Summary
Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.
Abstract
Proprotein convertase subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) é uma protease de single-volume de negócios que regula os níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) de soro e, consequentemente, as doenças cardiovasculares. Embora PCSK9 proteólise é necessária para seu efeito completo hipercolesterolêmicos, a avaliação da sua função proteolítica é desafiador: PCSK9 só é conhecido para decompor-se, submete-se apenas um único volume de negócios e após proteólise, retém seu substrato em seu sítio ativo como um inibidor de auto. Os métodos apresentados aqui descrevem um ensaio que supera esses desafios. O ensaio centra-se na proteólise intermolecular em um contexto de baseada em célula e decote bem sucedida de ligações para a atividade de luciferase secretada, que pode ser facilmente lido para fora no meio de condicionado. Através de etapas sequenciais de mutagénese, transfecção transiente e uma leitura de luciferase, o ensaio pode sonda PCSK9 proteólise em condições de perturbação genética ou molecular de forma de alta produtividade. Este sistema é adequado para ambos avaliação bioquímica de missense clinicamente descobertos single-nucleotide polimorfismos (SNPs), bem como quanto a triagem de inibidores da pequeno-molécula de proteólise PCSK9.
Introduction
PCSK9 metas o receptor de LDL (LDL-R) para degradação, aumentando o LDL colesterol (LDL-C) e conduzir a doença aterosclerótica do coração1,2. Terapêutica alvo PCSK9 robustamente abaixar o LDL-C e melhorar resultados cardiovasculares para pacientes, mesmo quando adicionado a uma terapia agressiva hipolipemiantes com estatinas3,4. Terapias actualmente aprovadas limitam-se a abordagens baseadas em anticorpos, no entanto e sofrem com a falta de rentabilidade5,6. Para resolver este problema, alternativas terapêuticas menos onerosos, um meio para identificar pacientes propensos a obter maiores benefícios, ou ambos, são necessários.
Abordagens da pequeno-molécula poderiam alvo PCSK9 intracelular, fornecer uma melhor via de administração e reduzir custos, tornando-o "Santo Graal" nesta zona7. No entanto, PCSK9 provou difícil de drogas por pequenas moléculas. Como uma protease, direcionamento função proteolítica do PCSK9 é uma estratégia atraente, como autoproteólise é a etapa limitante de PCSK9 maturação8 e é necessário para o seu máximo efeito no LDL-R9. Até à data, no entanto, esta estratégia não teve êxito, provavelmente devido a bioquímica exclusiva do PCSK9: PCSK9 apenas se fende10, realizando uma reação de single-volume de negócios, e depois autoclivagem, o PCSK9 prodomínio permanece ligado no sítio activo como um autoinibidor11, impedindo a leitura de qualquer atividade de protease mais.
Este artigo apresenta um método para avaliar PCSK9 função proteolítica na moda do elevado-throughput8. Através do mutagenesis local-dirigido, investigadores podem usar este teste para investigar os efeitos da codificação SNPs encontrados na clínica para avaliar os efeitos na proteólise, a etapa limitante de maturação PCSK9. Além disso, este método será útil no design de telas de alta produtividade para identificar moduladores de PCSK9 proteólise, que são antecipadas para, finalmente, interromper a apresentação de PCSK9 ao LDL-r (e modulam hipercolesterolêmicos efeito do PCSK9) . Por último, este protocolo pode ser adaptado para outras proteases com intrinsecamente baixa atividade, desde que i) um par de substrato-protease específico pode ser encontrado, e ii) uma âncora intracelular adequada pode ser estabelecida para o substrato.
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Protocol
1. local-dirigido Mutagenesis de Protease Vector
- Design e ordem personalizada-sintetizados oligonucleotides instalar uma mutação de interesse usando uma modificação do padrão mutagenesis local-dirigido protocolos12. Norma primeiras demão demolhadas (sem purificação adicional) são perfeitamente aceitáveis.
Nota: Uma abordagem geral para projetos cartilha envolve a criação de cartilhas parcialmente sobrepostas conforme indicado na tabela 1, usando uma calculadora de temperatura (Tm) derretimento específica para o polymerase de interesse. - Criar reacções em cadeia do polymerase (PCR) para o mutagenesis local-dirigido no gelo, como indicado na tabela 2.
