Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Humaniseret SCID-NOD-IL2rγnull (hu-NSG) mus Model for HIV replikation og Latency undersøgelser

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58255
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Denne protokol indeholder en metode til at etablere humaniseret mus (hu-NSG) via intrahepatisk injektion af menneskelige hæmatopoietisk stamceller i stråling-aircondition neonatal NSG mus. Hu-NSG musen er modtagelige for HIV-infektion og kombinatorisk antiretroviral behandling (vogn) og tjener som en passende patofysiologiske model for HIV replikation og latency undersøgelser.

Abstract

Etiske regler og tekniske udfordringer for forskning i menneskelige patologi, immunologi og terapeutisk udvikling har lagt små dyremodeller i høj efterspørgsel. Med en tæt genetiske og adfærdsmæssige lighed med mennesker er små dyr som musen gode kandidater til menneskers sygdomsmodeller, hvorigennem menneske-lignende symptomer og svar kan blive sammenfattet. Yderligere, mus genetiske baggrund kan blive ændret for at imødekomme forskellige krav. SCID-NOD-IL2rγnull (NSG) mus er en af de mest udbredte immunkompromitterede mus stammer; Det giver mulighed for engraftment med menneskelige hæmatopoietisk stamceller og/eller humane væv og den senere udvikling af en funktionel menneskelige immunsystem. Dette er en afgørende milepæl i forståelsen af de prognose og Patofysiologi af menneske-specifikke sygdomme som HIV/AIDS og medvirken søgen efter en kur. Heri, rapporterer vi en detaljeret protokol til at generere en humaniseret NSG musemodel (hu-NSG) af hæmatopoietisk stamcelletransplantation til en stråling-aircondition neonatal NSG mus. Hu-NSG musen model viser multi lineage udvikling af transplanterede menneskelige stamceller og modtagelighed for HIV-1 viral infektion. Det indeholder også vigtige biologiske karakteristika som svar på kombinatorisk antiretroviral behandling (vogn).

Introduction

Fordi etablering af passende dyremodeller for humane sygdomme er nøglen til at finde en kur, har passende dyr modeller længe været forfulgt og forbedret over tid. Blevet udviklet flere stammer af immunkompromitterede murine modeller, der tillader engraftment af menneskelige celler og/eller væv og den efterfølgende udførelse af humaniseret funktioner1,2. Sådanne humaniseret musemodeller er kritisk for undersøgelser af menneske-specifikt sygdomme3,4,5.

Erhvervet immundefekt syndrom (AIDS) som følge af infektion med human immundefekt virus (HIV) er et eksempel. Inden fastsættelsen af humaniseret musemodeller begrænset etiske og tekniske begrænsninger HIV/AIDS prækliniske dyreforsøg til ikke-menneskelige primater3. Dog hæmme høje udgifter og krav til specialiseret pleje for sådanne animal HIV/AIDS undersøgelser i typiske akademiske indstillinger. HIV primært inficerer menneskelige CD4 + T-celler og dens indvirkning på udvikling og immunrespons af andre menneskers immunceller som B-celler, makrofager og dendritiske celler6; Derfor, lille dyremodeller transplanteret med funktionelle menneskers immunforsvar er i høj efterspørgsel.

Et gennembrud kom i 1988, da CB17 -scid mus med en Prkdcscid mutation blev udviklet og viste vellykket engraftment af det menneskelige immunsystem1. Prkdcscid mutation resultater i defekte T - og B-celle funktioner og en ablated adaptive immunsystem i mus, hvorved engraftment af humant perifert blod mononukleære celler (PBMC), hæmatopoietisk stamceller (HSCs), og føtal hæmatopoietisk væv7,8. Ikke desto mindre, lave niveauer af engraftment er ofte observeret i denne model; mulige årsager er 1) resterende medfødte immun aktivitet moduleret via natural killer (NK)-celler og 2) den sene udvikling af musen T - og B-celler (leakiness)5. Den senere udvikling af den ikke-overvægtige diabetikere (Nik)-scid musemodel opnået dramatisk ned-regulering af NK-celle aktivitet; Det er således kunne understøtte et højere niveau og mere bæredygtig engraftment menneskelige immunsystem komponenter9. Til yderligere undertrykke eller hindre udvikling af medfødt immunitet, musemodeller forsynet med trunkering eller samlede knockout af interleukin-2 receptor γ-kæden (Il2rg) i (NIKKER) -scid baggrund blev etableret. Il2rg, også kendt som fælles cytokin-receptor γ-kæde, er en uundværlig bestanddel af forskellige cytokin receptorer10,11,12,13. Stammer som hilsen. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) og NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) fremlægge robust afbrydelse af musen cytokin signalering og komplet ablation af NK-celle udvikling, tilføjelse til alvorlig forringelse af adaptive immunitet14,15,16.

