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Cancer Research

Potentialisation des anticorps anticancéreux efficacité par les médicaments anticancéreux : détection des anticorps-médicament synergie à l’aide de l’équation d’indice de combinaison

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit comment évaluer les synergies entre un anticorps anticancéreux et médicaments anticancéreux dans les modèles précliniques en utilisant l’équation d’indice de combinaison de Chou et Talalay.

Abstract

Potentialisation de l’hostile des anticorps monoclonaux (ACM) par des agents chimiothérapeutiques constitue une stratégie utile pour concevoir un traitement efficace et sûr contre le cancer. Ici, nous fournissons un protocole pour identifier une combinaison rationnelle à l’étape préclinique. Tout d’abord, nous décrivons un essai afin d’évaluer la synergie entre mAb anticancéreux et médicaments cytotoxiques, qui utilise l’équation d’indice de combinaison de Chou et Talalay1cellule. Cela inclut la mesure de tumeur médicament et anticorps-sensibilité cellulaire à l’aide d’un test MTT, suivi d’une analyse informatique automatisé pour calculer les valeurs d’index (CI) de combinaison. Les valeurs de CI de < 1 indiquent la synergie entre mAbs testés et agents cytotoxiques1. Pour corroborer l’in vitro résultats in vivo, nous décrivons plus loin une méthode pour évaluer l’efficacité de traitement de combinaison dans un modèle de xénogreffe de tumeur. Dans ce modèle, le schéma thérapeutique combiné retarde significativement la croissance tumorale, qui se traduit par une survie prolongée significative par comparaison monothérapie témoins. Ce qui est important, l’expérimentation in vivo révèle que le régime de la combinaison est bien toléré. Ce protocole permet l’évaluation efficace des combinaisons de médicaments anticancéreux dans les modèles précliniques et l’identification d’une combinaison rationnelle d’évaluer dans les essais cliniques.

Introduction

L’approche conventionnelle dans le traitement d’un grand nombre de différents types de cancer reposait en monothérapie. Même si elle est encore utilisée dans de nombreux cas, cette méthode rencontre plusieurs obstacles menant à opter pour des thérapies combinées2. En particulier, les cellules cancéreuses sont plus susceptibles de développer une résistance lorsque traités avec un médicament unique en induisant la survie alternative mécanismes3, entraînant un échec thérapeutique dans les patients4. En outre, en monothérapie, médicaments sont généralement administrés à fortes doses. Souvent, cette situation se traduit par l’apparition de forts effets secondaires de dose-dépendante pouvant être intolérable et forcer les médecins à arrêter le traitement2. Pour ces raisons, l’association de molécules anticancéreuses est désormais préféré à une monothérapie.

Combinaisons de médicaments idéal serait ceux qui agissent en synergie contre les cellules tumorales, sans toxicité accrue contre les cellules normales. Synergie se réfère à l’interaction de deux ou plusieurs médicaments qui produit un effet thérapeutique supérieur à la somme de chaque médicament agissant séparément. Ces interactions peuvent entraîner de meilleure efficacité thérapeutique clinique2. Il limite la résistance au traitement, augmente l’efficacité et permet également de réduire la toxicité2. En fait, la dose de chaque médicament peut être réduite pour diminuer leurs effets secondaires en ciblant les différentes voies. En outre, une des molécules peut servir aussi comme un agent sensibilisant contre les cellules cancéreuses. L’effet de la deuxième drogue peut encore être amélioré sur les cellules sensibilisées et dosages moins peuvent être utilisé5.

Thérapie combinée peut inclure deux ou plusieurs médicaments chimiothérapeutiques et/ou des produits biologiques, tels que les anticorps monoclonaux6. Ces mAbs ciblent spécifiquement les cellules exprimant un antigène de surface de cellules d’intérêt et sont capables de tuer les cellules tumorales par des voies immunologiques, y compris la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), avec la participation de cellules effectrices immunitaire 7et6de la cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Ils peuvent également agir par un mécanisme non immunologiques médié par apoptose8,9,10,11. Dans ce cas, l’induction du processus de mort cellulaire programmée peut sensibiliser les cellules cancéreuses, affaiblir leur fonction et accroître l’efficacité du médicament chimiothérapeutique associé à une posologie plus faible. Par conséquent, pro-apoptotique mAb sont de bons candidats pour la conception de schémas de combinaison avec des médicaments antinéoplasiques.

Différents modèles mathématiques ont été décrites pour évaluer la synergie de la drogue ; l’un d’eux repose sur la combinaison indice méthode1. Cette méthode repose sur le principe de la médiane-effet développé par Chou1. L’équation de la médiane-effet met en corrélation la dose de médicament et l’effet de la drogue comme suit.

Equation 1

Ici, D est la dose de médicament ; DM est la dose médiane-effet ; Fa est la fraction affectée par la dose ; m est un exposant qui signifie la forme de la relation dose-effet tracé1. La dose médiane-effet est utilisée pour calculer la dose Dx d’un médicament qui inhibe ou tue «x» pour cent des cellules. La CI est ensuite calculée pour évaluer l’effet additif de la combinaison de médicaments, comme suit :1.