- Ciclo do PCRs conforme indicado na tabela 3.
- Executar 2-5 µ l de cada PCR em um gel de agarose a 1% e visualizar os produtos para confirmar uma amplificação bem sucedida.
Nota: Um sucesso PCR irá mostrar uma única, proeminente banda de DNA no marcador do tamanho aproximado do modelo (~7.8 kB). - Adicionar 0,5 µ l (por reação de 25 µ l) de DpnI e incubar as amostras a 37 ° C por 1h.
- Transforme a 2 µ l da reação em quimicamente competentes de Escherichia coli.
Nota: Uma cepa de Escherichia coli de rápido crescimento irá reduzir os tempos de incubação, mas toda a tensão clonagem será aceitável. - Placa das transformações em ágar Luria-Bertani (LB) contendo carbenicilina de 50-100 µ g/mL. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
- Selecione 2-4 colônias para crescer em uma cultura em pequena escala (2-5 mL de meio LB com carbenicilina de 50-100 µ g/mL). Incube a cultura a 37 ° C a 220 rpm até que é turvo.
- Isole o plasmídeo de DNA das células usando um kit de purificação (ou seja, "miniprep") do DNA de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar a concentração de DNA eluted usando um spectrophotometer microvolume.
- Sequenciar o plasmídeo extensivamente usando um serviço de sequenciamento Sanger (como um núcleo ou instalações comerciais). Prepare as amostras de DNA de acordo com as especificações do serviço. Primers utilizados com sucesso em reações de sequenciamento prévia são anotados na tabela 4.
Nota: Devido a amplificação por PCR do plasmídeo inteiro, o sequenciamento de toda região codificante PCSK9 é recomendado para cada mutante.
2. alta produtividade baseada em Luciferase Proteolysis ensaio
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Chapeamento de célula (dia 0)
- Usar células de HEK293T baixa-passagem para experiências e uma cultura em de Dulbecco modificado médio águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Executar tudo celular trabalho sob condições estéreis de um capuz de cultura de tecido até que esteja pronto a ensaiar a atividade de luciferase. Estime o número de poços e placas necessárias para o experimento, antecipando que transfections serão realizadas em triplicata para cada condição testada.
- Dissocia o HEK293T células de um frasco de pai, tratando-as com um volume mínimo de 0,05% ácido de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cobrir as células. Inativar o tripsina-EDTA com 2 volumes de DMEM suplementado com 10% FBS e transferência das células para um tubo estéril. Contar as células usando um contador de célula automatizada (e coloração com trypan azul). Centrifugar o tubo a 500 x g por 5 min recuperar as células.
- Aspire o meio contendo tripsina e reconstituir as células em meio de cultura para uma concentração de 2 x 105 células/mL. Usando uma pipeta multicanal, transferi 100 µ l de células a cada poço de uma placa de 96 poços de branco (opaco baixo), que dá uma concentração final de semeadura de 2 x 104 células/poço.
Nota: Para as experiências iniciais, pode ser útil propagar adicionalmente uma irmã, placa de 96 poços de clear-inferior, a fim de monitorar o crescimento celular e aderência durante o protocolo e a guia futuro de solução de problemas. - Incube as celulas em 37 ° C e 5% CO2 por 24 h.
- Prepare um prato principal de plasmídeos em um formato de 96 poços. Dilua cada plasmídeo em tampão de eluição (Tris-HCl, pH 8,5) para 50 ng / µ l em um poço individual de uma placa de 96 poços.
- Prepare 4 poços cada para o controlo positivo (WT) plasmídeo8, plasmídeo de controlo negativo (S386A)8e buffer livre de plasmídeo (para transfections simulados). Se as drogas ou outros tratamentos à base de celular estão sendo planejados e, em seguida, preparem a placa mestra com o plasmídeo controlo positivo (WT) em cada poço, juntamente com 4 poços de cada o plasmídeo controlo negativo (S386A) e o buffer de plasmídeo-livre.
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Transfecção (dia 1)
- Prepare a mistura de transfeccao em um formato de placa de 96 poços, usando placas de 96 poços profundos-bem. Execute os transfections em triplicado, certificando-se de preparar suficiente reagentes para contabilizar perdas de pipetagem e transferência.