Tre humaniseret musemodeller forsynet med en scid mutation og Il2rg knockout er ofte ansat i HIV/AIDS-forskning: BLT (knoglemarv/leveren/Thymus) model, PBL (perifere blod leukocyt) model og SRC (SCID genopretning celle) model 3. the BLT model er skabt via kirurgiske transplantation af menneskelige føtal lever og thymus under musen nyre kapsel ledsaget med intravenøs injektion af føtal lever HSCs3,17,18. BLT musen model tilbyder høj engraftment effektivitet, udvikling af menneskelige hæmatopoietisk celler i alle slægter, og etablering af en stærk menneskelige immunsystem; Derudover T-celler er uddannet i en menneskelig autolog thymus og udstille HLA-begrænset immunrespons4,5,17,19. Kravet om kirurgiske procedurer er dog den store ulempe ved modellen BLT. PBL musen model er etableret ved intravenøs injektion med menneskelige perifere lymfoide celler. PBL-modellen byder på bekvemmelighed og giver vellykket T-celle engraftment, men dens anvendelse er begrænset på grund af utilstrækkelig B-celle og myeloide celler engraftment, lav engraftment niveauer samlede og udbrud af alvorlige graft - versus - host sygdom (GVHD)3 ,20. SRC mus modellen er etableret gennem indsprøjtning af menneskelige HSCs i nyfødte eller unge voksne SCID mus. Det udstiller gennemsnitlige engraftment effektivitet over 25% (vurderet som perifert blod CD45 procent) og understøtter flere-lineage udviklingen af injicerede HSCs og udarbejdelse af en medfødte menneskelige immunsystem. Begrænsning af SRC model er dog, at T-celle respons er mus, H2-begrænset i stedet for menneskelige HLA-begrænset14,21.

SRC musen model betragtes som en letkøbt og pålidelig model for prækliniske små dyr undersøgelser i HIV/AIDS, eksemplificeret ved den konsekvente engraftment menneskelige immunsystem og vellykket hæmatopoietisk udvikling. Vi tidligere rapporteret etableringen af en NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) musemodel og beskrevet sin ansøgning i HIV replikation og latency undersøgelser22,23,24. Denne hu-NSG musemodel udstiller høje niveauer af knoglemarven homing, modtagelighed for HIV-smitte, og sammenfatning af HIV-infektion og patogenese. Derudover hu-NSG musemodel reagerer behørigt på kombinatorisk antiretroviral behandling (vogn) og sammenfatter plasma viral rebound ved vogn udbetaling, bekræfter oprettelsen af en HIV latency reservoir25,26 ,27. Denne HIV latency reservoir er yderligere dokumenteret ved produktion af replikationskompetente HIV virus ex vivo induceret af menneskelige hvilende CD4 + T-celler isoleret fra inficerede og vogn-behandlede hu-NSG mus.

Heri, beskriver vi detaljerede protokollen for etableringen af hu-NSG musen model fra neonatal NSG mus, herunder procedurer i forbindelse med HIV-infektion og vogn behandling for ventetid udvikling. Vi forventer, at denne protokol for at kunne tilbyde et nyt sæt af tilgange i HIV dyreforsøg vedrørende HIV virologi, ventetid og behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrs pleje og procedurer er blevet udført efter protokoller gennemgået og godkendt af byen af håb institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) afholdt af hovedinvestigator i denne undersøgelse (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Menneskelige føtal levervæv blev indhentet fra Advanced Bioscience ressourcer (Alameda, CA), en nonprofit organisation, i overensstemmelse med føderale og statslige regulativer. Leverandøren har sin egen institutionelle Review Board (IRB) og er kompatibel med menneske beskyttelseskrav. Menneskelige PBMC er isoleret fra kasserede perifert blod prøver fra anonyme raske donorer fra City of Hope blod Donor Center (Duarte, CA), med ingen identifikation med hensyn til alder, race, køn eller etnicitet. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. generelle aseptisk praksis