Equation 2

CI la valeur 1 indique un effet additif et la valeur CI < 1 indique un effet synergique, tandis qu’une valeur de CI de > 1 indique l’antagonisme1. L’application de cette méthode est facilitée par la disponibilité d’un programme d’ordinateur, CompuSyn, qui détermine la synergie et l’antagonisme à toutes les doses ou concentrations simulant automatiquement12.

Notre groupe a développé le mAb 8B6 spécifique pour O-acétyl-GD2 ganglioside (OAcGD2) neuroblastome antigène13 et encore démontré que cette mAb est capable d’induire la mort cellulaire avec les attributs de l’apoptose,11. Pour tester si mAb 8B6 peut sensibiliser les cellules de neuroblastome au topotécan agent antinéoplasique, nous avons adapté la méthode susmentionnée, développée par Chou1. Tout d’abord, nous déterminons les dose efficace 50 (ED50) valeurs mAb 8B6 et topotécan. Ensuite, les cellules de neuroblastome équipotentes ratios des deux composés selon ED50 valeurs sont exposées pour déterminer les valeurs de CI à l’aide du logiciel de simulation mentionnés ci-dessus. Cette méthode nous permet de démontrer la synergie entre mAb 8B6 et topotécan in vitro. Ensuite, les auteurs décrivent un protocole pour évaluer plus précisément la puissance et la sécurité de cette combinaison régime in vivo. Ce protocole peut être facilement appliqué pour sélectionner le mAb anticancéreux puissant et sûr et combinaisons agent chimiothérapeutique dans les études précliniques. Une représentation schématique de la présente étude est fournie à la Figure 1.

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Protocol

Logement des animaux et la procédure expérimentale ont été approuvées par le gouvernement Français (accords #C44-278 et #APAFIS 03479.01). Soins des animaux et des procédures ont été menées en vertu de la directive européenne 2010/63/UE et droit Français #2013-118 sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

1. évaluation de l’Interaction médicamenteuse entre mAb 8B6 et le topotécan In Vitro