Nota: Os cálculos a seguintes preparem suficiente reagente para executar uma placa de 96 poços em triplicado (estimado conservadora para 420 poços).- Faça uma mistura de mestre de um reagente de Transfeccao de lipídios diluídos, adicionando 50,4 µ l de reagente para 2050 µ l de soro reduzido médio. Faça uma mistura de mestre de um reagente de precomplexation do DNA, adicionando 33.6 µ l de reagente em 1730 µ l de soro reduzido médio.
- Usando uma pipeta multicanal, alíquota 16.8 μL de DNA precomplexation reagente mistura diluída em cada poço da placa de fundo-bem.
- Usando uma pipeta multicanal, alíquota µ l 3.2 (160 ng) de cada plasmídeo da placa de mestre para cada poço da placa de fundo-bem.
- Usando uma pipeta multicanal, alíquota 20 µ l da mistura de reagente de transfeccao lipídico diluídos a cada bem da placa e misturar o conteúdo de cada poço usando a pipeta multicanal. Cobrir as placas e deixá-los sentar-se à temperatura ambiente (RT) por 10-15 min para formar complexos de lipídios: DNA.
Nota: Em cima do transfection, os componentes finais por bem será a seguinte: 40 ng de DNA e 0,12 µ l de reagente de transfeccao 0,08 µ l de reagente de pre-complexação de DNA e o conteúdo de cada bem será 10 µ l em volume total (médio reduzido-soro).
- Suavemente, troca o médio sobre as células 293T nas placas de 96 poços, com uma pipeta multicanal, tomando cuidado para não perturbar as células. Substituir o medium aspirado com 95 ml de DMEM suplementado com 10% FBS.
Nota: Este seria um momento apropriado para tratar as células com qualquer droga de interesse. - Adicione 10 µ l da mistura de Transfeccao para cada apropriado bem através de uma pipeta multicanal. Agite suavemente a placa para misturar o conteúdo dos poços. Incube a placa a 37 ° C com 5% de CO2 por 24 h.
Nota: O volume final dos poços vem a 105 µ l, para dar conta da evaporação mais 24 h.
- Prepare a mistura de transfeccao em um formato de placa de 96 poços, usando placas de 96 poços profundos-bem. Execute os transfections em triplicado, certificando-se de preparar suficiente reagentes para contabilizar perdas de pipetagem e transferência.
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Ensaio (dia 2)
- Prepare uma solução stock de reagentes coelenterazine: ascorbato de sódio 3 M [dissolvido em tampão fosfato salino (PBS), preparado fresco], 5m NaCl, 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; dissolvido em PBS, preparado fresco) e coelenterazine de 2mm (dissolvido em metanol acidificado contendo 200 µ l de 3 N HCl / 10 mL).
Nota: O coelenterazine de 2 mM pode ser armazenado por 2 semanas, quando é mantida a-80 ° C e na ausência de luz. - Prepare 2 reagentes de x coelenterazine para a leitura de luciferase, com um reagente separado cada para as células e o meio, de acordo com a tabela 5. Misture todos os reagentes de salvar o coelenterazine primeiro, filtrar a mistura através de um filtro de seringa 0,22 µm e em seguida, adicione o coelenterazine. Protege os reagentes da luz até que estejam prontos para serem adicionados às placas.
Nota: Devido à perda de solução de filtragem, fazer bastante reagente para dar conta tanto a perda de filtração, bem como de transferências. A tabela 5 mostra a concentração final dos reagentes de 2 x (bem como a quantidade de solução para adicionar para ler uma placa de 96 poços com um reagente). - Remova as células a incubadora 24 h após o transfeccao. Usando uma pipeta multicanal, transferi 50 µ l de meio condicionado de cada poço a uma placa de 96 poços (opaca) fresca, com fundo branco.
- Rotule as placas sobre se eles contêm médio ou células. Se mais de uma placa de 96 poços foi transfectada, rotule as chapas a fim de assegurar que cada placa contendo meio é emparelhada com sua placa mãe de células.
- Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 µ l de reagente de coelenterazine não-lítica de 2x para a placa contendo apenas meio de condicionado. Delicadamente, rock ou agitar a placa na ausência de luz, por 5-10 min no RT
- Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 µ l de reagente de coelenterazine lítica x 2 para a placa que contém as células. Delicadamente, rock ou agitar a placa na ausência de luz, por 5-10 min no RT
- Após a incubação, leia a luminescência da placa somente médio em um leitor de placa. Em seguida, leia a luminescência da placa que contém a célula no leitor de placa mesmo.
- Descartar as placas e salvar os arquivos para análise de dados.
- Prepare uma solução stock de reagentes coelenterazine: ascorbato de sódio 3 M [dissolvido em tampão fosfato salino (PBS), preparado fresco], 5m NaCl, 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; dissolvido em PBS, preparado fresco) e coelenterazine de 2mm (dissolvido em metanol acidificado contendo 200 µ l de 3 N HCl / 10 mL).
3. análise de dados
- Realizar uma análise inicial de dados usando o software de planilha eletrônica. Crie uma planilha contendo os resultados de célula e as placas de médio.
- Inspecione manualmente os dados as chapas de célula para identificar mal transfectados poços. Poços que mostram < 5% - 10% da leitura do plasmídeo controlo negativo (S386A) deve ser considerado como mal transfectadas, tornando a interpretação desses dados suspeito.
- Calcule a luminescência do fundo de cada prato dos poços de simulação-transfectadas. Subtrai o fundo de cada prato dos valores de matrícula.
Nota: Este valor pode ser insignificante dependendo do leitor de placa usado. - Processo os dados calculando a proporção de atividade do luciferase a médio em comparação com a actividade do luciferase global para cada poço. Porque a placa de células contém ambos condicionados médio além de células, e a placa somente médio contém a mesma quantidade de meio condicionado como a placa de células, é apropriado usar a seguinte equação:
Aqui, RLU = unidades de luminescência relativa, a leitura de fundo-subtraído do leitor de placa. - Calcule o médio luciferase secretado do controle positivo (WT) e os poços de controlo negativo (S386A).
- Avalie a qualidade geral do experimento calculando um Z-fator13:
Nota: Os valores activos de controlo positivo (WT) e valores de inativos dos poços de controlo negativo (S386A). Valores mais próximos de 1 indicam uma maior qualidade experimental. Considere-se repetir o experimento ou otimizando o fluxo de trabalho, se o valor for inferior a 0. - Transferi os dados do programa de planilha para software de análise de dados científicos.
- Normalize a atividade de luciferase secretada para os valores médios do controle positivo (WT) e o controlo negativo (S386A), definindo o controle positivo como 1 e o controlo negativo como 0.
- Limpe os dados para outliers usando o método de remoção (GOLEADA), regressão e aberrante, definindo a taxa máxima descoberta falsa para 1%.
- Avalie as diferenças estatisticamente significativas, comparando os dados para cada condição mutante (ou mutante) para a média da atividade WT (normalizada para um valor de 1). Executar múltiplas unpaired t-testes, corrigindo para comparações múltiplas, usando o método Holm-Sidak e o α = 0,05.
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Representative Results
O ensaio de proteólise de alto rendimento depende de superar três grandes desafios. Primeiro, para superar a saída intrinsecamente baixa de uma protease de PCSK9 single-volume de negócios, uma protease PCSK9 falta o inibitório prodomínio é usado, com a sequência de clivagem na cauda do prodomínio ligada a um luciferase que pode ser secretada14. Em segundo lugar, para satisfazer a necessidade da protease de dobrar em complexo com sua inibitório prodomínio, que os dois polipeptídeos são coexpressed em trans em um contexto celular15,16, através de um vetor bicistronic. Em terceiro lugar, para diferenciar o clivada de substrato uncleaved, a protease PCSK9 é truncada no C678, que impede a saída da PCSK9 complexo de retículo endoplasmático (ER), mas não tem efeito sobre a função proteolítica17,18 . Tomados em conjunto, isto permite uma avaliação da luciferase secretada como um proxy para a presença e o grau de proteólise PCSK9 (figura 1A). O prazo geral do ensaio é curto, com os passos do mutagenesis local-dirigido do vetor do ensaio (1 - 2) de dias seguidos pelo transfection transiente (dia 3) e a luciferase leitura (dia 4) todos concluída em maior brevidade a 4 dias, com tempo mínimo de "hands-on" ( Figura 1B).