  1. Udføre vævskultur eksperimenter i udpegede laminar flow kabinetter.
  2. Holde vævskultur medium og kosttilskud under sterile forhold og filtrere ved hjælp af et 0,22 µm filtrering enhed før for at bruge.
  3. Bevare rede menneskelige HSCs i sterile rør og holde på is indtil injektion.
  4. Som følge af svær immundefekt, håndtere NSG mus aseptisk. Bære en engangs kirurgi kjole, hår cap, ansigtsmaske, skoovertræk og handsker til at forhindre forurening. Desinficere bænken overflade, bestråling indehaveren og induktion afdeling for anæstesi med klor kuldioxid baseret sterilant (f.eks.Clidox) før og efter forsøg.
  5. Anvende oliebaserede øjet salve efter retro-orbital blødning for at forhindre tørre øjne.
  6. Skift til antibiotika-holdige kost for at forebygge infektion på grund af retro-orbital blødning.

2. håndtering HIV Virus, inficerede gnavere og Virus-holdige blod/vævsprøver

Forsigtig: HIV er en klasse 3 menneskelige patogenet; håndtering regler skal følges nøjagtigt.

  1. Håndtere HIV virus-holdige prøver i en udpegede BSL2 +/ 3 laboratorium plads. Låse virus-indeholdende reagenser sikkert i en sekundær beholder under transporten. Desinficer den ydre overflade af alle beholdere af grundig aftørring med 10% blegemiddel og isopropanol inden transport.
  2. Holde alle virus-holdige affald i udpegede affaldscontainere med 2-3 lag af biologisk affald poser. Forud for bortskaffelse af affald, desinficere ved generøst sprøjtning affaldet med jod/ethoxylated nonylphenol løsning (f.eks. Wescodyne) og autoklave.
  3. Bære personlige værnemidler: hår cap, ansigt dække, anti-splash ansigtsskærm, skoovertræk, engangs kirurgi kjole og dobbelt-lags handsker.
  4. Håndtere inficerede gnavere med ekstrem forsigtighed. Foretage injektioner og blod samlinger, mens mus er under anæstesi (trin 5.1-5.2, 6.3-6,5, 7.3, og 8.1-8.2).

3. isolering af hæmatopoietisk stamceller

  1. Forberede væv fordøjelsen collagenase/dispase løsning.
    1. Opløse collagenase/dispase pulver til at gøre stamopløsning i en koncentration på 100 mg/mL, og gemme collagenase/dispase stamopløsning i 150 µL alikvoter ved-20 ° C.
    2. For at arbejde collagenase løsning, fortyndes 150 µL af collagenase/dispase lager med 15 mL RPMI 1640 suppleret med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin.
      NOTE: Den endelige koncentration af collagenase/dispase for væv fordøjelsen er 1 mg/mL.
  2. Med en steril barberblad, skære føtal levervæv (16-24 uger drægtighed) i små stykker (ca 2-3 mm3 i størrelse) efterfulgt af fordøjelse med collagenase/dispase løsning (1 mg/mL) i 30 minutter ved stuetemperatur. Juster lydstyrken af fordøjelsen løsning, så alle væv stykker er fuldt neddykket. Bruge den bagerste ende af sprøjten stemplet til at forsigtigt slibe vævsprøve for at lette fordøjelsen.
  3. Passere fordøjelsen blandingen gennem en 70 µm sterile nylon mesh-filter til at erhverve en enkelt cellesuspension.
  4. Berige for CD34 + HSCs ved hjælp af en MACS system pr fabrikantens anvisninger.
  5. Tælle de levedygtige procentdel af beriget CD34 + HSCs ved hjælp af en hemacytometer28 og videre til intrahepatisk injektion i neonatal NSG mus.
  6. Fryse de resterende beriget CD34 + HSCs i frysning medier (f.eks.CryoStor CS2) og bevare celler i en flydende kvælstof tank. På fremtidige anvendelse, genfortælle den levedygtige procentdel af optøede CD34 + HSCs inden injektionen. Med brugen af frysning media, er efter optøning levedygtighed mellem 80 og 90%.

4. intrahepatisk injektion af menneskelige CD34 + HSCs i Neonatal NSG mus

Bemærk: Neonatal NSG mus 2-3 dage efter fødslen er bedst egnet til denne procedure, som de er stærke nok til at udholde bestråling på halv-dødelig dosis, mens unge nok til at have helt svækket immunforsvar. Der kræves ingen anæstesi injektionsvæske HSC.

