Summary
Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.
Abstract
Microscopía de fluorescencia es una potente herramienta para detectar moléculas biológicas en situ y monitorear su dinámica y las interacciones en tiempo real. Además de microscopía de epifluorescencia convencional, han desarrollado varias técnicas de imagen para lograr objetivos experimentales específicos. Algunas de las técnicas ampliamente utilizadas incluyen la fluorescencia de una sola molécula resonancia transferencia de energía (smFRET), que puede reportar cambios conformacionales y las interacciones moleculares con la resolución del angstrom y basado en la detección de una sola molécula súper resolución (SR) la proyección de imagen, que puede mejorar la resolución espacial de aproximadamente diez a twentyfold comparado con microscopia de difracción limitada. Aquí presentamos un sistema integrado cliente-diseñado, que combina varios métodos de proyección de imagen en un microscopio, incluyendo proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, una sola molécula basada en detección SR la proyección de imagen y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo la proyección de imagen smFRET. Diferentes métodos de proyección de imagen pueden conseguirse fácilmente y reproducible elementos ópticos. Este montaje es fácil de adoptar por cualquier laboratorio de investigación en ciencias biológicas con la necesidad de rutina y diversos experimentos de imagen a un coste reducido y el espacio en relación con la construcción de microscopios distintos fines individuales.
Introduction
Microscopios de fluorescencia son herramientas importantes para la investigación de la ciencia biológica moderna y la proyección de imagen fluorescente se realiza de manera rutinaria en muchos laboratorios de biología. Por etiquetado de biomoléculas de interés con fluoróforos, directamente podemos visualizar al microscopio y registrar los cambios dependientes del tiempo en la localización, conformación, interacción y Asamblea estado in vivo o in vitro. Microscopios de fluorescencia convencionales tienen una resolución espacial limitada de la difracción, que es ~ 200-300 nm en la dirección lateral y ~ 500-700 nm en la dirección axial1,2y, por tanto, se limita a la proyección de imagen en el 100s de escala de nanómetros a micras. Para revelar los detalles más finos en el conjunto molecular o la organización, se han desarrollado diferentes Microscopias de SR que pueden romper el límite de difracción. Estrategias utilizadas para lograr SR incluyen efectos ópticos no lineales, como estimulante de la emisión (STED) el agotamiento microscopía3,4 e iluminación estructurada microscopia (SIM)5,6, 7, estocástico detección de moléculas individuales, como estocásticos reconstrucción óptica microscopia (tormenta)8 y fotoactivado localización microscopia (PALM)9y una combinación de ambos, como el MINFLUX10. Entre estas microscopías SR, microscopios de SR basados en la detección de una sola molécula relativamente fácilmente modificable de un montaje de microscopio de la solo-molécula. Con activación repetitiva y la proyección de imagen de photoactivatable de proteínas fluorescentes (FPs) o colorantes foto conmutable con la etiqueta de biomoléculas de interés, la resolución espacial puede llegar a 10-20 nm11. Para obtener información sobre las interacciones moleculares y conformacional dinámica en la resolución del angstrom a nanómetro, en tiempo real se requiere. smFRET12,13 es un método para lograr esta solución. En general, según las preguntas biológicas de interés, se necesitan métodos por imágenes con resoluciones espaciales diferentes.
Por lo general, para cada tipo de proyección de imagen, configuración óptica excitación o emisión específica es necesaria. Por ejemplo, uno de los métodos de iluminación más utilizadas para la detección de una sola molécula es a través de la reflexión interna total (TIR), en el que un ángulo de excitación específico debe conseguirse a través de un prisma o a través de la lente del objetivo. Para la detección de smFRET, emisiones de donador y aceptor tintes necesitan espacialmente separados y dirigidos a diferentes partes de la electrónica-multiplicar, dispositivo de carga acoplada (EMCCD), que se logra con un conjunto de espejos y divisores de haz dicroicos colocado en la trayectoria de la emisión. Para tridimensional (3D) SR la proyección de imagen, un componente óptico, como una lente cilíndrica14, es necesaria para causar un efecto de astigmatismo en la trayectoria de la emisión. Por lo tanto, construcción propia o microscopios integrados comercialmente disponibles, generalmente, funcionalmente especializados para cada tipo de método de la proyección de imagen y no son flexibles para cambiar entre diferentes métodos de proyección de imagen en la misma instalación. Aquí presentamos un sistema híbrido rentable, que ofrece interruptores ajustables y reproducibles entre tres métodos de proyección de imagen: proyección de imagen de epi-fluorescente convencional con resolución de difracción limitada, una sola molécula basada en la detección de SR proyección de imagen y detección de una sola molécula varios color, incluyendo smFRET proyección de imagen (figura 1A). En concreto, el montaje que presentamos contiene fibra-juntado entrados láseres para la excitación de varios color y un brazo de iluminación comercial en la ruta de la excitación, que permite programa el control del ángulo de excitación, para cambiar entre modo de epi y TIR. En la trayectoria de la emisión, un cassette de lente cilíndrica de homebuilt desmontable se coloca dentro del cuerpo del microscopio para obtener imágenes de SR 3D, y un divisor de viga comercial se coloca antes de una cámara EMCCD que puede activarse selectivamente detectar múltiples canales de emisión al mismo tiempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. montaje y diseño del microscopio
-
Camino de la excitación
Nota: La ruta de excitación incluye láseres, componentes de interferencia diferencial (DIC) de contraste, el cuerpo del microscopio y el brazo de iluminación.- Preparar una tabla óptica aislado de vibraciones. Por ejemplo, una tabla de amortiguación estructural de 48 x 96 x 12'' da suficiente espacio para todos los componentes.