Em geral, este ensaio permite a avaliação simultânea de proteólise PCSK9 sob uma variedade de condições, com a leitura feita por um ensaio de luciferase. Após a aquisição e processamento, os dados podem ser visualizados em formato tabular ou mapa de calor. Em particular, a análise mutacional de codificação SNPs é adequado a esta abordagem. A Figura 2 mostra um mapa de calor de uma biblioteca de mutagénese saturação avaliando a especificidade de sequência de clivagem da protease PCSK9 em sites de substrato P6 através de P6'. Os resultados mostram que a sequência ideal de clivagem é essencialmente o mesmo que a sequência WT (SSVFAQ | SIPWNL). Em particular, a mutação do P6 ou P4 através de P1' resíduos é mal tolerada pela protease, consistente com a ranhura de ligação superficial, hidrofóbicas para essas posições na estrutura de cristal de maduro, clivada PCSK9. Do ponto de vista do desenvolvimento de inibidor, este perfil de especificidade de sequência estreita é um achado útil, como sugere que sem substrato idealizado mimético poderia outcompete a sequência de clivagem endógena. A Figura 3 mostra a atividade de clivagem relativo (comparada a WT) de uma biblioteca de SNPs do missense descritas na clínica, mapeada a estrutura primária PCSK9. Das 84 SNPs avaliados, mais metade mostrou uma mudança significativa na atividade em comparação com a protease WT. Estes resultados sugerem que alterações da atividade proteolítica PCSK9 são de fato bastante comuns na população clínica, e tais alterações podem ajudar a explicar a variabilidade nos níveis de colesterol LDL, visto na clínica.
Figura 1: Diagrama esquemático de geral do elevado-throughput em trans PCSK9 ensaio clivagem. (A) este painel mostra um diagrama esquemático bioquímico do ensaio apresentado aqui. O substrato é composto da sequência de sinal PCSK9 (cinza escuro) e o prodomínio (vermelho) ligado a luciferase que pode ser secretado (NLuc, verde) pela sequência de clivagem PCSK9 (amarelo). A protease é composto por cisteína-histidina rico (CHR) domínio contendo o truncamento de C679X, o domínio catalítico (cinza claro) e a sequência sinal (cinza escuro). O par de substrato-protease é coexpressed em quantidades estequiométricas em um vetor de bicistronic baseado em 2A, passível de manipulação genética. Após coexpression, a protease e substrato co dobram e permanecem sequestrados no retículo endoplasmático (ER). Com atividade de clivagem, a luciferase é libertado do complexo e segregada, onde ele pode ser detectado pelo ensaio do luciferase do meio condicionado. Potenciais perturbações para a atividade de clivagem incluem, mas não estão limitadas a, manipulação genética (perturbação A) ou a presença de pequenas moléculas (perturbação B). (B), este painel mostra o cronograma para o ensaio geral. Mutagenesis local-dirigido sobre o plasmídeo WT é executado em dias -1 e 0, seguido pelo transfeccao no dia 1 e o ensaio do luciferase no dia 2, para uma linha do tempo total de 4 dias. Esta figura foi adaptada da Chorba et al 8. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: sequência de especificidade da protease PCSK9. (A) este mapa de calor mostra a atividade proteolítica, normalizado para o fundo e WT, para cada único aminoácido mutante de uma biblioteca de mutagénese saturação do P6 através de P6' sequência de clivagem. A identidade de sequência WT é mostrada na parte inferior, com os valores para a sequência WT mostrado tanto na parte superior e destacada por retângulos brancos. Um valor de 0 (preto) indica que a atividade de segundo plano e um valor de + 1 (verde) indica o valor do WT. (B) o calor este mapa mostra o desvio padrão dos valores de proteólise da biblioteca de mutagénese saturação mesmo, com valores mais baixos em pretos e mais elevados valores em vermelho. Valores descritos em retângulos brancos tracejados representam mutantes que apresentaram valores de proteólise significativamente diferente do protease do WT, conforme determinado por Holm-Sidak-corrigido, unpaired t-testes com α < 0,05. Os dados mostrados são de 3 experimentos independentes, cada um contendo 3 repetições. Esta figura foi adaptada da Chorba et al 8. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeitos de SNPs PCSK9 na função proteolítica. (A), este painel mostra a estrutura primária de PCSK9, que contém a sequência de sinal (SS; contorno preto), o prodomínio (contorno vermelho), o domínio catalítico (contorno em cinza) e a cisteína-histidina rico domínio (CHR; contorno azul). (B) este painel mostra a localização de 84 SNPs clínicos (retângulos amarelos com contornos pretos) colocado no ensaio de proteólise, mapeado para a estrutura primária. (C) este painel mostra os valores das 47 SNPs com atividade proteolítica significativamente alterada em comparação com a protease WT, conforme determinado por Holm-Sidak-corrigido unpaired t-testes com α < 0,05. Os valores são mapeados para a estrutura primária PCSK9, com um valor de -1 (vermelho) não indicando nenhuma atividade proteolítica e um valor de + 1 (ciano), indicando uma melhoria 2 vezes sobre a protease WT. Esta figura foi adaptada da Chorba et al 8. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: local-dirigido projeto de cartilha PCR mutagénico. Iniciadores de PCR tem parcialmente sobrepostas sequências, de acordo com o projeto mostrado. Um exemplo de um par de primer bem sucedido é mostrado abaixo da tabela. Clique aqui para baixar este arquivo.