  1. Placer det hele kuld af neonatal NSG mus (typisk 5-10 mus, begge køn) i et sterilt pie-formet bestråling bur og udsættes for en total dosis på 200-250 cGy gamma-ray-stråling fra en kilde, cæsium-137 stråling. Sikre, at stråledosis er inden for interval, som betydeligt vægttab eller endda døden kan iagttages når NSG mus er udsat for høje doser af bestråling. 12
    Bemærk: Stråling er en sundhedsfare, personlige beskyttelse mod stråling bør tages.
  2. Efter bestråling, indsprøjtes hver neonatal NSG mus med 5 x 105 levedygtige menneskelige CD34 + HSCs ved hjælp af en sprøjte/kanyle setup (figur 1). Direkte injicere celler i leveren.

5. engraftment validering gennem Retro-Orbital blødning og Flow flowcytometri analyse

  1. På 10-12 uger post-HSC injektion, bedøver mus med en isofluran/ilt indånding apparatur. Justere ilt flow for at opretholde isofluran procentdel på 4-5%. Anæstesi tager 3-5 minutter, afhængig af individuelle mus. Korrekt bedøvede mus viser en langsom og dyb vejrtrækningsmønster, og ingen reaktion på tå-klemme stimulation.
  2. Indsamle 50-100 µL af perifert blod fra hver musen gennem retro-orbital stikprøver28. Gemme blodprøver i K2EDTA eller heparinized blod indsamling rør for at forhindre koagulation.
    Bemærk: Blod indsamling rør, skal have blodfortyndende belægning, så musen PBMC kan isoleres fra fuldblod for flow flowcytometri analyse. EDTA er kendt for at hæmme enzymatiske reaktioner såsom PCR og qRT-PCR; således, hvis downstream enzymatiske reaktioner er påkrævet, skal du bruge en heparinized blod samling apparater.
  3. Der centrifugeres blodprøver på 2.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C til pellet blodlegemer.
    1. Overføre plasma analysere nye microcentrifuge rør efter centrifugering og opbevares ved-80 ° C, hvis cytokin analyse er påkrævet.
    2. Lyse røde blodlegemer (RBC) inden for blodlegemer pelleten ved stuetemperatur i 10 minutter ved hjælp af røde blodlegemer lysisbuffer (Tabel af materialer).
      Bemærk: Hvis der ikke kræves plasmaprøver, direkte lyse fuldblod med lysis løsning uden centrifugering.
  4. Pellet resterende blodlegemer efter RBC lysis på 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C; Opsug supernatanten. Vaske celle pellets med 0,01% BSA indeholdende DPBS, centrifuge på 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C og Opsug supernatanten. Gentag trinnet vask en gang mere.
  5. Blokere celler med 100 µL 1 x blokering cocktail (tabel 3 for opskrift) i 20 minutter ved 4 ° C.
  6. Efter blokering, direkte tilføje hver antistof løsning i cellesuspension ved en koncentration på 2 µL/106 celler og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter. Antistoffer for engraftment validering er: antihumant CD45 (leukocytter, RRID: AB_2732068), antihumant CD3 (T-celler, RRID: AB_396896), antihumant CD4 (hjælper T-celler, RRID: AB_397037), anti-menneskelige CD8 (cytotoksisk T-celler, RRID: AB_2722501), antihumant CD14 (monocytter, RRID: AB_10373536), og anti-menneskelige CD19 (B-celler, RRID: AB_10373382). For foreslåede flow panel, venligst se tabel 4 og Tabel af materialer til katalog numre, RRIDs og lotnumre.
    Bemærk: Antistoffarvning i blokerende løsning fjerner ikke-specifik binding af antihumant antistoffer mod mus overflade markører, som flere celleoverflademarkører del homologi mellem mennesker og mus.
  7. Isolere menneskelige PBMC fra raske donorer og forberede single-farvede flow flowcytometri kompensation kontrol bruge renset menneskelige PBMC. Alternativt, brug fluorescens-mærket mikrokugler som kompensation styrer29.
  8. Analysere de perifere blodprøver ved hjælp af en flow forskellige og kvantificere procentdelen af menneskeceller CD45 +, menneskelige CD3 + celler, humane CD14 + celler og menneskelige CD19 + celler fra samlede perifere blodceller.
    1. For downstream hivinfektion og latency undersøgelser, beregne procentdelen af CD4 + T-celler og CD8 + T-celler i CD3 + celler.
      Bemærk: Typisk en CD4:CD8 forholdet mellem 1,5 og 2,5 er observeret før HIV infektion30.

