual com tensões negativas e facilitação de VDCCL atual no mais potenciais despolarizadas ou positivos. Isto exemplifica o artefato induzida pelo fluxo de fluido em gravação de remendo-braçadeira em que uma mudança de tensão da relação eu-V não foi devido a modificação da retenção de canal, mas era, na verdade, devido a uma mudança de potencial de junção entre o banho líquido e Ag/AgCl referência de eletrodo11. Evidência direta para a mudança de potencial de junção induzida pelo fluxo de fluido é mostrada na Figura 3.
Os turnos de potencial de junção foram medidos de acordo com a etapa 3. As alterações, devido ao fluxo de fluido, foram medidas usando uma pipeta aberta cheia de 3 M de KCl, como descrito anteriormente,11. Com uma pipeta aberta cheia de 3 M de KCl, junção de potencial entre a pipeta e soluções de banho poderia ser minimizada, e as potenciais alterações devido ao fluxo de fluido foram principalmente a partir da solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl. Sem um agarose 3 M KCl ponte entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl, fluxo de fluido deslocado a potencial de junção entre o fluido e o eletrodo de Ag/AgCl em forma dependente de taxa de fluxo do fluido (Figura 3A). A mudança de potencial de junção máxima foi extrapolada para ser ~ 7 mV na relação de fluxo de fluido de potencial de junção (Figura 3A, inferior). Em contraste, quando a agarose 3M KCl ponte foi usado, o fluxo de fluido não alterou a junção de potencial entre o eletrodo de referência e fluido balneares (resumido no gráfico da Figura 3Ainferior, inferior).
Para medir as diferenças de concentração entre as condições de fluxo de fluido e estático, no qual suficiente convecção modos de ação são funcionais, examinamos o efeito da alteração de concentrações de Cl– sobre o banho líquido-Ag/AgCl eletrodo junção de potencial de acordo com a etapa 4. Aumentando a concentração de Cl– deslocado da junção potencial de forma concentração-dependente (Figura 3B, top) assim como o fluxo de fluido deslocado da junção potencial de forma dependente da taxa. Usando uma ponte de agarose de KCl, o potencial de junção foi impedido de mudar em um Cl– maneira concentração-dependente (Figura 3), indicando que a mudança de potencial de junção ocorreu entre o eléctrodo de referência e solução de banho, Não entre as soluções de banho e uma pipeta. A trama semi log da relação potencial-[Cl–] junção é mostrada no painel inferior da Figura 3B. De acordo com os resultados na Figura 3B, o máximo valor extrapolado de ~ 7 mV na junção potencial mudança ( Figura 3A) sugere que a concentração de Cl– adjacente para o eletrodo de referência Ag/AgCl diminui para ~ 70% do concentração média da maior banho fluido quando o fluxo de fluido está ausente (Figura 3B, inferior).
Em nosso estudo anterior, Kir2.1 correntes foram relatadas para ser facilitada pelo fluxo de fluido restaurando convectively (crescente) [K+], com a entrada de canal10. Esta ideia decorre dos fenômenos que ocorrem entre o banho fluido e o eletrodo de Ag/AgCl, como o canal de Kir2.1 pode funcionar como um eletrodo de K+ , assim como as funções de eletrodo de Ag/AgCl como um eletrodo de Cl– . Esta ideia é ilustrada esquematicamente na Figura 4A e 4B. Um exemplo representativo da facilitação da induzida pelo fluxo do fluido das correntes de Kir2.1 é mostrado na Figura 4. As correntes de Kir2.1 foram eliciadas um passo relação de tensão de um potencial de exploração de 0 a -100 mV em células de leucemia basophilic (RBL) de rato. Aplicativo de fluxo de fluido (5 mL/min ou 0,004 m/s) prontamente aumentou a corrente Kir2.1 (Figura 4). Esta facilitação pelo fluxo de fluido foi anteriormente sugerida ser mediado não por sinalização celular, mas pelo efeito eletroquímico dos transportes convectivas de íons K+ para o unstirred da camada limite de10.