  1. préparation des échantillons de 96 puits
    Attention : Consulter le Comité de santé et de sécurité de l’institution et suivre les règles locales liées à la sécurité en laboratoire. Lisez les informations de matériel et de la fiche signalétique avant de travailler avec n’importe quel média, lignées cellulaires ou réactifs. Utiliser une technique stérile adaptée et travailler sous une hotte à flux laminaire. Toutes les solutions/matériel qui sont utilisés pour manipuler des cellules doivent être stériles.
    Remarque : Le protocole suivant a été conçu pour être utilisé avec les cellules adhérentes. Modifications sont tenues d’appliquer la méthode de cellules non adhérentes cultivées en suspension ; ce protocole utilise quatre exemplaires pour chaque condition expérimentale.
    1. La croissance de cellules IMR5 dans une fiole de T75.
    2. Le premier jour (jour 0), observer la culture de cellules au microscope pour vérifier la confluence de la cellule. Aspirez le milieu cellulaire du flacon, lavez-le avec 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 3 mL de 0.05 % l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) / solution de PBS. Retourner le flacon dans l’étuve pendant 3 min (37 ° C, 5 % de CO2).
    3. Examiner la culture de cellules au microscope pour le détachement cellulaire.
      Remarque : Si nécessaire, remettez la fiole dans l’incubateur pour une supplémentaire de 3 à 5 min, selon le type de cellules de tumeur.
    4. Ajouter 10 mL de milieu cellulaire complet dans le ballon et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 mL. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    5. Retirer et jeter le surnageant. Resuspendre le culot de cellules dans un milieu de croissance complète. Ajuster le volume sonore moyen pour obtenir une concentration finale de 1 x 105 cellules/mL.
    6. Puits d’une plaque de 96 puits de culture avec 104 cellules chacun, qui est de 100 µL de suspension cellulaire de semences 84. Suivez le schéma expérimental figurant dans la Figure 2.
    7. Incuber les cellules pendant 18 h dans l’incubateur de cellules (37 ° C, 5 % de CO2).
  2. Préparation de la solution
    NOTE : Pour les études de sensibilisation drogue/mAb, modifier le calendrier, la durée et le traitement de la concentration en fonction de la drogue/mAb particulier en question. Notez que la concentration initiale est 3 fois la concentration finale.
    1. Le lendemain matin (jour 1), préparer les solutions suivantes de la drogue à l’aide de milieu de culture complet.
      1. préparation de solutions de mAb
        1. Diluer le mAb dans 500 µL de milieu de culture complet pour obtenir une solution de travail des anticorps avec une concentration de mAb de 240 µg/mL.
        2. Effectuer des dilutions sériées de cinq double comme indiqué dans la Figure 2.
      2. Préparation de la solution topotécan
        1. Diluer, comme ci-dessus, la drogue en 500 µL de milieu de culture complet pour obtenir une solution de travail de médicament avec une concentration finale de 120 nM.
        2. Effectuer des dilutions sériées de cinq double comme indiqué dans la Figure 2.
      3. Préparation de la solution anticorps et drogues
        1. Diluer les solutions drogue et mAb dans 500 µL de milieu de culture complet pour obtenir une solution à 120 drogue nM et mAb 240 µg/mL (solution de travail).
        2. Effectuer des dilutions sériées de cinq double comme indiqué dans la Figure 2.
    2. Pour arriver à la concentration finale, transférer 50 µL de chaque solution médicamenteuse dans les puits correspondantes, comme indiqué au schéma expérimental ( Figure 2).
      NOTE : Transférer 50 µL de milieu de culture complet dans les puits de cellule non traitées, comme il est indiqué dans la Figure 2.
    3. Incuber les cellules pendant 72 h dans l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO2).
  3. Analyse de MTT
    1. Ajouter 10 µL de la solution de réactif MTT dans chaque puits.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 4 h.
    3. Ajouter 100 µL de solution de lyse (10 % SDS dans 0,01 M HCl) dans chaque puits, à l’aide d’une pipette multicanaux et bien mélanger en pipettant également.
    4. Incuber à 37 ° C pendant 4 h dans une chambre humidifiée (95 % d’humidité).
    5. Lire l’absorbance à 570 nm (une570) et 620 nm (un620) à l’aide d’un spectrophotomètre.
      NOTE : Mélanger chaque échantillon à nouveau en pipettant également, avant de lire l’absorbance ; absorbance à 620 nm permet la correction des valeurs de fond non spécifique.
    6. Calculer l’absorption corrigée : corrigé absorbance = une570- un620.
    7. Calculer la viabilité cellulaire comme suit : viabilité cellulaire = 100 x (moyenne corrigée absorbance de l’échantillon / contrôle moyenne d’absorption corrigée).
    8. Calculer les valeurs touchées par fraction (Fa) selon l’équation suivante : 1 - (moyenne corrigée absorbance de l’échantillon / contrôle moyenne d’absorption corrigée).
  4. Logiciel de simulation analyse d’interaction de drogue simple et études de combinaison de médicaments
    1. Exécutez le logiciel de simulation pour ouvrir la fenêtre de démarrage.
    2. Cliquez sur le bouton Nouvelle expérience pour ouvrir la fenêtre principale .
    3. Tapez le nom de l’expérience dans la fenêtre nom .
      Remarque : Une date peut être ajoutée dans la fenêtre de Date .
    4. Cliquez sur le bouton Nouveau médicament seul .
    5. Tapez le nom dans la fenêtre Nom et prénom .
    6. Tapez l’abréviation dans la fenêtre Abbrev .
    7. Tapez l’unité de concentration du médicament dans la fenêtre unités .
    8. Entrez Données Point 1 Dose et la valeur de Fa, appuyez sur entrée.
    9. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les Points de données sont saisies.
    10. Cliquez sur le bouton terminé .
    11. Suivez les mêmes étapes pour entrer dans les Points de données de mAb.
      Remarque : Utilisez la même unité de concentration qui est utilisé par la drogue.
    12. Cliquez sur le bouton Nouveau Combo de drogue .
    13. Sélectionnez le médicament et mAb.
    14. Sélectionnez Un rapport Constant et cliquez sur OK.
    15. Tapez le nom dans la fenêtre Nom et prénom .
    16. Tapez l’abréviation dans la fenêtre Abbrev .
    17. Tapez le ratio drogue/mAb dans la fenêtre de rapport .
    18. Entrez des Données Point 1 Dose et appuyez sur entrée.
      NOTE : Le programme calculera automatiquement les doses de mAb et Combo.
    19. Entrez la valeur de Données Point 1 Fa et appuyez sur entrée.
    20. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les Points de données sont saisies.
    21. Cliquez sur le bouton terminé et, ensuite, cliquez sur le bouton Générer le rapport .
    22. Sélectionnez le médicament et mAb et puis cliquez sur OK.
    23. Sélectionnez la liste déroulante et puis cliquez sur OK.
    24. Sélectionnez en-tête, CI tableauet tableau récapitulatif. Puis cliquez sur OK.
    25. Tapez le nom de fichier du fichier analyse, puis cliquez sur enregistrer pour générer le rapport.
      Remarque : Après avoir cliqué sur OK, le rapport s’ouvre automatiquement dans le navigateur de l’ordinateur par défaut.
    26. Pour imprimer le rapport, choisissez Imprimer du menu fichier du navigateur web. Le rapport contient une Section de Table de résumé qui inclut le titre, date, nom de fichier, description Nota, paramètres (m, Dm et r), ED50 pour chaque agent utilisé en monothérapie ou en combinaison et la table CI pour chaque combinaison à ED50, ED 75, ED90et ED95.
      Nota : Une valeur de CI de < 1 indique la synergie, la valeur CI = 1 indique l’additivité et la valeur CI > 1 indique l’antagonisme.

2. génération des xénogreffes de neuroblastome humain chez les souris Scid Gamma non obèses diabétiques NOD (NSG souris)

NOTE : Exclut toute contamination de la culture cellulaire. Étant donné que la matrice de la membrane basale forme un gel au-dessus de 5 ° C, tout matériel ou médias entrant en contact avec le réactif de matrice de membrane basale doit être prérefroidies/glace-froid. Garder la matrice de la membrane basale sur glace durant tout le processus.