6. analyse af hivinfektion af hu-NSG mus og Plasma virusmængde bruger qRT-PCR

  1. Udbrede HIV BaL viral lager i menneskelige PBMC fra raske donorer, høst på dag 10 efter infektionen og titreres ved hjælp af p24 ELISA kit31.
  2. Vælg hu-NSG mus med mere end 20% menneskelige CD45 + celler i det perifere blod for HIV-infektion.
  3. Bedøver hu-NSG mus med en isofluran/ilt indånding apparatur (trin 5.1).
  4. Efter bekræftelse af dyret er bedøvede, injicere HIV BaL virus i en dosis på 200 ng af p24 pr. musen gennem intraperitoneal rute.
    Bemærk: Være yderst forsigtige med nålen, ikke genbruge nåle, og kassér straks efter brug i udpegede skarpe container. Desinficere området af injektion efter virus administration.
  5. Tre uger efter infektionen, bedøver hu-NSG mus og indsamle perifert blod gennem retro-orbital blødning ved hjælp af heparinized kapillarrør og indsamling rør.
  6. Særskilt plasma og blodlegemer ved centrifugering ved 2.000 x g i 20 minutter.
  7. Lyse RBC. Block og plette resterende blodlegemer med antistoffer for flow flowcytometri analyse (afsnit 5.3-5.8).
    Bemærk: Flow flowcytometri analyse bør fokusere på at sammenligne CD4:CD8 forhold før og efter infektion. Signifikant fald i CD4 + celletal forventes, som CD4 antigen fungerer som en co receptor for viral entry.
  8. Brug plasmaprøver til at analysere HIV viral belastning, ved hjælp af qRT-PCR. Isolere viral RNA fra plasmaprøver ved hjælp af en viral RNA mini kit. Udføre qRT-PCR med HIV-1 LTR-specifikke primere og sonden sætter (sekvens detaljer i tabel 5), ved hjælp af producentens protokol.

7. oral Administration af vognen og validering af Viral Suppression (valgfri)

Bemærk: Dette trin er valgfrit for undersøgelser vedrørende HIV prognose, virologi eller infektion-relaterede Patofysiologi fasen akut infektion. Vogn behandling af HIV-smittede hu-NSG bruges til at sammenfatte HIV latency blandt patienter modtager vogn. Med held HIV-smittede hu-NSG mus får vognen i 4 uger. Vogn regime består af tenofovir disoproxil fumarat (TDF; 300 mg/capsule), emtricitabine (FTC; 200 mg/capsule) og raltegravir (RAL, 400 mg/capsule). Dosis af vogn til behandling af HIV-smittede hu-NSG musene er tilpasset kroppens overfladeareal (tabel 1, ligning 1, tabel 2)32.

  1. Beregnes mængden af hver medicin kræves for hvert bur under en uge efter behandling, under hensyntagen til omfanget af vandflaske, antallet af mus i hvert bur og en gennemsnitlige daglige indtag af vand 4 ml pr. mus.
    Bemærk: Det centrale punkt i dette trin er at sikre, at hver mus får sin daglige dosis inden for 4 mL af drikkevand.
  2. Grind alle tre medicin med justeret doser til fint pulver og opløses pulver blanding i sødet vand (f.eks. Medidrop Suralose). Ændre vand flaske hver uge med frisk opløst vogn cocktail leveres i sødet vand.
    Bemærk: Stof pulver kan ikke opløses umiddelbart, rystes kraftigt for at opnå en homogen suspension før han vendte tilbage i flasken til bedriften bur.
  3. Indsamle perifert blodprøver via retro-orbital blødning hver anden uge og analysere både CD4:CD8 ratio hjælp flowcytometri (afsnit 5.3-5.8) og plasma virusbelastningen ved hjælp af qRT-PCR (afsnit 6.6).
    Bemærk: Typisk efter 4 ugers behandling, plasma virusmængde falder til under detektionsgrænsen og en typisk CD4:CD8 forhold er genoprettet.

8. validering af Viral Rebound efter vogn tilbagetrækning (valgfri)

Bemærk: Dette trin er kritisk i validering latency model, da viral rebound efter vogn tilbagetrækning giver direkte dokumentation for en latenstid reservoir. Det anbefales også at tjene som et kontrol-eksperiment for terapeutiske undersøgelser om HIV rebound suppressants.