Figura 1: esquemático mostrando a instalação da câmara de banho para a regulação do fluxo de fluido de canais iônicos na gravação da remendo-braçadeira. Painel inferior é a vista lateral (sagital) da câmara de remendo-braçadeira. Ele resume o caminho de fluxo de fluido e localizações de uma célula estudada, eletrodos e entrada/saída do fluido. Porque o fluido é bombeado continuamente para fora através do tubo de saída por sucção, a altura do fluido na câmara é mantida a um nível relativamente constante. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação de11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos de fluido fluam na L-tipo dependentes de voltagem Ca2 + canal (VDCCL) correntes com e sem o agarose 3M ponte de KCl. VDCCL correntes foram gravadas nos rato enzimaticamente dispersos mesentérica miócitos arterial com gravação de remendo-braçadeira perfurada de Nistatina. Solução salina fisiológica de tyrode normal com 4,2 mM EDTA sem cátions divalentes utilizou-se como a solução de banho11. A solução da pipeta contida CsCl, 140 mM; MgCl2, 1mm; HEPES, 5 mM; EGTA 0,05 mM; pH ajustado a 7.2 com CsOH. (A e B) Com agarose 3M KCl-ponte. (A) representante eu-V relação para o atual VDCCL e os efeitos do fluxo de fluido. (B) Resumo dos efeitos fluidos na eu-V relação de correntes VDCCL . (C e D) Sem agarose 3M KCl ponte. (C) eu-V relações das correntes VDCCL . (D) resumiu o eu-V as relações das correntes VDCCL pico na ausência e presença de fluxo de fluido. As formas das etapas de tensão para suscitar VDCCL correntes são mostradas em baixo-relevo a figura. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação de11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos do fluxo de fluido na junção do metal líquido potencial entre o banho fluido e Ag/AgCl referenciam eletrodo e estimativa da concentração de Cl– real na camada unstirred adjacente ao eléctrodo de referência da junção da medida potencial. (A) rastreamento de A representante das mudanças potenciais de junção devido a várias taxas de fluxo de fluido (painel superior). Esta figura foi modificada de uma anterior publicação de11. A relação de taxa de fluxo de fluido de potencial de junção (n = 5). (B) a parte superior do painel: representante gravação de mudanças potenciais de junção devido a diferentes concentrações de soluções de NaCl. Painel inferior: o enredo semi log da relação potencial-[Cl–] junção (n = 5). A linha reta em vermelho representa o melhor ajuste por uma equação de Nernst modificado pelo equilíbrio potencial com um declive de dez vezes de 49 mV. Devido à seletividade finita do at+, comparada com a de Cl-, para gerar a junção de metal líquido potencial, o valor de inclinação de 49 mV, em vez de 58 mV, produziu o melhor ajuste na relação potencial-[Cl–] junção no quarto temperatura. A inclinação de 49-mV indica o Cl– dependência (ou seletividade) do Ag/AgCl eletrodo referência > 95% em relação a outros íons (no caso, at+), de acordo com a equação de tensão de Goldman-Hodgkin-Katz. Um turno de 7 mV uma concentração de Cl– de 150 mM indica uma diminuição da concentração de Cl– de ~ 30%. Rastreamento de representante (C) um potencial de junção em diferentes concentrações de soluções de NaCl com uma utilização da ponte de agarose M KCl 3 (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: esquema dos efeitos de convecção modelo de fluxo de fluido sobre as concentrações de íons adjacentes aos canais abertos durante o atual fluxo de iões. (A) em condições estáticas com pouco transporte convectivo de íons na solução com o campo elétrico, o íon K+ do fluxo através de K+-canais de íon seletivo podem causar uma diminuição nas concentrações de K+ no microdomain adjacente para o entrada do canal. (B) fluido fluxo convectively pode restaurar a diminuição na concentração de K+ adjacente à entrada do canal aberto. (C) efeito de fluxo do fluido sobre as correntes de canal Kir2.1 retificador para dentro. Fluxo de fluido instantaneamente aumentou as correntes de Kir2.1. A forma da etapa de tensão é mostrada em baixo-relevo a figura. As correntes de Kir2.1 foram gravadas usando alta K+-soluções de banho e - pipeta. Solução de banho: 148,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5mm HEPES, 0.5 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 11mm D-glicose; pH ajustado para 7,4 com NaOH. Pipetar solução: 135 mM KCl, 5 mM de NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5mm etilenoglicol-bis (2-aminoetil)-N, N, N', N',-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA), pH 7,2 (ajustado com KOH). Desde RBL - 2H 3 células são altamente suscetíveis à hipo-osmótica inchaço e consequente gatilho de volume-ativado Cl– correntes, sacarose 38mm foi adicionado para a solução de banho para ajustar para osmolaridade e evitar o inchaço da célula. Além disso, um bloqueador de canal de Cl– [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic acid (DIDS, 30 µM)] foi adicionado à solução da pipeta para eliminar qualquer contaminação por correntes de Cl– . Painel C foi modificado de uma anterior publicação10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, temos demonstrado um método para medir a concentração de Cl– real na camada unstirred adjacente para o eletrodo de referência Ag/AgCl, determinando a potencial de junção metal líquido com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta preenchida com um alto KCl concentração. A mudança na concentração de Cl– na camada limite pode resultar em uma mudança de potencial de junção quando mudar de estática para condições de fluxo de fluido. Simplesmente usar um ponte de KCl entre o eléctrodo de referência e banho líquido de agarose pode evitar os erros relacionados à concentração de Cl– ou artefatos durante a gravação da remendo-braçadeira.
Além de enfatizar a importância de uma ponte de sal ágar ou agarose, outra aplicação deste método em estimar a concentração de íons de real na camada limite unstirred é a seguinte. Porque canais iônicos plasmalemmal podem funcionar como eletrodos íon-seletivos (assim como os Ag/AgCl eletrodos funções como um eletrodo de Cl– ), a concentração do íon real no limite unstirred camada adjacente à entrada do canal na membrana celular superfície pode ser diferente a concentração média do fluido em massa. Esta diferença na concentração de íons entre o volume fluida e unstirred camada adjacente à membrana celular é o cenário real em ambientes clínicos e deve ser distinguida da modulação biológica da retenção de canal pela força de cisalhamento do fluxo fluido /. Infelizmente, ao contrário do efeito de camada unstirred entre o eletrodo de referência Ag/AgCl e banho líquido, não podemos consertar o efeito de camada unstirred adjacente à superfície da membrana celular ao estudar o Regulamento de canais iônicos por força de cisalhamento/fluxo do fluido.
No entanto, considerando a observação de que a concentração real de íons na camada unstirred é aproximadamente 70% do que no fluido em massa (Figura 3), nós podemos fazer algumas alterações nos dados experimentais para distinguir a biológica modulação de canais iônicos desde o "fenômeno eletroquímico do efeito de camada unstirred". Aproximadamente 70% da concentração média da maior parte banhando a solução em um recente estudo10, esperava-se a concentração do íon real na camada de unstirred na superfície da membrana celular. Desde que o fluxo de fluido restaurado a concentração do íon diminuída, facilitou a Kir2.1 atual independentemente celular sinalização10. Em nosso estudo anterior, a densidade de corrente foi consideravelmente alta (2.5 uma / m2) com alta extracelular K+ , concentração e expressão elevada de Kir2.1 em RBL células10. No entanto, no caso real de membranas celulares com várias amplitudes de densidade de corrente de canal de íon, o efeito de camada unstirred na superfície da membrana celular pode depender grandemente a amplitude da densidade de corrente de canais de íon. Além do mais, isso pode causar alguns iões correntes de canal (especialmente aqueles com relativamente baixas densidades de corrente) para ser insensível ao fluxo de fluido do Regulamento; embora, o efeito de camada unstirred é regulamentado eletroquimicamente e não biologicamente. Assim, isso pode afetar a técnica descrita aqui. Portanto, a possibilidade de desenvolver um método quantitativo que é adequado para corrigir resultados experimentais deve ser investigado, no futuro, estudos.
Na Figura 3, observou-se que potencial de metal líquido junção entre o eletrodo de referência Ag/AgCl e banho líquido foi grandemente dependente na condição do eletrodo de Ag/AgCl. Na verdade, quando o eletrodo de Ag/AgCl era perfeito em condições, alterações na junção potencial devido ao fluxo do fluido foi mínimos (dados não mostrados). No entanto, o pobre cloração do eléctrodo Ag/AgCl causou uma mudança maior na junção do potencial. Desde que o eletrodo de referência Ag/AgCl é muito suscetível a vários estímulos externos, tais como o estresse oxidativo e luz ultravioleta, usar um ágar ou agarose ponte de KCl é sempre recomendado. Embora as alterações no potencial de junção por fluido fluem entre banho fluido e o eletrodo de referência é uma potencial fonte de erro, estimamos com êxito as concentrações de íon real na camada limite unstirred medindo-se o deslocamento da junção potencial sob diferentes taxas de fluxo de fluido (Figura 3A e 3B).