| Componente de | Estoque | Volume (µ l) | Final |
| Ultrapura H2O | 17.5 | volume total de 25 µ l | |
| Amortecedor da reação de polimerase | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTPs) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Modelo (tipo-selvagem (WT)) | 2 ng / µ l | 0,5 | 1 ng (total) |
| Primeira demão (Fwd) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Primeira demão (Rev) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Alta fidelidade DNA polimerase | 2 U/Μ l | 0.25 | 0,5 U (total) |
Tabela 2: componentes de um PCR para o mutagenesis local-dirigido. Os componentes devem ser adicionados na ordem em que eles são listados, com a mistura mantida em gelo até que a reação começa.
| Passo | Temperatura (° C) | Tempo | |
| Desnaturação inicial | 1 | 98 | 30 s |
| Desnaturação | 2 | 98 | 10 s |
| Recozimento | 3 | (Tmodelo m) * + 1 | 20 s |
| Extensão | 4 | 72 | 30 s/quilobase (kb) (4 min) |
| Andar de bicicleta | 5 (vá para a etapa 2, total de 35 ciclos) | ||
| Extensão final | 6 | 72 | 5 min |
| Segure | 7 | 12 | Segure |
| * - Escolher o menor Tm modelo de par de primer | |||
Tabela 3: parâmetros de ciclismo sugeridos para o PCR. Os parâmetros sugeridos representam um bom ponto de partida, mas podem exigir a otimização.
| Primeira demão | Localização de recozimento | Sequência (5' para 3') |
| 1 | Promotor de CMV | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminal da NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | E501 PCSK9 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabela 4: validado primers para sequenciamento. Cada cartilha tem sido usada com sucesso na região codificante dos Plasmideos referenciado neste método de sequenciamento.
| Componente (estoque) | Não-lítica (médio) | Líticas (células) | Quantidade de 96 poços (1 placa) |
| Ascorbato de sódio (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 Μ l |
| NaCl (5m) | 5 mM | 5 mM | 7 Μ l |
| (10 mg/mL, 1%) de BSA | 0,10% | - | 700 Μ l |
| Triton X-100 | - | 0,10% | 7 Μ l |
| PBS | A 50 µ l/poço | A 50 µ l/poço | A 7000 µ l |
| Filtrar através da membrana de 0,22 µm e transferir 5880 µ l do filtrado em tubo fresco | |||
| Coelenterazine (2mm) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 Μ l |
| Total volume: 6000 µ l | |||
Quadro 5: componentes de 2 reagentes x coelenterazine para leituras do luciferase. Não-lítica e líticas reagentes são necessários para cada poço que é analisado, a fim de avaliar separadamente o meio condicionado e as células transfectadas. Os reagentes são misturados e filtrados antes da adição da coelenterazine. Após a adição de coelenterazine, protege o reagente da luz até que esteja pronto para uso.
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Discussion
Os procedimentos experimentais descritos acima apresentam um método para superar a intrinsecamente baixa atividade de protease a single-volume de negócios PCSK9 e avaliar sua função proteolítica de forma robusta. O conceito-chave do ensaio depende de conversão de um evento único-volume de negócios em uma leitura enzimaticamente amplificada. Os pontos fortes do ensaio incluem o prazo relativamente curto e facilidade de uso do repórter do luciferase, bem como sua capacidade de expansão para abordagens de alto rendimento. Além disso, o ensaio avalia proteolysis em seu contexto nativo, celular. Além disso, com este ensaio, SNPs clinicamente identificadas podem ser avaliadas por seus efeitos na proteólise PCSK9 sem necessidade de qualquer tecido humano ou paciente; é necessário apenas conhecimento do genótipo de interesse.
Existem várias limitações técnicas do ensaio. Embora o ensaio avalia proteólise dentro da célula, também requer uma superexpressão do vetor. Porque o ensaio requer o transfection transiente de linhagem celular HEK293T, eficiência de transfeccao adiciona a variabilidade intrínseca de-a bem. Enquanto a protease-mortos S386A PCSK9 serve como controlo negativo para proteólise, serve também como o controlo positivo para o transfection em si, uma vez que estas células produzem funcional, embora intracelular presos, luciferase. Avaliar os dados brutos das placas celulares ajuda a identificar essas células com brutas variações na eficiência de transfeccao e estes dados podem ser descartados (e a experiência repetida se desejado). Além disso, processar os dados para a proporção de luciferase secretada fora o luciferase total produzido ajuda a ajustar para variações menores na entrega do plasmídeo e saída transcricional. Tais variações se esperaria para afetar as saídas do luciferase de células e o meio condicionado da mesma forma. Além disso, os vetores utilizados para este teste são favoráveis à formação de linhas isogénicas, inducible célula estável com a linha de Flp-In T-Rex 293 comercialmente disponível, que tem sido empregado com sucesso como um meio de contornar a exigência de lipídios-mediada transfecção. É provável que seja uma característica atraente ao aplicar o ensaio para uma triagem da pequeno-molécula para PCSK9 inibidores de proteólise. Até à data, foram identificados sem tais inibidores, ressaltando ainda mais a importância deste teste.
A engenharia de protease a PCSK9 também cria várias limitações biológicas. Primeiro, o ensaio mede intermoleculares PCSK9 proteólise, em vez da intramolecular proteólise que ocorre com PCSK9 WT. Enquanto estas duas atividades geralmente correlacionam, é improvável que tal uma correlação existe em todas as situações biológicas, e, assim, em algumas situações, a verificação destes efeitos em uma clivagem na CEI PCSK9 do ensaio, provavelmente por um método alternativo como immunoblot, podem ser necessários. Além disso, o ensaio só pode avaliar missense SNPs (e não o efeito de variações não-codificante). Por último, embora PCSK9 proteólise é a etapa limitante de secreção PCSK9, e a redução da proteólise PCSK9 é esperada para causar uma variante de PCSK9 perda-da-função (sobre o fenótipo clínico colesterol), isto não é verdadeiro para todos os SNPs, indicando que pelo menos para algumas mutações, biologia adicional é no jogo8.
A utilidade deste teste reside na sua capacidade para avaliar a função proteolítica de uma protease intrinsecamente baixa-saída. Esses conceitos de design devem traduzir a proteases diferente PCSK9 que sofrem com desafios semelhantes. Para realizar essa modificação, é necessário manter a ligação entre a secreção de clivagem e luciferase. Uma estratégia onde o substrato é substituído com um tipo âncora de membrana ligada à luciferase através de uma sequência de clivagem específica para a protease de interesse deve atender a esse requisito.
Em resumo, este protocolo descreve um método para avaliar PCSK9 proteolysis em uma moda de alta produtividade. Este método será útil tanto para avaliar o efeito de SNPs clínicos na proteólise PCSK9, bem como para a seleção de inibidores da pequeno-molécula de PCSK9.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores graças ao apoio generoso financiamento do NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH através da UCSF clínica e translacional ciência Instituto catalisador programa (UL1 TR000004), o Senado académico UCSF, a Fundação de Hellman, um Gilead Sciences Research Scholar Award, um prêmio Pfizer ASPIRE Cardiovascular (todos John S. Chorba) e do Howard Hughes Medical Institute (para Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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