  1. Planlægge vogn tilbagetrækning efter plasma viral belastninger fra perifert blodprøver er under detektionsgrænsen og CD4:CD8 forhold er genoprettet til et interval mellem 1,5 og 2,5.
  2. Indsamle perifert blodprøver gennem retro-orbital blødning hver 2 uger efter vogn tilbagetrækning. Nøje overvåge ændringer i plasma viral belastninger (punkt 6.6) samt CD4:CD8-forhold (afsnit 5.3-5.8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flow flowcytometri analyse udføres ofte for at validere renheden af isolerede HSCs, evaluere engraftment niveauer, profil immunrespons virusinfektion, og undersøgelsen vogn effektivitet. En typisk antistof panel indeholder 4-6 individuelle fluorescently mærket antistoffer; en flow Flowcytometret med flere lasere og et bredt udvalg af filtre er således afgørende for at opnå nøjagtige resultater.

For indledende engraftment validering, den menneskelige CD45 + celletal kan variere fra 20% til 80% og delmængder af menneskelige leukocytter skal vises som diskrete befolkninger på flow dot-plot (figur 2). Forholdet mellem CD4:CD8 bliver mellem 1,5 og 2,5 i en sund person; betydelig CD4 + udtynding er typisk observeret efter virusinfektion, hvilket giver et lavere forhold af CD4:CD8; og restaurering af det sunde forhold er observeret på vogn behandling (figur 3).

qRT-PCR giver en detektionsgrænse på 40 RNA kopier/mL af plasma; ordentlig fortyndinger er nødvendig før eksperimentet. Plasma viral belastninger påvises ved hjælp af qRT-PCR i løbet af infektion og vogn regime kan afbildet og bruges til at evaluere effektiviteten af infektion og vogn (figur 4).

Figure 1
Figur 1. Sprøjte/kanyle installationen bruges til intrahepatisk injektion.
Den skræddersyede Hamilton 80508 sprøjte/kanyle opsætning omfatter en 30-gauge, 51 mm lang nål med en skrå kant og en tilknyttet 50 µL glas sprøjte. Maksimalt Injektionsvolumen i denne procedure er 25 µL. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Flow flowcytometri data repræsenterer vellykket engraftment og udviklingen af lymfoide og myeloide celler i det perifere blod.
Med succes parat perifert blodprøver skal have diskrete befolkning separationer, og et godt aflægger hu-NSG mus bør have T-celler, B-celle og monocyt positive befolkninger præsenteres i det perifere blod. Et CD4:CD8 diagram anbefales til beregning af forholdet. en) vellykket engraftment viste mere end 25% CD45 + menneskelige leukocytter i det perifere blod; diskrete befolkning af b) B-celler, c) monocytter, d) T-celler blandt menneskelige CD45 + leukocyt; e) CD4 + hjælper T-celler og f) CD8 + cytotoksiske T-celler er godt adskilt, og g) giver forholdet mellem 1,5 til 2,5 i denne ikke-inficerede hu-NSG. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. CD4 + celler count ændringer i løbet af viral infektion, vogn og vogn trækker tilbage.
Som infektion skrider frem, CD4:CD8 forholdet falder fra 1.5-2.5 til > 1.0, CD4:CD8 forholdet er blevet forkyndt som en klinisk parameter i vurderingen af HIV prognosen samt behandling efficacies. en) repræsentative flow data, der viser ændringen i CD4:CD8 nøgletal i eksperimentel løbet; b) sammenligning situationsoversigt viser effektiviteten af vogn, der kan identificeres som restaureret procentdel af CD4 + T-celler. Påvisning af CD4 + T-celletal ved flowcytometri. N: antallet af testede mus = 6; Fejllinjer: betyder ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, *** p < 0.0001, ns: ikke signifikant forskellige. To-vejs ANOVA analyse er ansat. Figur er genoptrykt med tilladelse22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Ændringer i serum viral RNA kopiere numre i løbet af viral infektion, vogn og vogn trække
Påvisning af plasma viræmi i HIV-smittede hu-NSG mus af qRT-PCR. Det skraverede område angiver den tidsperiode, hvori mus modtaget vogn (fra dag 28-dages 70 som vist). Detektionsgrænsen (angivet ved den stiplede linje) af PCR assay er (~ 110-160 RNA kopier/mL) i 50 til 80 µL plasma opnås gennem halen vene. Stjerne (*) angiver viral RNA ikke påvist i vogn behandlet dyr i dag 56. Serum viral RNA eksemplarnummer analyseret fra perifert blodprøver tjener som direkte beviser vedrørende graden af virusinfektion. Det skal i aftale med CD4 flow analyse. N: antallet af testede mus = 6; Fejllinjer: betyder ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0.0001, ns: ikke signifikant forskellige. To-vejs ANOVA analyse er ansat. Figur er genoptrykt med tilladelse22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Equation
Ligning 1. Dosis oversættelse baseret på kroppens overfladeareal (BSA).
Ligningen for at oversætte menneskelige dosis til dosering mod små forsøgsdyr. Km faktor kan findes i tabel 2.