O ponto crítico na etapa 4 para a preparação da curva padrão para a estimativa da concentração de Cl– real nas unstirred camadas de limite a partir da mudança de potencial de junção é que a curva de calibração deve ser registrada sob um caudal suficiente (30ml / min neste experimento). Embora esta taxa de fluxo é muito rápida, em casos práticos, o mais rápidos o líquido, quanto menor a queda de concentração é nas camadas limite (Figura 3). Além disso, a pipeta aberta deve ser preenchida com KCl alto, em vez de uma solução de pipeta regular, para que um estudo da remendo-braçadeira evitar a mudança em potencial entre uma pipeta e banhar-se solução de junção.
A força de cisalhamento no cenário da remendo-braçadeira pode ser estimada a partir da seguinte relação11:
Τ = (6μQ) / (bh2) (equação 2)
Onde: τ é a tensão de cisalhamento (N/cm2); Μ é a viscosidade (0,001 N m/s2 para a água a 20 ° C); Q é a taxa de fluxo do fluido (m3/s); b é a largura da câmara (m); e h é a altura de câmara (m). Quando a taxa de fluxo do fluido é 30 mL/min, a força de cisalhamento na câmara-remendo mostrada na Figura 1 é estimada em ~0.75 dyn/cm2 de acordo com a equação acima. Este é um nível de força de baixo cisalhamento em comparação com a força de cisalhamento fisiológicas; células endoteliais de vasos sanguíneos podem ser submetidas para distorcer as forças de até 40 dyn/cm18,19. Portanto, desde que os canais iônicos não são sensíveis a forças de cisalhamento menos de 0,75 dyn/cm2, podemos estudar a sensibilidade de força de cisalhamento do fluxo fluido/de canais iônicos depois excluindo o efeito da camada de limite unstirred, definindo a condição de controle a 0,75 dyn/cm2. No entanto, alguns canais iônicos, incluindo Kir2.1, parecem ser sensíveis a forças de cisalhamento menos de 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6.
O efeito de camada unstirred foi originalmente sugerido por Barry e colegas12,13,14,15. Aqui, nós fornecemos um método para estimar a concentração real de íons na camada unstirred medindo mudanças no potencial de junção com pipeta remendo-braçadeira aberta. Sugerimos também que este efeito da camada de limite unstirred pode contribuir para fluido Regulamento induzida pelo fluxo de correntes do canal de íon e deve ser considerado enquanto estudava fluido fluxo-mechanosensitivity de canais iônicos. No entanto, com base nesta hipótese, pode ser solicitado por algumas correntes do canal de íon não são sensíveis ao regulamento de dependente de fluxo fluido se o efeito unstirred da camada limite é uma eletroquímica, ao invés de controle biológico. Como brevemente abordados acima, isto é, provavelmente, porque apenas as correntes de iões através de canais com grande suficiente condutância de canal único e bastante aberto longa pode ser facilitada pelo fluxo de fluido. Ou seja, para o estabelecimento da camada de unstirred, em que a concentração do íon é diferente a partir da média em solução em massa, fluxo na fase de membrana deve ser bastante rápido comparado com que no aquosa fase14. Nós recentemente têm sugerido que a corrente através de canais de Kir2.1, cuja condutância e tempo aberto são suficientemente elevada, é facilitada pelo fluxo de fluido através de mecanismos de restauração convectiva da concentração de íons na camada limite unstirred da 11de superfície da membrana celular.
Em conclusão, apresentamos um método para medir a concentração de íons na camada limite unstirred adjacente à superfície do elétrodo e membrana celular referência com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta. Além de enfatizar a importância de uma ponte de KCl de agarose, este método também fornece uma maneira para explicar o efeito de camada unstirred ao interpretar o fluxo de fluido/cisalhamento força controle de canais iônicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa pioneiro de centro de pesquisa (2011-0027921), pela ciência pesquisa programas básicos (2015R1C1A1A02036887 e 2016R1A2B4014795-NRF) através da nacional Research Foundation da Coreia financiada pelo Ministério da ciência, TIC & Planejamento de futuro e por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D Project através de Instituto para o desenvolvimento indústria da saúde a Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
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