Nota: Construir la instalación en una sala con control de temperatura (por ejemplo, 21,4 ± 0,55 ° C). Estabilidad de la temperatura es fundamental para mantener la alineación óptica. - Instalar un cuerpo de microscopio que está equipado con un brazo de iluminación para la conexión de fibra óptica a 100 X inmersión en aceite TIRF objetivo y componentes DIC.
- Coloque cuatro cabezas del laser (647 nm, 561 nanómetro, 488 nanómetro y 405 nm, rodeado en la figura 1B) y su calor se hunde en la tabla óptica, y asegúrese de que los rayos láser emitidos tienen la misma altura y son tan corto como sea posible para asegurar la buena estabilidad (p. ej. 3'').
Nota: Si una cabeza del laser se encuentra a una altura más corta que otros láseres, poner una placa de aluminio con espesor adecuado por debajo de ella. Siempre asegurar el máximo contacto entre los disipadores de calor y la tabla óptica para la mejor disipación de calor (figura 1B). Los láseres deben ser lo suficientemente potentes para la proyección de imagen SR. Ver la tabla de materiales. Se recomienda tener filtros de limpieza láser delante de láseres de diodo. - Instalar una tarjeta de adquisición de datos a través de una interfaz de interconexión (PCI) de componentes periféricos en una estación de trabajo y conectar los lasers con esta tarjeta. Control de comportamientos de ON/OFF de los láseres por lógica del transistor-transistor (TTL) de salida y su regulación de la potencia de la salida analógica de la tarjeta (figura 1). Instalar un microscopio adecuado imaging software (comercial o construcción propia) para controlar la tarjeta de adquisición de datos, así como el cuerpo del microscopio.
- Montaje de los espejos y divisores de haz dicroicos (590 525 y 470 largo pasar filtros) a sus respectivas monturas. Utilice soportes de espejo muy estable para los espejos. Use divisores circulares con anillos de retención para evitar cualquier deformación de los divisores de haz dicroicos (figura 1).
- Coloque los espejos y divisores de haz dicroicos sobre la mesa óptica para combinar los rayos láser (figura 1B). Para lograr la alineación más estable, hacer el arreglo entero tan compacta como sea posible y utilizar mensajes ópticos de 1'' de espesor. Colocar el láser para que los láseres de longitud de onda más cortos están más cercanos del acoplamiento de la fibra óptica (figura 1B) desde onda corta luces más disipan en el aire.
- Combina rayos láser en una fibra óptica de modo único. Para ello, construir un acoplador de la fibra en un sistema de jaula a través de los siguientes pasos:
- Monte una placa de adaptador de fibra en un monte de traducción del eje z (Figura 1E, panel de la izquierda).
- Monte un objetivo doblete acromático (longitud focal = 7,5 mm) en una placa de jaula (Figura 1E, segundo panel de la izquierda).
- Conecte las dos partes sobre barras de la extensión para formar una jaula. Monte la jaula sobre la mesa óptica con soportes en los postes de 1'' de espesor ópticos (Figura 1E, panel central).
- Alinear el láser 647 primero con una solo modo de fibra óptica (final FC/APC el acoplador).
Nota: Una alineación aproximada usando una fibra óptica antes de usar fibra óptica monomodo puede ayudar en el proceso de alineación. Ajustar los ángulos de los espejos y divisores de haz dicroicos (figura 1, de perillas de ajuste), así como la distancia entre la lente del doblete acromático y la placa de adaptador de fibra (Figura 1E, ajustando el eje z traducción de montaje) para obtener potencia máxima del láser a través de la fibra. - Una vez que se realiza la alineación del laser de primera, temporalmente instale a un par de lirios y alinear el resto de los lasers uno por uno (Figura 1F). Comprobar la eficacia de la alineación con un medidor de potencia.