Medicin Daglig dosis (mg)
Tenofovir disoproxil fumarat 300
Emtricitabine 200
Raltegravir 800

Bord 1. Daglige dosis af individuelle medicin i vogn regime

Arter Vægt (kg) BSA (m2) Km faktor
Menneskelige
Voksen 60 1,6 37
Barn 20 0,8 25
Mus 0.02 0.0007 3

Tabel 2. Vægt, BSA og Km faktor diagram for dosis konvertering

Reagens Volumen (μl) * Endelig koncentration
0,01% BSA i PBS 98
10 mg/ml human IgG 1 100 μg/ml
10 mg/ml mus IgG 1 100 μg/ml
100
* Opskrift er for én celle prøve blokeret i 100 μl blokerende cocktail. Justere lydstyrken tilsvarende med prøven numre.

Tabel 3. Blokering cocktail for isolerede blodlegemer

Antistof Fluorophore Ex. Max EM. Max
CD45 BB515 490 nm 515 nm
CD3 PE-Cy7 496 nm 785 nm
CD4 Pacific Blue 401 nm 452 nm
CD8 BUV395 348 nm 395 nm
CD14 APC-Alexa 750 650 nm 774 nm
CD19 PE 496 nm 578 nm

Tabel 4. Foreslået flerfarvet flow panel

Fremad Primer 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 '
Omvendt Primer 5'-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 '
Sonden * 5'-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 '
* 5'-FAM, 3'-sort hul Quenche 1

Tabel 5. HIV-1 LTR primere og sonde

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunkompromitterede mus aflægger med menneskelige celler/væv præsentere menneskelignende fysiologiske kendetegn og er en enorm værdi for patologi, Patofysiologi og Immunologi undersøgelser vedrørende human-specifikke sygdomme. Blandt flere stammer af immunkompromitterede mus, NIKKE. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) model er den mest immundefekte på grund af sin mangel på både medfødte og adaptive immunitet samt ablated mus-specifikke cytokin signalering3,12,19 . Derfor NSG mus har været flittigt udnyttet i menneskeliggørelse proces, og det er veletableret, at menneskelige celler repopulate i murine perifere blod, lymfoide og myeloide væv, og at musene udviser passende menneskelige immunrespons til smitsomme stimulering som HIV27,33.

På grund af vært begrænsningen af HIV var prækliniske dyreforsøg af HIV virologi og infektion prognose tidligere begrænset til ikke-menneskelige primater inficeret med simian immundefekt virus (SIV, primat version af HIV)3. Videnskabelige fremskridt inden for forskning i stamceller og generation af NSG mus har åbnet mulighed for at foretage HIV forskning på små murine dyr med lavere omkostninger og hurtigere eksperimentelle omsætning. I øjeblikket kan NSG menneskeliggørelse opnås gennem transplantation af 1) føtalt væv og menneskelige HSCs (BLT model), 2) menneskelige PBMC (PBL-modellen) og 3) menneskelige HSCs (SRC model). BLT model tilbyder de højeste engraftment effektivitet samt omfattende udvikling af både lymfoide og myeloide funktioner34,35, men er teknisk krævende. PBL-modellen er det mest praktisk at etablere, men har en kort eksperimentelle vindue på engraftment skyldes GVHD; Desuden det kun tilbyder anstændig perifert T-celle svar og mangler lymfoide og myeloide udvikling. Af disse grunde har ansat vi SRC model i denne protokol, med tilpasninger til at opfylde kravene for HIV undersøgelser. Hu-NSG model er helt blottet for immunforsvaret og effektivt ved knoglemarven homing ved stråling og transplantation; Desuden, det giver mulighed for viral udfordring og efterfølgende undersøgelser i en yngre alder, at undgå udviklingen af aldersrelaterede patologiske problemer kendt at NIKKE stamme baggrund. Selv om T-celler i hu-NSG model er uddannet i en mus thymic miljø og er kun H2-begrænset, kan flere, hvis ikke alle, delmængder af human immun celler udvikle i og kolonisere mus lymfoide og myeloide organer. Mærkbart, er gut-associerede lymfoide væv af hu-NSG model også rekonstitueres med human immun celler; således, denne model kunne potentielt støtter HIV slimhinde transmission, svarende til BLT model22,23.