  1. Préparation de la suspension de cellules IMR5
    1. Décongeler le réactif de matrice de membrane basale du jour au lendemain en immergeant le flacon dans la glace dans un réfrigérateur de 4 ° C avant utilisation.
    2. Jour 0, récolter les cellules de IMR5 cultivées comme détaillé ci-dessus.
    3. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
    4. Jeter le surnageant. Laver les cellules 2 x 15 ml de PBS glacee et préparer une suspension de cellules de 5 x 107 cellules/mL dans du PBS glacée.
      Remarque : Si nécessaire, transférer la suspension de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    5. Agiter le flacon de matrice de membrane basale.
      Remarque : Le réactif de matrice de membrane basale doit être décongelé et dispersé.
    6. Ajouter un volume de réactif de matrice de membrane basale et mélangez-le en pipettant également, pour obtenir une suspension de cellules de 2,5 x 107 cellules/ml.
    7. Garder la suspension cellulaire sur la glace.
  2. Préparation des souris
    Remarque : Les souris doivent être âgés de six à sept semaines.
    1. Maintenir la souris sous condition exempts d’agents pathogènes spécifique.
    2. Permettre une période d’acclimatation de trois à cinq jours après que les souris sont arrivés.
    3. Le jour de l’inoculation, raser le flanc où l’injection sera (voir l’étape 2.3.6).
  3. Préparation de l’injection de cellules tumorales
    Remarque : Maintenir la suspension de cellules de matrice glacee membrane basale aseptique tout au long de la procédure.
    1. Mélanger les cellules et tracer soigneusement la suspension cellulaire dans une seringue de 1 mL montée avec une aiguille de 21 G.
    2. S’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue.
    3. Désinfecter la zone de l’inoculation de la souris avec une solution antiseptique.
    4. Presser doucement la peau de la souris sur le flanc entre les doigts, au point d’injection.
    5. Insérez l’aiguille exactement dans le pli de la peau. Ne pas placer l’aiguille dans le tissu afin d’assurer une injection sous-cutanée.
    6. Injecter 100 µL de la suspension de cellules IMR5 (c.-à-d., 2. 5 x 106 cellules) par voie sous-cutanée dans le flanc inférieur droit des souris.
    7. Faire pivoter la seringue pour éviter les fuites et retirer l’aiguille.
  4. Surveillance des changements de poids corporel et la croissance tumorale
    1. Mesurer la longueur (A) et la largeur (B) de la tumeur avec un pied à coulisse.
    2. Calculer le volume de la tumeur à l’aide de la formule (A x B2) x 0,5.
    3. Démarrer le traitement lorsque les tumeurs ont atteint un volume moyen de ~ 50-60 mm3.

3. les drogues et l’Administration d’anticorps chez la souris

  1. Administration intraveineuse de mAb 8B6
    1. Remplissez soigneusement une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec solution de mAb.
    2. Placez votre souris sous une lampe chauffante pendant 10 min à se dilater la veine caudale.
    3. Immobiliser la souris dans une drisse de rongeur.
    4. Désinfecter la zone de l’inoculation de la souris avec une solution antiseptique.
    5. Insérer l’aiguille parallèle à la veine caudale, pénétrant 2 à 4 mm dans la lumière tout en gardant le biseau de la face de l’aiguille vers le haut (Figure 3 a).
    6. Injecter 100 µL de solution d’anticorps par voie intraveineuse (i.v.).
    7. Une fois l’injection terminée, doucement la pression au site d’injection pour prévenir les saignements.
  2. Administration intrapéritonéale du topotécan
    1. Dessiner la solution médicamenteuse dans une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G.
    2. Maintenez le pointeur de la souris dans une position en décubitus dorsal, avec son extrémité postérieure légèrement surélevée.
    3. Désinfecter la zone de l’inoculation de la souris avec une solution antiseptique.
    4. Localisez la médiane du ventre de la souris et mentalement diviser l’abdomen en quadrants. Localiser le site d’injection dans le quadrant inférieur droit ou gauche (Figure 3 b).
    5. Introduire l’aiguille dans l’abdomen (5 mm de profondeur) en position ~ 10 °, dans le quadrant inférieur droit ou gauche.
    6. Injecter 100 µL de solution médicamenteuse par voie intrapéritonéale (i.p.).
    7. Désinfecter le site de l’inoculation.

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Representative Results

Les résultats représentatifs et les chiffres sont adaptées avec la permission du plus tôt de le œuvre publiée14.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 synergétique les effets inhibiteurs de topotécan sur la croissance de ligne cellulaire neuroblastome :

Pour établir la drogue et les concentrations d’anticorps à utiliser pour évaluer les synergies entre le topotécan et mAb 8B6, la drogue et les sensibilités de l’anticorps de IMR5 humain cellules de neuroblastome ont été mesurés en premier lieu, à l’aide d’un test MTT. Exposition à mAb 8B6 ou seul pendant 72 h topotécan a entraîné une inhibition dose-dépendante de la viabilité des cellules IMR5 (Figure 4 a). Les courbes dose-réponse du calcul de l’ED50 valeurs autorisées pour chaque composé. À cette fin, les Fa valeurs ont été calculées en utilisant le logiciel d’analyse de simulation. Les valeurs calculées de50 ED se sont révélés 10 nM ± 1 pour le topotécan (Figure 4 b) et 18 µg/mL ± 3 pour mAb 8B6 (données non présentées).

Basé sur ces valeurs de50 ED, ensuite, la puissance de six équipotentes combinatoire ratios de mAb 8B6 et topotécan ont été testés (Figure 2). Le déplacement de la courbe de dose-réponse de combinaison vers le côté sensible du graphique indique que le régime de la combinaison est plus puissant que chaque en monothérapie (Figure 4 a). Pour obtenir les valeurs de CI et de correspondants ED50 , Fa valeurs ont été calculées. Les valeurs de50 ED du topotécan étaient significativement plus faibles en présence de mAb 8B6 (p < 0,05, Figure 4 b), indiquant que mAb 8B6 sensibilise la cellule tumorale au topotécan. Ce qui est important, les valeurs de CI sont significativement inférieurs à 1,0 (p < 0,05), démontrant une interaction synergique (Figure 5). MAb 8B6 a donc le potentiel comme agent thérapeutique adjuvante pour la chimiothérapie topotécan.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 améliore antitumorale activité du topotécan In Vivo

Parce que les modèles in vitro ni prennent en compte la demi-vie du médicament ni le métabolisme d’un médicament, il est nécessaire corroborer la in vitro résultats in vivo. En outre, en vivo modèles sont très utiles pour évaluer l’innocuité de régime de combinaison. Pour confirmer que la synergie entre le topotécan et mAb 8B6 spécifique aux cellules cancéreuses, les effets antineuroblastoma de la trithérapie dans un modèle de xénogreffe de tumeur ont été évalués. Pour ce faire, la souche de souris NSG un déficit immunitaire sévère a été sélectionnée. Ces souris n’ont pas une innée et un système immunitaire adaptatif15et permettent donc aux chercheurs d’exclure des effets immunomodulateurs induites par la thérapie topotécan qui peut affecter la puissance de mAb. Le traitement a été commencé dès que les tumeurs affichent un volume moyen de 50 ± 2,5 mm3 (Figure 6 a). Les traitements se composait de deux 8B6 mAb (150 µg i.v., jour 7 et jour 11), le topotécan (0,36 mg/kg i.p., jours 7-11), ou une combinaison de mAb 8B6 et topotécan. Le volume de la tumeur ont été suivi au cours de l’expérimentation. Toutes les thérapies conduit à un retard de croissance tumorale par rapport aux groupes témoins (Figure 6 a). Le régime de la combinaison, induit cependant, l’effet le plus (Figure 6 a).

Croissance de la tumeur peut être analysée plus loin afin d’étudier le taux de survie après traitement. À cette fin, l’événement entraînant l’euthanasie de souris a été définie comme la tumeur volume ≥ 1 cm3 pour des raisons éthiques. Cela nous a permis d’effectuer une analyse de survie de Kaplan-Meyer et de calculer la durée médiane de survie sans événement pour chaque groupe expérimental. Comme illustré à la Figure 6 b, les monothérapies amélioré la survie sans événement (EFS) sensiblement par rapport aux groupes témoins (la médiane EFS du groupe imprégnées sur le véhicule était de vingt et un jours ; le groupe de contrôle anticorps, 22 jours ; du groupe topotecan, 26 jours ; le mAb 8B6 groupe, 29 jours [Figure 6 b]). Pourtant, la thérapie combinée a eu pour effet plus fort sur la survie de souris, avec une médiane de EFS étendus aux jours 39,5 (p < 0,05, mAb 8B6 vs combinaison ; p < 0,01, topotécan vs combinaison [Figure 6 b]).

Parce que les interactions synergiques peuvent entraîner une toxicité accrue, la sécurité de schéma l’ensemble doit être évaluée. Ainsi, la perte de poids est couramment utilisée comme marqueur sensible pour la surveillance de la santé dans les rongeurs16. Ainsi, le poids perte-mesuré comme un déclin en pourcentage du poids initial-a été retenu comme indicateur de la tolérabilité systémique de chaque régime d’essai. Pas de perte de poids corporel a été observée, ce qui suggère que le traitement a été bien tolérée (Figure 7). Ces données suggèrent que la combinaison du topotécan et mAb 8B6 représente un plus puissant efficacité antitumorale in vivo que chaque agent seul, sans toxicité détectable.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de l’étude. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Présentation de l’expérience de la combinaison sur une plaque à 96 puits avec des ratios de topotécan-à-mAb 8B6, préparé comme six solutions. Les solutions ont été préparées comme décrit dans le protocole. Puits numéro 1 à 4 servent de mAb 8B6 solutions, puits marqués de 5 à 8 servent topotécan solutions, et puits marqués 9 à 12 servent de mAb 8B6 et topotécan (combinaison) des solutions. Puits étiquetés A et H servir comme témoins ; puits marqués B servent de 0,125 x ED50 concentration médicamenteuse des solutions ; puits marqués C servent de 0,25 x ED50 concentration médicamenteuse des solutions ; puits marqués D servent de 0,5 x ED50 concentration médicamenteuse des solutions ; puits, appelées servir E ED50 concentration médicamenteuse des solutions ; puits marqués F servent 2 x ED50 concentration médicamenteuse des solutions ; puits marqués G servent 4 x ED50 concentration drogues en solutions, comme indiqué. Agents thérapeutiques avec deux unités différentes (par exemple, µg/mL pour mAb 8B6 et nM pour le topotécan) sont analysés dans une combinaison de ratio fixe (0,075, topotécan/8B6). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Injections. (A) une injection intraveineuse dans la veine de la queue d’une souris sobre, à l’aide d’une seringue à insuline de la 27 x 1/2 po, 1 mL. (B) une injection intrapéritonéale pour le quadrant inférieur droit de l’abdomen de la souris, à l’aide d’une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Relation dose-effet du topotécan, mAb 8B6 et leur combinaison sur l’inhibition de viabilité de la croissance des cellules de neuroblastome IMR5 après 72 h d’exposition. Un test MTT a été exécuté comme décrit dans le protocole. (A), la relation dose-effet des courbes sont représentatives de trois répétitions indépendantes, chacune exécuter dans quadruplicates. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart type ; p < 0,001. (B), ED50 du topotécan utilisé en monothérapie ou en association avec 8B6 mAb. Les données sont présentées comme la moyenne ± sem Ce chiffre a été modifié par Faraj Al. 14. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 5
Figure 5 : Valeurs de l’indice combinaison. Pourcentages de survie ont été transformées en fraction affectées des valeurs de (Fa) et permettant de calculer l’indice de combinaison (mesure de synergie, additivité et antagonisme) à l’aide de logiciels, comme il est indiqué dans le texte. Dans les parcelles d’indice de combinaison, les données sont présentées comme moyenne ± écart-type pour trois répétitions indépendantes. Les résultats montrent que 8B6 mAb a eu un effet synergique avec le topotécan (CI < 1). Ce chiffre a été modifié par Faraj Al. 14. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Traitement de combinaison des xénogreffes de IMR5 chez les souris NSG avec mAb 8B6 plus topotécan. (A) les souris portant le neuroblastome humain IMR5 xénogreffes ont été traités avec le véhicule (PBS, i.p.), seul le topotécan (0,36 mg/kg, i.p.), contrôler IgG seul (150 µg, i.v.), mAb 8B6 seul (i.v.) ou topotécan et mAb 8B6 combinés, comme indiqué. L’administration du traitement de mAb 8B6 ou contrôle d’anticorps a commencé le 7e jour après l’inoculation de cellules IMR5 et a été répétée une fois le jour 11. Le topotécan ou traitement de PBS a été commencé le jour 7 et donné pendant cinq jours consécutifs. La croissance de la tumeur a été suivie, et on a calculé les volumes de la tumeur. Le volume tumorale moyenne ± SEM de chaque groupe de traitement (groupe PBS, 9 souris ; tous les autres groupes, 10 souris) sont représentés (* p < 0,05 pour mAb 8B6 contre 8B6 mAb et ensemble, le topotécan ** p < 0,01 pour topotécan contre mAb 8B6 et topotécan ensemble), comme a indiqué. Une réduction significative de volume de xénogreffe a été observée pour la combinaison de 8B6/topotécan mAb, par rapport aux médicaments seuls contrôles, comme il est indiqué (p < 0,05). (B) sans événement figurent les courbes de survie de Kaplan-Meyer des différents groupes traités. Ce chiffre a été modifié par Faraj Al. 14. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Poids moyen pour chaque groupe de traitement, tel qu’indiqué. Le poids moyen des souris au jour J0 a été défini comme poids de 100 %. Le poids de chaque groupe est resté stable pendant la période de traitement. Les données sont présentées comme la moyenne ± sem Ce chiffre a été modifié par Faraj Al. 14. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour prévoir l’effet des interactions médicamenteuses, trois méthodes peuvent être utilisées : la méthodologie d’isobologram17, le mélange non linéaire modèle18et la combinaison de l’index1. L’analyse d’index combinaison est le plus couramment utilisé parce que son application est simplifiée par l’existence d’un programme informatique facile à utiliser. À cette fin, nous avons d’abord caractérisé la réponse dose-effet de chaque agent utilisé seul ou en combinaison, en effectuant un essai MTT19. Cette méthodologie s’appuie sur la capacité des cellules viables pour réduire le sel de tetrazolium dans un produit de formazan de couleur pourpre avec un maximum d’absorbance de 570 nm19. Au moment du décès, les cellules perdent la capacité de convertir MTT en formazan. Ainsi, la quantité du produit coloré formazan est proportionnelle au nombre de cellules viables dans la culture19. En effet, nous avons choisi cette méthode comme une alternative non radioactif à l’incorporation de thymidine tritiée dans l’ADN pour la mesure de la prolifération cellulaire19. Comme tel, MTT dosages ont été largement adoptés et restent populaires dans des laboratoires universitaires, comme en témoignent des milliers d’articles publiés. Alors que la quantité de formazan est mesurée en enregistrant l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque-lecture, une longueur d’onde de référence de 620 nm est parfois utilisé mais pas nécessaire pour la plupart des conditions de test. En contrepartie de l’étape critique décrit ici, nous avons constaté que les conditions de culture utilisées pour cultiver des cellules peuvent affecter les résultats des essais MTT. Nous avons constaté que le nombre de cellules viables, l’activité métabolique de la cellule, l’âge des cultures et le nombre de passages et les détails du milieu de croissance peuvent tous être des facteurs importants. Ainsi, ils doivent prendre en considération quand on répète le test et l’analyse des données. En outre, les conditions de culture de cellules diffèrent pour chaque ligne de la cellule. Ainsi, il est compliqué de fournir que tout effacer les indications sur la cellule, la densité de semis. En règle générale, un nombre moyen de cellules entre 2 000-10 000 cellules par puits est recommandé pour atteindre une densité optimale dans les 72 h. ce qui est important, réduction du MTT reflète le métabolisme des cellules viables et non, plus précisément, la prolifération cellulaire ou la mort des cellules. Par conséquent, dosages MTT ne devraient ni être décrit comme mesurant la prolifération cellulaire, ni cell cytotoxicity20,11. La détection de la mort cellulaire s’appuie sur des analyses cellulaires spécifiques. Par exemple, dans des études précédentes, nous avons utilisé analyse par western blot pour détecter l’activation de la caspase 3 et/ou écoulement cytometry analyse pour détecter la phosphatidylsérine dans le dépliant de la membrane plasmique externe, constatant l’activité pro-apoptotique de mAb 8B613.

Lorsque le test de la combinaison des médicaments, ils peuvent être livrés ensemble ou successivement dans le temps. Compte tenu de la variété du mécanisme d’action, il est difficile de donner des directives précises pour le réglage expérimental pertinent. Pourtant, la plupart des chercheurs utilisent tests directs des associations de médicaments. En outre, la concentration produisant un effet de monothérapie défini d’inhibition de la croissance cellulaire 50 % est couramment utilisées. Les concentrations de médicament reflétant les concentrations plasmatiques réalisables chez des patients sont communément considérées comme pertinents cliniquement. Par conséquent, l’analyse de dose-effet de combinaison est réalisée pour plusieurs doses, maintenir le ratio de combinaison constante avec une dilution en série de l' (ED50)mAb/ratio dedrogue (ED50), même si ce n’est pas une exigence absolue 1. de remarque, les valeurs CI devraient être également calculés en divers ED testés (p. ex., ED50, ED75et ED90) parce qu’ils peuvent changer avec la Fa dans une manière non linéaire1. Après avoir effectué l’analyse automatique des valeurs CI, le coefficient de corrélation linéaire r-valeur estimée par les algorithmes doit être > 0,9, pour tenir compte de la bonté de l’ajustement des données expérimentales. Les valeurs de CI de < 1 indiquent la synergie, les valeurs de CI de = 1 indiquent l’additivité et les valeurs de CI de > 1 indiquent l’antagonisme1. En raison de la variabilité des méthodes expérimentales et le système biologique, le CI calculé doit être encore soumis à examen statistique. Par conséquent, une méthode simple consiste à répéter l’expérience de combinaison de médicaments plusieurs fois suivie par le calcul des valeurs résultantes CI avant de déterminer les statistiques de la moyenne ± écart type1. Il est également conseillé de tester la combinaison dans le plus grand panneau possible des lignées cellulaires, de prendre en compte la variabilité qui existe entre eux.

Ce qui est important, les plusieurs paramètres dans l’étude in vitro ne sont pas pris en considération pour l’extrapolation en vivo . Par exemple, l’in vitro viabilité essais que ni prendre en considération la demi-vie in vivo de la drogue, ni le métabolisme des médicaments in vivo qui peut conduire à l’inactivation de la drogue. Ainsi, l’extrapolation de in vitro à in vivo demeure une question séparée et le médicament bénéfique interaction mis en évidence in vitro doit être confirmé in vivo. Par conséquent, une démonstration claire de synergie dans les souris porteuses de xénogreffes tumorales, à l’aide de la méthode d’index de combinaison, a été publié21. Pourtant, des études in vivo nécessitent un grand nombre d’animaux de définir avec précision la synergie et sont plus long et plus coûteux. Le modèle alternatif efficace F-test nécessite encore des ressources substantielles22. Comme une approche différente pour limiter l’usage d’un grand nombre d’animaux consiste à démontrer la synergie de la drogue dans des modèles de culture cellulaire suivie par la preuve d’une augmentation de la réponse antitumorale de la combinaison dans une étude de xénogreffe limitée14, nous avons utilisé les cellules de neuroblastome humain IMR5 que la cible de la tumeur pour l’étude in vivo . Nous avons retenu des cellules IMR5 parce qu’ils sont tumorigènes souris immunodéprimées23. Alors que des modèles de xénogreffes tumorales humaines fournissent de précieux modèles pour tester les combinaisons de médicaments en vivo24, il peut être difficile d’établir des modèles d’une variété de cellule lignes25. Pour augmenter l’incidence de la formation de tumeurs chez les souris, les cellules peuvent être injectés dans la souris avec une matrice de basement membrane comme un véhicule25. Ce qui est important, étant donné que la matrice de basement membrane se polymérise et se solidifie à une température supérieure à 5 ° C, tout matériel ou médias entrant en contact avec la matrice de basement membrane devrait être prérefroidies/glace-froid, et les solutions de basement membrane doivent rester en la glace au cours de l’ensemble du processus de25. Avec l’utilisation de la matrice de basement membrane, nous avons observé un taux d’abonnement de 100 % avec des cellules IMR5, tandis que, en l’absence de matrice basement membrane, cette lignée cellulaire a démontré un < 80 % aucun taux (données non présentées). En outre, afin d’accroître l’incidence de greffe tumorale, matrice de basement membrane peut également accroître la tumeur croissance taux25. Nous avons observé que tous les xénogreffes figurait par jour 11. Cependant, au cours des sept premiers jours suivant le défi de cellules de tumeur, la présence de grumeaux pu être observée, qui peut être causée par la présence de l’inoculum initial (données non présentées). Ainsi, nous ne considérait pas les mesures de la taille de la tumeur significative avant cette époque. À l’aide de la matrice de basement membrane a permis de réduire le nombre de souris dans le cadre expérimental et pour réaliser l’expérience in vivo dans les trois mois.

Dosages de médicaments/anticorps peuvent varier selon la souche cellulaire de ligne et de la souris. En raison de la limitation de l’analyse de viabilité in vitro pour extrapoler le dosage médicament/anticorps in vivo décrit ci-dessus, doses cliniquement pertinents ont été retenus pour 8B6 fois topotécan et mAb dans le cadre expérimental in vivo , Selon les données publiées par d’autres26,27. Pour extrapoler le réglage de la dose humaine à des souris, lignes directrices publiées antérieurement,28 ont été suivies. En soi, nous avons injecté 150 µg d’anticorps 8B6 i.v. au jour 7, suivie d’une deuxième injection cinq jours plus tard (total dose/souris = 300 µg). Traitement topotécan a commencé le jour même comme la première injection de 8B6 mAb en injectant le topotécan 0,36 mg/kg ou PBS contrôle i.p. pendant cinq jours consécutifs. En contrepartie de l’étape critique décrit ici, nous vous recommandons de commencer des perfusions d’anticorps lorsque les xénogreffes tumorales atteignent environ 50 mm3. Des volumes plus élevés de xénogreffes tumorales seront traduira par un taux de réponse plus faible parce que les charges de tumeur clairement corrèlent inversement avec la concentration en anticorps, l’exposition de l’anticorps et anticorps efficacité29. Nous avons retenu aussi la perte de poids comme un indicateur de tolérabilité systémique de chaque régime testé16. Cependant, l’interprétation du poids collectés est peut-être pas utile avec une tumeur de grande masse. Dans ce cas, body condition score, comme indiqué ailleurs16, est conseillé.

Les tumeurs peuvent être collectées à des moments différents pour l’analyse de l’immunochimie, de fournir de plus amples informations sur le mécanisme d’action déclenchement in vivo. Dans un travail antérieur, l’index apoptotique de tumeur a été évalué après mAb 8B6 perfusion13. À cette fin, des cellules tumorales apoptotiques ont été détectés à l’aide d’un dosage TUNEL13. En outre, le pourcentage des noyaux des cellules tumorales a été marqué avec Ki67 antigène positif souillure pour analyser la tumeur prolifération indice13.

Des souris immunodéficientes sévères n’ont pas l’immunité innée et adaptative avec la perte des cellules T, lymphocytes B et naturel tueur (NK) cellules macrophages réduit et fonctions des cellules présentatrices d’antigène et de l’absence de circulation complément30. Ainsi, ce protocole ne permet pas aux chercheurs de tirer des conclusions quant aux effets présumés de la chimiothérapie en potentialisant la thérapie mAb en altérant le microenvironnement tumoral en vivo31. Toutefois, les deux effets immunomodulateurs putatif de l’agent chimiothérapeutique et le rôle de la région (Fc) fragment-cristallisables de la mAb dans l’amélioration de l’activité antitumorale de drogue valablement prises en considération, mais ces questions nécessitent la disponibilité d’un syngénique modèle avec un système immunitaire intact et un micro-environnement tumoral physiologique.

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Disclosures

S.Fa., J.F. et S.B. sont désignés comme inventeurs de brevets couvrant l’application clinique des anticorps thérapeutiques anti-O-acétyl-GD2.

Acknowledgments

Accorder un soutien : Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz » à Manon, La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan et comité de Vendée, une rose verser S.A.R.A.H, de L'Etoile de Martin et de la Société Française de Lutte contre les Les cancers et les leucémies de l’enfant et de l’adolescent (FSEA). M.B. et J.F. sont pris en charge par La Ligue Contre Le Cancer. Les auteurs remercient l’UTE-installation de la Structure Fédérative de Recherche Bonamy François. Les auteurs remercient également le Dr S. Suzin (Inserm, Paris) pour fournir les cellules IMR5 et Mme H. Estéphan pour son aide technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

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References

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