- Deje un diafragma en la parte frontal la placa adaptadora para reducir los reflejos de los rayos láser.
Nota: Fuerte atrás reflexiones pueden reducir la vida útil de fuentes láser. Opcionalmente, se puede instalar un aislador óptico frente a cada cabeza del laser para eliminar por completo los reflejos.
- Conecte el otro extremo de la fibra óptica en el brazo de iluminación del microscopio (figura 1 H).
- Diseño e instalación de la "lente de aumento (lente de mag)" a través de los siguientes pasos:
Nota: El láser se puede utilizar para la proyección de imagen de epi-fluorescencia de la muestra, pero el tamaño de haz estrecho de cada láser limita el área iluminada de la muestra a un área varias veces más pequeño que el tamaño real del correspondiente sensor de la cámara, especialmente para los más nuevos cámaras (con 18,8 mm de longitud diagonal respecto a la longitud de 11,6 mm convencional). Por lo tanto, es deseable ampliar la viga para lograr una iluminación más grande y más plana de la muestra.- Diseño de la lente del mag, que cabe en el brazo de iluminación (figura 1 H).
Nota: El diseño de la lente mag depende donde se instalará. Figura 1 H muestra un ejemplo de la instalación en el brazo de iluminación, pero puede ser instalado en cualquier punto después de los rayos láser colimado (ver discusión). Diseño con un software de redacción y diseño asistido por ordenador. - Colocar dos lentes acromáticas, uno cóncavo (longitud focal = f1) y uno convexo (longitud focal = f2) en el soporte del lente mag caseros (figura 2A y 2C), con la distancia igual a la suma de sus distancias focales, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (figura 2B).
Nota: Con esta opción de distancias focales, la lente mag expande la viga f2/ | f1| = 2 dobleces. El objetivo de mag proporciona versatilidad. Puede ser quitado para reanudar la iluminación regular sin ampliar las vigas (Figura 2D) o insertado en la dirección contraria para enfocar el rayo láser para lograr una intensidad más fuerte de excitación.
- Diseño de la lente del mag, que cabe en el brazo de iluminación (figura 1 H).
- Preparar una tabla óptica aislado de vibraciones. Por ejemplo, una tabla de amortiguación estructural de 48 x 96 x 12'' da suficiente espacio para todos los componentes.
2. trayectoria de emisión
Nota: La ruta de la emisión se compone de una lente cilíndrica removible, una rueda de filtros de barrera, un separador de emisión y una cámara EMCCD (figura 1). Para lograr el mejor punto de extensión (PSF) la función de moléculas individuales, el prisma DIC se pone los lentes del objetivo.
- Particulares el cassette de la lente cilíndrica (lentes 3D), que puede caber en el analizador manual de DIC Inserte la ranura en el cuerpo del microscopio (figura 3).
Nota: Este diseño no compromete el analizador DIC ya que un bloque del analizador puede ser insertado en la torrecilla del filtro. - Coloque la lente 3D de 10 m de longitud focal en el cartucho y colóquelo en la trayectoria del haz de emisión para crear el efecto de astigmatismo es necesario para la extracción de la coordenada z de cada molécula individual14.
Nota: Opcionalmente, el cassette de lentes 3-d puede colocarse dentro o fuera de la ruta de emisión (figura 3). - Instalar un divisor de haz dicroicos de varias bandas en la torrecilla del filtro dentro del cuerpo del microscopio.
- Instalar filtros de emisión.
Nota: Los filtros de emisión son elegidos dependiendo de los fluoróforos preferido. Dependiendo del imagen módulo, se utilizan filtros de emisión colocados en diferentes lugares como se describe a continuación:- Para SR imágenes o imágenes multicolor secuencial epi-fluorescencia, usar filtros de emisión en la rueda de filtros de barrera conectada junto al cuerpo del microscopio para reducir al mínimo la vibración en el cuerpo del microscopio durante el conmutador de canal (figura 1).
- Para la detección simultánea de múltiples color (p. ej., smFRET experimentos), colocar otro filtro en un separador de emisión (cheque paso 4 para más detalles).
Nota: Generalmente, un divisor de emisión comercial tiene dos modos conmutables (es decir, "comprometidos" o modos de "bypass"). Para separar luces de emisión cromáticamente para simultánea multicolor la proyección de imagen (modo "a"), se utiliza un cubo de filtro con dos divisores de viga dicroico y tres filtros de emisión ("triple cubo," figura 4 y 4 D). Una ranura vacía en la rueda de filtros de barrera se utiliza en combinación con el cubo triple. Por otro lado, imagen secuencial de varios colores, el cubo triple se sustituye por un cubo que tiene un espejo interior ("by-pass cubo," Figura 4A y 4D).
- Instale la cámara EMCCD como la última parte de la trayectoria de la emisión. Utilizar la conexión USB-PCI para lograr una velocidad rápida.
Nota: Se recomienda una cámara EMCCD para la detección más sensible de una sola molécula, sino una cámara sCMOS avanzado puede ser una alternativa.
3. proyección de imagen con Epi-excitación de difracción limitada
- Ajuste ángulo incidental de los láseres de excitación al modo de epi en el brazo de iluminación.
- Desenganchar la lente 3D si (figura 3, panel derecho).
- Inserte el cubo de bypass en el separador de emisión (Figura 4A y 4E, panel inferior).
- (Opcional) Inserte el lente mag para un área ampliada de la iluminación (Figura 2D, panel de la izquierda).
Nota: Con el uso de una lente de mag y 100 X objetivo de inmersión en aceite, de 91 x 91 μm2 pueden iluminar uniformemente, eliminando la necesidad de utilizar una fuente de luz blanca y varios cubos de filtro. - Usar un microscopio software multicanal, de tomar de imágenes Z-stack o imágenes de lapso de tiempo.
Nota: Hay varios programas disponibles para la proyección de imagen de la microscopia, no sólo de los fabricantes del microscopio, sino también de terceras empresas o desarrolladores de código abierto.
4. la proyección de imagen de una sola molécula multicanal incluyendo smFRET
Nota: Mover a una posición "vacía" en la rueda de filtros de barrera, para que todos la emisión con cualquier longitud de onda puede alcanzar a la segunda serie de filtros/dicroicos divisores de viga en el separador de la emisión.
- Para configurar varios colores una sola molécula detección de moléculas de superficie inmovilizado15 utilizando excitación TIRF, incluyendo medición de smFRET, ajuste el ángulo incidental de los láseres de excitación al ángulo TIRF. Desenganchar la lente mag y la lente 3D.
- Participar del modo de tres canales en el partidor de emisión (figura 1) a través de los siguientes pasos:
- Vuelva a colocar el cubo de derivación con un cubo de"calibración" que permite que la luz ir por todos los canales (Figura 4B y 4E).
- Encender la cámara en DIC (es decir, no hay filtro de emisión en la rueda de filtros de barrera) y ajuste la abertura del separador de emisión hasta tres canales completamente separados aparecen en la pantalla.
Nota: Realizar este paso con la luz de la habitación encendida, para visualizar todos los canales. - Gire las perillas de control de ajuste vertical/horizontal en el separador de emisión y áspero alinear los tres canales (figura 4E y 4F).
- Apague la cámara y vuelva a colocar el cubo de la calibración con un cubo triple (figura 4 y 4E).
- Colocar una muestra con los granos multicanales 100 nm sobre el 100 X objetivo y enfoque en la muestra.
- Encienda la cámara y el láser de 488 nm, acercarse a uno de los granos brillantes y finalmente alinear los tres canales girando el control perillas de ajuste otra vez (figura 4E y 4 G).
Nota: cuentas multicanales 100 nm emiten diferentes longitudes de onda de la luz por excitación de 488 nm, lo que permite la alineación de tres canales.
- Encienda la cámara y láser, enfoque y encontrar una buena posición con una densidad de punto razonable. Ajustar el tiempo de exposición y potencia de láser para lograr niveles aceptables de signal-to-noise y photobleaching. Utilice el software de imágenes de la microscopia para tomar imágenes de lapso de tiempo.
5. SR la proyección de imagen
Nota: Esto es microscopia basada en detección de SR de una sola molécula.
- Para configurar imágenes de SR, inserte la lente 3D y retirar la lente mag. Establecer el tiempo de exposición de la cámara en los canales de láser apropiada (e.g., 5-60 ms). Determinar y ajustar manualmente el ángulo incidental de los láseres de excitación óptima para ser el ángulo de la TIRF.
- Colocar la muestra en SR de búfer16. Permitir que el tampón se equilibren para por lo menos 10 minutos antes de la proyección de imagen.
Nota: Búfer imágenes SR expira después de aproximadamente 1 h, así que SR nuevo búfer de imagen en consecuencia. - Tomar una imagen DIC antes de la proyección de imagen SR. Para encontrar la altura adecuada del objetivo para el SR, que optimiza el efecto del astigmatismo, uso DIC imágenes para encontrar el plano medio de las células. Identificar el plano por la altura a la que las células de transición de la "luz" a las imágenes de "dark" y parecen ser transparentes (figura 5A, 5By 5C). Una vez que se determina el plano focal deseado, comprometer el sistema de corrección de deriva de z (figura 1A).
- Imágenes de SR de conducta. Cambiar la potencia del láser de 405 nm para mantener una densidad razonable de 'parpadeando en' puntos.
Nota: Aunque es posible cambiar manualmente el láser de 405 nm, es más conveniente ejecutar un código de adquisición de datos programados para mantener la densidad de "parpadea en" puntos. Aquí es un ejemplo de cómo se lleva a cabo automáticamente. El código fuente está disponible bajo petición (figura 6).- Comenzar la adquisición de imágenes con 0 energía de láser violeta W/cm2 .
- Contar el número de parpadear en puntos en un período determinado.
- Modulación de la potencia del láser violeta para que la cantidad de parpadeo en puntos se mantiene por encima un definido por el usuario"cuenta" en el campo de visión. Aumentar la potencia del laser de la violeta cuando el número de puntos parpadeando en cae por debajo del umbral de la cuenta.
- Terminar la adquisición cuando el número de puntos parpadeando en cae por debajo del umbral cuenta con la potencia máxima de láser violeta.
Nota: El máximo puede ser ajustado diferentemente dependiendo de la luminosidad de la muestra, pero no más de 130 W/cm2. Dependiendo de la meta real de la proyección de imagen del SR, este código de adquisición automática puede ser terminado manualmente en cualquier punto deseado.
- Compruebe el comportamiento intermitente y las PSFs de los lugares poco después de partir de la adquisición.
Nota: Si el comportamiento intermitente no es ideal, cambiar ángulo incidental de los láseres de excitación o cambie el búfer de imagen. Esperar que una muestra de "vertical", "horizontal" y "diamante" formas de PSF, que representa fluoróforos desde abajo, arriba y en el plano focal, respectivamente (figura 5). Si manchas la mayoría muestran PSFs verticales u horizontales, luego el plano focal está apagado desde el centro de las células, por lo tanto terminar el experimento y ajustar otra vez el plano focal. Presencia de burbujas de aire en el aceite de inmersión o de otros factores puede afectar la calidad de las PSFs, así que puede ser necesario cambiar el aceite o cambiar a un área diferente de la imagen de la muestra. - Para el análisis de datos, utilizar open source (en plugins ImageJ NIH) o códigos disponibles comercialmente para detectar centroides de cada punto en cada cuadro de imagen y extraer valores de z de cada punto de x y y anchos14.
Nota: En este informe, un código fuente desarrollado originalmente en uno de los primeros sola molécula basada en detección SR8 fue modificado para la detección de 3D16 y fue utilizado. - En el caso de la proyección de imagen de dos colores, imagen el fluoróforo con el más longitud de onda de excitación, seguido con la más corta longitud de onda de excitación. Ejecute el código de adquisición automatizada de manera similar a la descrita en el paso 5.4, pero con un láser de diferentes.
Nota: se debe corregir la aberración cromática entre las imágenes con diferentes fluoróforos (p. ej., colorante rojo y colorante amarillo-verde). Aquí están los pasos.- Inmovilizar múltiples granos multicanales 100 nm en el cubreobjetos de vidrio, evitando la formación de clusters.
- Tomar imágenes de ellos en canales de excitación diferentes.
- Extracto de sus (X, Y, Z) coordenadas por software (paso 5.6).
- Parcela ΔX = X1i - X2i y ΔYi = Y1i - Y2i (es para diferentes granos, y 1 y 2 son los canales de color diferente) por separado y que encajen con las funciones apropiadas. Guardar las funciones.
Nota: Las funciones lineales son suficientes en la mayoría de los casos. Una vez determinadas estas funciones, esta medida no debe repetirse cada vez que de proyección de imagen. - En la actual dos colores SR proyección de imagen de una muestra de interés, se aplican las funciones aberración cromática correcta (X, Y). Aberración cromática de z-direccional, la conducta obteniendo ΔZ = Z1 - Z2 para granos multicanales o referencia conocida multicanal muestras sembradas junto con la muestra de interés.
Nota: a diferencia de (X, Y) aberración cromática, aberración cromática de z-direccional no es bien reproducibles en cada experimento, principalmente debido a un mantenimiento incompleto foco de direccional de z al cambiar de canal. Por lo tanto, se recomienda llevar a cabo la corrección cada vez. ΔZ = Z1 - Z2 es independiente de (X, Y), tan sólo unos pocos granos o muestras de referencia sería suficientes por cada uno área de la muestra de interés. Parcela construida final dos colores SR imágenes en un software de visualización 3D y comprobar manualmente ΔZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este microscopio permite flexible y reproducible de la conmutación entre diferentes métodos de proyección de imagen. A continuación os mostramos imágenes de la muestra con cada módulo de proyección de imagen.
Figura 5 muestra la PSF de la molécula de parpadear en durante la adquisición del SR. Miles de tales imágenes se reconstruyen para generar la imagen final de SR (figura 5E). Figura 5E muestra el mismo bacteriano RNAs regulador como se muestra en la imagen de epi-fluorescencia en la Figura 7A. La figura 7 muestra las imágenes representativas de epi-fluorescencia de un regulador pequeño ARN en células de Escherichia coli y un mRNA en células de mamífero U2OS. Ambos RNAs están marcados con fluoróforo tagged ADN oligo en situ hibridación17. La figura 8 muestra la medición representativa smFRET dobladas de moléculas de ARN marcado con tinte (tinte verde) de la donante y del aceptador tinte (colorante rojo). Los complejos son inmovilizados sobre el portaobjetos y excitados por iluminación TIRF. Trayectorias de intensidad de fluorescencia se pueden extraer de las moléculas individuales individuales, generando traste eficiencia como función del tiempo.
Figura 1: el diseño de la configuración del microscopio. (A) este panel muestra un diagrama de la configuración. M = espejo, DBS = divisor de haz dicroicos, LCF = filtro de limpieza láser, I = iris, L = lente, AP = placa adaptadora, ZTM = eje z traslacional Monte, de = fibra óptica, OFC = fibra óptica acoplador, CL = lente cilíndrica, TL = lente de tubo, EF = filtros de emisión, Obj = objetivo lente y SM = motor paso a paso. El sistema de corrección de deriva de z mueve el motor paso a paso en la punta de la lente del objetivo a la posición contraria de la deriva de z, que se calcula por la señal de infrarrojos (IR) generado por su propio LED y detectado por un detector. (B) este panel muestra la Asamblea de excitación láser. Cuatro láseres se combinan a través de espejos y divisores de haz dicroicos y luego se dirección a una fibra óptica a través de una lente de enfoque y una placa de adaptador sentado en un monte de traslación (parte inferior de la imagen). (C) este panel muestra la modulación del laser. Dos cables de bayoneta Neill-Concelman (BNC) están conectados a cada uno de lo láser (la cabeza o el regulador, dependiendo del fabricante) para TTL y modulación analógica (panel izquierdo). Cables BNC se combinan en un solo cable (panel central) que está conectado a una tarjeta de adquisición de datos en una estación de trabajo (panel de la derecha) para el control de la computadora. (D) este panel muestra el espejo y el divisor de viga dicroico monta. (E) construcción de un acoplador de la fibra en un sistema de jaula. Una placa de adaptador de fibra (AP) se monta en un soporte de traducción del eje z (ZTM) por lo que su distancia a la lente doble acromática (L1, vista lateral se muestra) puede ser modulada. AP y ZTM tienen coincidencia de hilos, igual que la L1 y la placa de la jaula. Funa pareja de iris (rodea) se instalará durante el procedimiento de alineación para los lasers múltiples. Se utilizan para asegurarse de que el láser 647 (panel izquierdo) y 561 nm láser (panel derecho) pasan por el mismo camino. Muestra (G) un parte parcial de la vía de emisión. Fuera del cuerpo del microscopio, la rueda de filtros de emisión, el separador de la emisión y la cámara EMCCD se instalan en orden. (H) este panel muestra el brazo de iluminación. El objetivo de mag se inserta en el brazo de iluminación. Los rayos láser de excitación son enviados al brazo de iluminación a través de la fibra óptica y fibra óptica acoplador (en el lado derecho de la imagen). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la lente mag. (A) este panel muestra las proyecciones de orthographic del titular de los lentes de vivienda para ampliación de rayos láser (unidad: mm). Este diseño está pensado para estar en forma en el brazo de iluminación. (B) este panel muestra un dibujo interno del agujero en el soporte donde Obtén dos lentes. L1 es una lente cóncava y L2 es una lente convexa, y la distancia entre ellos es la suma de sus distancias focales. (C) esta es una foto de la lente de mag. (D) la lente mag puede ser insertada en el brazo de iluminación para ampliar o enfocar los rayos de láser (izquierdos) o puede quitarse para evitar que los rayos láser no cambios (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: los lentes 3-d. (A) este panel muestra las proyecciones de orthographic del titular con un agujero circular en blanco para el modo de derivación y un orificio rectangular para la celebración de la lente cilíndrica (unidad: mm). Este diseño está pensado para estar en forma para el deslizador de analizador DIC en un cuerpo de microscopio. (B) esta es una foto de la lente 3D. (C) el cilíndrico de la lente puede comprometerse en el camino del haz de emisión causa PSFs con astigmatismo (izquierdo) o puede ser desenganchada para el modo de bypass, manteniendo el PSFs intacto (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: alineación de varios canales del separador emisión. Esquemas de la óptica y la trayectoria de la luz aparecen en el separador de emisión con (A) un cubo de bypass, (B) un cubo de calibración y (C) un triple cubo. M = espejo. El cubo de derivación tiene un espejo interior (M5) y se supone para ser utilizado con un filtro de emisión (fe) en la rueda de filtros de barrera. El cubo de calibración tiene divisores de viga (BS) que permiten luces pasar por todos los canales. El cubo triple tiene dos divisores de haz dicroicos (DBS), así como de tres filtros de emisión. (D) estas son las fotos de los tres cubos. (E) el interior del separador de emisión se muestra sin un cubo (panel superior) y con un cubo (panel inferior) en. M3 está detrás de M4 y no capturado en la foto. Perillas de control para los espejos están en la parte superior del separador de emisión (panel superior). (F) este panel muestra la alineación de canales usando el cubo de calibración bajo DIC. (G) este panel muestra un alineamiento fino de la verde (panel superior) y rojo (panel central) canales utilizando granos multicanales 100 nm y un cubo triple. Una imagen combinada de los dos canales también se muestra (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: adquisición de imágenes de SR representante. Estos paneles muestran una imagen DIC representativa (A) abajo, (B) en o (C) por encima del plano central de las células. (D) este panel muestra un ejemplo del PSF de parpadear en fluoróforos. El círculo naranja rodea una PSF "vertical". El círculo verde rodea una PSF "horizontal". El círculo azul rodea una PSF con forma de diamante, que representa los fluoróforos en un plano enfocado. (E) este panel muestra que un representante reconstruido a imagen del SR. Un pequeño ARN regulador es marcado con fluorescencia en situ hibridación con colorante rojo. Las fronteras blancas marcan los bordes de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: un código de adquisición de datos programados para la proyección de imagen SR. En este módulo programable de adquisición, varios comandos de ejecución y las funciones de control de microscopio aparecen en el panel izquierdo y se pueden seleccionar para crear código de adquisición programados. Los comandos se ejecutan secuencialmente de arriba a abajo. Esta captura de pantalla muestra un ejemplo donde un predefinido que determinado número de adquisiciones de imágenes iteradas se llevan a cabo hasta que la adquisición se plantea y se calcula el número de puntos en los tres marcos de imagen secuencial. Si el número promedio de estos lugares está por encima del umbral (definido como el 50% del número de células en los imágenes bacteriana), la adquisición de la imagen continúa en el mismo bucle. Si por debajo del umbral, la adquisición de la imagen continúa en el siguiente bucle donde se utiliza el mayor poder de láser violeta (corte en la parte inferior de la pantalla). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: imágenes de representante de epi-fluorescencia. (A) este panel muestra un pequeño ARN regulador en células de e. coli . (B) este panel muestra un mRNA en células de mamífero U2OS. RNAs están marcados con colorante rojo y colorante azul a través de la hibridación en situ de la fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: ejemplo de proyección de imagen de smFRET. (A) muestras se excitaron con el láser 561. (B) las emisiones de los tintes de verdes y rojos se recogen simultáneamente y se muestra como verde (derecha) y rojo (izquierda) puntos, respectivamente. (C) este panel muestra el representante fluorescencia intensidad vs trayectorias de tiempo de colorante verde (verde) y del tinte rojo (rojo) de una molécula. (D) este panel muestra el traste eficiencia vs calcula la trayectoria de tiempo (línea azul sólida) comoaceptador/ (yodonante +aceptor) de una molécula de la muestra. El rastro de traste está equipado con el modelo oculto de Markov (línea roja discontinua). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este sistema de microscopio híbrido elimina la necesidad de comprar varios microscopios. El costo total para todas las partes, incluyendo la tabla óptica, mano de obra de instalación tabla, software y estación de trabajo, es aproximadamente $230.000. Piezas mecanizadas de costumbre, incluyendo la lente de mag y lentes 3-d, cuestan alrededor de $700 (el costo depende de las cargas reales en diversos institutos). Típicos disponibles en el mercado sistemas integran para microscopia de SR basados en la detección de una sola molécula cuesta más de $300.000 ~ 400.000 y no fácilmente disponible para la medición de smFRET, o epi-proyección de imagen para un campo de visión razonable, sin luz blanca fuente. Así, el enfoque presentado aquí puede alcanzar capacidades de proyección de imagen equivalentes a múltiples microscopios a un costo significativamente reducido.
Este sistema de microscopio modulada puede basarse en organismos de microscopio de distintos fabricantes. La lente 3D potencialmente puede instalarse en cualquier posición en la trayectoria de la emisión, incluyendo dentro el separador de la emisión, dentro del cuerpo del microscopio, o en el espacio disponible entre la rueda de filtros y el portaobjetivos. Sin embargo, la ubicación física de la lente 3D determinará su longitud focal para lograr el mejor efecto del astigmatismo para imágenes de SR 3D. Le recomendamos comenzar con una longitud focal de 10 m. El objetivo de mag es esencialmente un expansor de haz instalado en la ruta de la excitación. Si los láseres de excitación son aire (es decir., sin fibra óptica), que es trivial para instalar tal un expansor en cualquier punto después de los rayos láser son colimados. Si los láseres de excitación son fibra-juntado, entonces buscar ranuras adicionales instalar dos lentes (una cóncava y otra convexa). Por ejemplo, muchos brazos de iluminación comercial tienen ranuras para los filtros de densidad neutra. Encontrar dos lentes con la suma de sus distancias focales igual a la distancia entre las dos ranuras. Entonces, puede ser insertados para que funcione como un lente de mag. Alternativomente, un soporte para el regulador de diafragma de campo puede ser otro lugar, si está disponible. Construcción de la lente de mag en un casete removible tiene la ventaja adicional de que permite enfocar los láseres de excitación para conseguir más potencia, que puede ser necesario para la proyección de imagen de SR, simplemente poniendo la orientación de la lente de la mag.
En este informe, hemos demostrado de conmutación flexible entre tres técnicas diferentes de imagen utilizando un microscopio modulado. Esta configuración puede utilizarse para aplicaciones más amplias y más avanzados. Por ejemplo, la configuración de SR puede ser utilizada para solo-partícula, en células vivas, en foto-conmutable o photoactivatable fluorescente etiquetado proteínas biomoléculas de interesan18,19. La configuración smFRET puede utilizarse para el estudio de las interacciones moleculares en vivo sistemas20. La detección de varios canales basados en divisor de emisión puede combinarse con la configuración de SR para realizar imágenes de SR o solo-partícula simultáneamente seguimiento21dos colores.
Esta configuración puede ampliarse aún más para permitir más modulados componentes. Por ejemplo, otra capa de compartimento de filtro de la torreta y la iluminación se puede Agregar, por lo que pueden crear caminos de excitación/emisión adicional para canales adicionales, como uno con un láser infrarrojo (IR) para muestras con tintes de IR la proyección de imagen. Además de permitir el agregado canal imagen, láseres IR pueden utilizarse para corregir la deriva de fase en proyección de imagen de SR durante la adquisición de imágenes o durante el análisis del post. Para corrección de deriva durante la adquisición de imágenes, si el sistema de corrección de deriva de z no está disponible del fabricante del microscopio, un sistema alternativo con láser IR puede ser ambos de homebuilt14 o adquiridas de terceras empresas. Para la corrección de la deriva después de la adquisición, un laser del IR se puede utilizar para el seguimiento de marcadores de referencia. 22
Sola molécula basada en la detección de la microscopía de SR requiere dos juegos de software, uno para la adquisición de datos y otro para análisis de datos. Para adquisición de datos, incluso un software de construcción propia sencilla que toma imágenes a través de la cámara mientras se controla ON el láser/OFF comportamientos puede trabajar para generar imágenes de SR, mientras que es posible regular manualmente la potencia del láser de 405 nm, por ejemplo, girando un filtro de densidad neutra degradado instalado delante del láser. Sin embargo, esta manera de llevar a cabo el experimento depende el juicio subjetivo del experimentador de la densidad de parpadear en puntos. Así, de esta manera no es objetiva y puede no ser adecuada para ser utilizado para la cuantificación de SR datos de imagen. El código de adquisición de datos utilizado aquí incluye detección de punto y un algoritmo de cómputo mientras la adquisición de datos, permitiendo la modulación automática de la potencia del láser de 405 nm basada en la densidad de parpadear en puntos (figura 6). En la actualidad, algunos fabricantes del microscopio proporcionan módulos programables de proyección de imagen, así que uno puede utilizar estos o buscar plugins de fuentes abiertas como gestor de Micro. Para el análisis de datos, es posible utilizar módulos de análisis disponibles en el mercado de los fabricantes del microscopio o buscar plugins de fuentes abiertas como el ImageJ.
En Resumen, el montaje que presentamos proporciona gran versatilidad y fácil cambiar entre el espacio y diferentes configuraciones de imagen a un costo reducido. Esta configuración es relativamente fácil de adoptar por cualquier laboratorio de investigación en ciencias biológicas con la necesidad de rutina y diversos experimentos de proyección de imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
J.F. reconoce apoyo del programa de eruditos de Searle y Premio innovador del Director de los NIH. Los autores reconocen sugerencias útiles del laboratorio de Paul Selvin (Universidad de Illinois, Urbana-Champaign) para el posicionamiento de la lente 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