En af de store forhindringer at udrydde HIV er eksistensen af en latenstid reservoir blandt patienter behandlet med undertrykkende vogn33,36,37,38,39. Latent inficerede celler forbliver inaktiv, og bidrage til HIV viral rebound ved vogn udbetaling. Latency reservoirer er anatomisk placeret i leveren, milt, hjerne og andre lymfoide væv, og er primært sammensat af memory CD4 + T-celler36,40,41. Som rapporteret af vores gruppe, støtter hu-NSG modellen udviklingen af T-celle afstamning, hvilket gør det velegnet til patologisk modellering af HIV latenstid. Vi viste, denne model er meget modtagelige for virusinfektion og efterfølgende til indkøbskurv regime via oral administration. Dramatiske viral rebound opstår umiddelbart ved vogn udbetaling, som fuldt ud understøtter eksistensen af en latenstid reservoir. Latent inficerede memory CD4 + T-celler kan isoleres fra de lymfoide organer af HIV-smittede hu-NSG under vogn, og viral udvækst assays sammenfatte viral rebound ex vivo41. Hu-NSG model og HIV infektion/vogn regime i denne protokol beskrevne således brede programmer inden for områder relateret til HIV virologi, infektion prognose, latency Patofysiologi og antiretroviral terapi udvikling.

Hu-NSG musen model i denne protokol kræver bestråling og intrahepatisk injektion af HSCs på dag 2-3 efter fødslen; Derfor, in-house avl og specifikke boligforhold er påkrævet. Selv om neonatal HSC transplantation generelt udbytter høje engraftment effektivitetsgevinster, i nogle tilfælde kan alvorlige GVHD forekomme. I nogle tilfælde et betydeligt fald i perifere CD45 + celletal kan observeres ved infektion, og i ekstreme forhold, perifert blod CD45 + udtynding kan overholdes; Derfor, blod samling og flow flowcytometri analyse kan være udfordrende. En af de store begrænsninger i denne hu-NSG musemodel ligger inden for den kimære karakter af sin T-celler. T-celler i hu-NSG musen model er uddannet inden for mus thymic miljø og er H2-begrænset i stedet for HLA-begrænses; fuld sammenfatning af de dynamiske ændringer af T-celle subsets efter infektion er derfor mindre sandsynligt. Yderligere, selv om hu-NSG musemodel udviser god modtagelighed for HIV-1 infektion, observerede plasma viral belastning kan være several-fold lavere end i BLT model, muligvis på grund af incomprehensive rekonstituering af menneskelige lymfoide og myeloide funktioner.

I Resumé tilbyder hu-NSG musen afbildet i denne protokol en nem og effektiv metode til at generere en humaniseret musemodel for HIV virologi og latency undersøgelser, som et alternativ til BLT model. Trods sine begrænsninger i omfattende lymfoide og myeloide udvikling, blevet hu-NSG model bevist modtagelige over for infektion og lydhør indkøbskurv behandling eller andre therapeutics22,23,24. Latenstid patologi modellen etableret ifølge denne protokol sammenfatter HIV viral rebound in vivo og latent inficerede memory CD4 + T-celler kan være yderligere isoleret til yderligere undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne afslører ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [tilskud numre, R01AI29329, R01AI42552 og R01HL07470 til J.J.R.] og National Cancer Institute af National Institutes of Health [tilskud antal P30CA033572 til støtte for byen af håb Integrativ genomforskning Analytiske farmakologi og analytiske flowcytometri kerner]. De følgende reagens blev opnået gennem NIH aidsforskning og Reference reagens Program, Division af AIDS, NIAID, NIH: HIV BaL virus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 143 Neonatal NSG mus humaniseret mus HSCs HIV indkøbskurv ventetid
Humaniseret SCID-NOD-IL2rγ<sup>null</sup> (hu-NSG) mus Model for HIV replikation og Latency undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, X., Li, H., Satheesan, S.,… More

Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter