Summary
Vi presenterar en i vivo två-photon imaging protokoll för imaging hjärnbarken av neonatala möss. Denna metod är lämplig för att analysera utvecklingsmässiga dynamiken i kortikala neuroner, de molekylära mekanismer som styr den neuronala dynamiken, och förändringar i neuronala dynamics i sjukdomsmodeller.
Abstract
Två-foton bildbehandling är ett kraftfullt verktyg för i vivo analys av neuronala kretsar i hjärnan hos däggdjur. Dock finns ett begränsat antal i vivo imaging metoder för att undersöka hjärnvävnad av levande nyfödda däggdjur. Detta dokument sammanfattar vi ett protokoll för imaging enskilda kortikala nervceller i levande neonatala möss. Detta protokoll innehåller följande två metoder: (1) Supernova system för glesa och ljusa märkning av kortikala nervceller i hjärnans utveckling och (2) ett kirurgiskt ingrepp för bräckliga neonatal skallen. Detta protokoll tillåter observation av tidsmässiga förändringar av enskilda kortikala neuriter under neonatal stadier med högt signal-brus-förhållande. Märkt cell-specifik nedtystning och knockout kan också uppnås genom att kombinera supernovan med RNA-interferens och CRISPR/Cas9 gen redigering system. Detta protokoll kan således användas för att analysera utvecklingsmässiga dynamiken i kortikala neuroner, molekylära mekanismer som styr neuronala dynamics, och förändringar i neuronala dynamik i sjukdomsmodeller.
Introduction
Den exakta ledningar av neuronala kretsar i hjärnbarken är viktigt för högre hjärnfunktioner inklusive perception, kognition, och inlärning och minne. Kortikala kretsar förädlas dynamiskt under postnatal utveckling. Studier har undersökt processen av kortikala krets bildas med histologiska och in vitro- kultur analyser. Dynamiken i krets formation i levande däggdjur har förblev dock mestadels outforskade.
Två-foton mikroskopi har använts för de i vivo analyserna av neuronala kretsar i vuxen mus hjärnan1,2. Dock har endast ett begränsat antal studier på grund av tekniska utmaningar adresserat neuronala krets bildandet i nyfödda möss. Till exempel utförde Carrillo et al. time-lapse bildtagning av klättring fibrer i lillhjärnan i andra postnatala vecka3. Portera-Cailliau et al. rapporterade bildtagning av axoner i kortikala skikt 1 i den första postnatal vecka4. I den aktuella studien sammanfattar vi ett protokoll för observationen av layer 4 kortikala nervceller och deras dendriter i nyfödda möss. Resultat som erhålls genom tillämpning av detta protokoll, som omfattar två metoder, redovisas i vår senaste publikation5. Först använder vi Supernova vector systemet5,6 för märkning enskilda nervceller i neonatal hjärnan. I Supernova systemet, fluorescerande proteinerna används för neuronal märkning är utbytbara och märkta-specifika genen knockdown och redigering/knockout analyser är också möjliga. Det andra beskriver vi ett kirurgiskt ingrepp för kraniala fönster beredning i bräckliga neonatala möss. Tillsammans kan dessa metoder i vivo observation av enskilda nervceller i neonatal hjärnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment skall utföras enligt de riktlinjer för djurskydd som ordinerats av de experimenter's institution.
1. beredning av Pups för avbildning
Obs: Valpar med glest märkt kortikala nervceller kan erhållas av Utero elektroporation (IUE) Supernova vektorer5,6. Supernova systemet består av följande två vektorer: TRE-Cre och CAG-loxP-STOP-loxP-Gen X-ires-tTA-WPRE. I detta system åberopat glesa märkning TRE läckage. I en gles befolkning på transfekterade nervceller driver TRE svaga uttryck för Cre och tTA. Därefter endast i dessa celler underlättas uttrycket av genen X av en positiv feedback av tTA-TRE cykler. Uppnådda glesa och ljusa märkning möjliggör visualisering av morfologiska Detaljer för enskilda nervceller i vivo. IUE förfarandet beskrivs inte i detta protokoll eftersom de har varit beskrivs någon annanstans7,8,9,10,11.
- Förbereda timed-dräktiga möss för IUE.
- Bered en DNA för IUE. För glesa märkning med RFP, använda en lösning som innehåller pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) och pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) eller en lösning som innehåller pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) och pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
Obs: Olika proteiner kan uttryckas i märkta nervceller använder olika kombinationer av vektorer. Dessutom olika gener kan bankat-ned eller knackade ut specifikt i märkta celler5,6 (t.ex., en serie av vektorer för Supernova system är tillgängliga från RIKEN BioResource Research Center och Addgene). - Utför regelbunden IUE7,8,9,10,11 etikett kortikala nervceller. För märkning av lager 4 nervceller, använda embryonala dag-14 embryon.
- Vänta på pup leverans och tillväxt.
2. kirurgi
- Söva postnatal dag-5 (P5) pup med isofluran gas (1,0%). Utför en svans-nypa test för att kontrollera graden av anestesi. Om pup svarar på nypa, öka isofluran koncentrationen (upp till 2,0%) eller vänta tills svaret försvinner. Upprätthålla den pup kroppstemperatur under operation med en värmedyna.
- Subkutant injicera ett analgetikum (karprofen, 5 mg/kg).
- Sterilisera den pup huden som täcker skallen genom att torka det med 70% etanol tre gånger.
- Ta bort ca 20 mm2 av huden som täcker skallen med sax steriliseras med 70% etanol (figur 1A).
- Ta bort fascian i skallen med steriliserad pincett och en ren, steril bomullspinne (figur 1A).
- Applicera adhesiv i vävnad med hjälp av lastning tips på anskäras hudytan för att stoppa blödningen. Gäller inte vävnad lim till området imaging (figur 1B) eftersom detta försvårar öppnandet av skallen.
- Placera pup på en värmedyna (37 ° C) och tillåta det att återhämta sig från anestesi. Vänta tills vävnaden limmet har torkat och stelnat (ca 30 min).
- Om det behövs, applicera mer vävnad adhesiv och vänta på att torka och stelna.
3. kraniala fönster förberedelse
- Söva den pup med isofluran (1,0% - 2,0%) och kontrollera nivån anestesi genom en svans-nypa testet.
- Öppna försiktigt skallen med en steriliserad rakblad lämnar dura intakt (1 mm i diameter) (figur 1 c). Använda en gelatinsvamp (skärs i små bitar, cirka < 2 mm3, använda steriliserade sax, och tillämpa dem med pincett) indränkt i cortex buffert12 (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glukos, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 , 2 mmol/l MgSO4; pH 7,4; 300 mOsm/L; rumstemperatur) att stoppa blödningen. När du öppnar skallen, tillämpa en cortex buffert för att hålla hjärnan ytan fuktig.
- Ta bort eventuella buffert och blod från dural ytan med hjälp av en gelatinsvamp. Applicera ett tunt lager av 1,0% låg--smältpunkt agaros (upplöst i cortex buffert) med gula tips. Använder en värme block maskin, bibehålla temperaturen av agaros lösningen vid 42° C till ansökan.
Obs: Tömningen av buffert och blod måste utföras från sidan av den kraniotomi samtidigt se torr gelatinsvampen inte komma i kontakt med dura. Underlåtenhet att göra detta kan skada dura. - Applicera en runda täckglas (nr 1, 3 mm i diameter) på lagrets agaros gel. Ta bort alla bubblor mellan täckglaset och agaros gel lagret genom att hälla ett överskott av agarosgel dem emellan. Ta bort överflödigt gelen utskjutande från under den täckglas använder pincett (figur 1 d och 1E).
- Säkra den täckglas med dentala cement (figur 1F).
- Blanda cement pulvret och vätskan cement. Applicera blandningen med gula tips innan det blir stelnat. Gäller inte dentala cement på dura, eftersom detta kan skada hjärnan.
- Bifoga en steril titanium bar (skräddarsydd, cirka 30 mg, se figur 1 g) med kraniella ben med dentala cement. Justera Titan baren och täckglaset (på ytan av dura) parallellt med enkelt fånga bilder.
- Täcka exponerade skallen med dentala cement (figur 1 H).
- Återställa pup från anestesi. Hålla det på en värmare (37 ° C) tills den dentala cementen har stelnat (1 h).
4. två-photon Imaging
Obs: Bilderna i vivo i figur 2 förvärvades med två-foton Mikroskop med Titan-sapphire laser (beam diameter [1/e2]2: 1,2 mm).
- Ange två-photon laser våglängd. För RFP magnetisering, Använd 1.000 nm (450 mW/mm2 vid 400 µm av djup).
Obs: Laser kraften minskas eftersom de z-positionen flyttas upp. - Torka av täckglaset med 70% etanol.
- Söva den pup med isofluran (1,5% - 2,0%) och kontrollera nivån anestesi med en svans-nypa testet.
- Bifoga pup till titanium plattan på imaging scenen med en Titan bar på pup's huvud (figur 2A och 2B). Justera huvudet så att täckglaset är parallell med den objektiv med goniometer scenen (figur 2B). Upprätthålla kroppstemperaturen hos den pup med en värmedyna (37 ° C).
- Ange isofluran koncentrationen till 0,7% - 1,0%.
Obs: En mycket hög isofluran koncentration kan orsaka dödsfall av pup under imaging. - Placera imaging scenen under objektivet (20 X, NA 1.0) av två-foton Mikroskop (figur 2B och 2 C).
- Applicera en droppe vatten på täckglaset. Använd påljusfluorescens för att lokalisera de fluorescerande protein-märkt nervcellerna i området där dura har utsatts.
- Förvärva z-stack bilder 1,4 µm mellanrum. För lager inställd 4 neuron imaging, z-bredden på 150-300 µm till bild hela dendritiska morfologi (figur 2D och 2E). Användning långsam skanning och genomsnitt för att få tydliga bilder visar den neuronala morfologin (det tar vanligtvis > 20 min att förvärva hela dendritiska morfologi).
Obs: Följande parametrar rekommenderas för avbildning. Magnetiseringen våglängd: 1000 nm, scanner: galvanometer typ, dichroic spegel: 690 nm, emission filter: 575-620 nm bandpass, detektor: GaAsP typ, få inställning > 100, bild storlek > 512 x 512 µm, synfält > 600 x 600 µm, pixel upplösning < 1,2 µm.
5. återhämtning och omvårdnad
- Lossa pup från imaging scenen.
- Placera pup på en värmare (37 ° C) och gör det möjligt att återställa (15 min).
- Foder pup varm mjölk med hjälp av en mikropipett 2-h mellanrum och försiktigt stimulera magen för att tillåta utsöndring. Bekräfta att pup är dricka mjölk genom att mäta dess kroppsvikt.
6. avbildning ny
- Söva pup med isofluran (1,5% - 2,0%), och kontrollera nivån anestesi med en svans-nypa testet. Bifoga det till imaging scenen.
- Leta upp de tidigare avbildade nervcellerna och förvärva en z-stack bild. Identifiering av nervceller är lätt på grund av sin sparse märkning med Supernova.
- Upprepa steg 5.1-6,2 tills imaging är klar. Obs: Pup kan avbildas upp till 18 h utan att förlora vikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siffror 2D - 2F Visa representativa resultat för två-photon time-lapse imaging av layer 4 kortikala nervceller använder detta protokoll. För analysändamål, Välj nervceller med tydlig dendritiska morfologi i hela imaging perioderna. Vi analyserade dendritiska morfologi av avbildad nervceller med morfologisk analysprogramvara. Representativa dendritiska morfologi återuppbyggnad visas i figur 2F. Nervceller som visar frånkopplad dendriter (figur 2 g) bör undantas från analyser, eftersom frånkopplad dendriter ange celldöd som orsakas av skador under kirurgi eller imaging. Dessutom bör nervceller med suddiga dendritiska tips uteslutna (t.ex., neuron med pilspetsen i figur 2D).
Figur 1: kirurgi, kraniala fönster förberedelse och fastsättning av den Titan-baren (A) denna panel visar avlägsnande av huden som täcker skallen. (B) denna panel visar fixering av klyftan mellan huden och skallen. Var noga med att inte applicera obligationen till området imaging. (C) Detta är en bild av exponerade dura. Ett rakblad sattes in mellan skallen och dura och skallen var fladdrade öppen till vänster om det utsatta området (pilspets). Benet kan sedan lätt tas bort med pincett. (D) Detta är en schematisk design visar en vertikal bild av kraniala fönstret. Klyftan mellan täckglaset och dura är fylld med ett tunt lager av agarosgel. Täckglaset fixeras till skallen med dentala cement. (E) A runda täckglas placeras i agaros gel lager. (F) Detta är en bild av det säkrade täckglaset. (G), denna panel visar utformningen av Titan baren. Titanium baren innehåller två skruvhål för fastsättning på imaging scenen (se figur 2) och en platt rektangulär del som är kopplad till pup's huvud. (H), den rektangulära delen av Titan bar bifogas pup's skalle med dentala cement. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: In vivo två-photon avbildning av kortikala nervceller hos neonatala möss. (A) denna panel visar utformningen av titanium plattan. Titanium plattan har två skruvhål för att fästa Titan baren och fyra skruvhål för fastsättning goniometer scenen, som placeras på imaging scenen. 2,5 mm (i diameter) x 2 mm (längd) skruvar används för fixering. (B) Detta är en representativ bild av den pup bifogas imaging scenen. Pup's kroppstemperatur upprätthålls med hjälp av ett värmeelement. (C) pup är bedövas med isofluran under den i vivo imaging förfarande. (D), denna panel visar en representativ Z-stack time-lapse bild av lager 4 kortikala nervceller i en P5 pup. Pilspetsen visar neuron med suddiga dendriter, som bör tas bort från analysen. (E), denna panel visar högre förstoring time-lapse bilder av neuron med pilar i panelen D. Blå pilspetsar: dendritiska tips som är indragen i 4,5 h, gula pilspetsar: dendritiska tips som är avlånga i 4,5 h, små vita pilspetsar: axon i en angränsande cell. (F) Detta är en 3D-modell av dendritiska tracen av neuron i vänstra figuren av panelen E. Blå cirklar anger position cellkroppen. (G) i denna panel visas representativa nervceller med frånkopplad dendriter, som inte ingår i analysen. Exempeldata i paneler D - G innehåller NR1 (en grundläggande subenhet av NMDA-typ glutamat receptor) - utslagen - nervceller (på grund av begränsade data tillgängliga från författarna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet och felsökning:
Det mest kritiska steget i protokollet är avlägsnande av skallen (protokoll steg 3,2). Vid införande följer rakbladet ofta dura, orsakar dural blödningar och skador på hjärnan. Detta kan undvikas genom att tillsätta en droppe av cortex buffert på skallen och ta bort skallen i cortex buffert.
Blödning från dura och huden efter kraniala fönster förberedelse leder till ocklusion av fönstret. För att undvika detta, vävnaden självhäftande och dentala cement används bör tillåtas att helt torr innan du fortsätter till nästa steg. Flera valpar med en kranial fönster bör förberedas eftersom det är svårt att helt undvika blödning. I allmänhet, om fönstret kraniala förblir tydlig och stabil för 2-3 h efter operationen, kan pup användas för time-lapse avbildning.
Betydelsen av metoden avseende befintliga/alternativa metoder:
Här har vi beskrivit en metod för in-vivo två-photon imaging av neonatal cortex. Detta protokoll har flera fördelar jämfört med tidigare rapporterade metoder. Dessa är listade enligt följande.
(1) kortikala nervceller kan vara glest och ljust märkt av transfecting Supernova vektorer med IUE. IUE har använts för märkning av kortikala nervceller under utveckla stadier. En enkel IUE är dock olämpliga för bildtagning av enskilda nervceller eftersom nervceller kan märkas alltför tätt7,8,9,10. Dessutom kan använder Supernova systemet, olika typer av fluorescerande proteiner användas för märkning glesa populationer av nervceller. Exempelvis använder Supernova-medierad glesa märkning av en genetiskt kodade kalcium indikator GCaMP13,14, vi har nyligen utfört en funktionell analys av enskilda nervceller i utvecklingsländer cortex lager 4 (P3 till P13) 15.
(2) den metod som beskrivs i denna studie är lämplig för att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom neuronala krets utveckling. Supernova systemet tillåter glest märkt cell-specifika knockout av någon gen. Således, dynamiken i ett neuron som innehåller en specifik gen störning kan observeras. För detta ändamål rapporterats genetik-baserade system såsom MADM16 och SLICK17 tidigare. Emellertid, eftersom uppfödning av mus linjer är avgörande för dessa system, de kräver mycket tid och kostnad än det protokoll som beskrivs här.
(3) denna studie använder tredjeparts ett rakblad för skallen borttagning. Detta minimerar blödning från dura och öppnandet av ett stort område av skallen (< 2 mm i diameter). Med den här proceduren, var det möjligt att observera spontan aktivitet layer 4 nervceller i området hela stora fat inom somatosensoriska cortex15.
Begränsningar av metoden:
En nackdel i vivo Imaging av mus neonatal hjärnan, jämfört med avbildning av genomskinliga djur såsom zebrafisk larver och Xenopus grodyngel, är den lägre rumsliga och temporal upplösningen. Långsam skanning och genomsnitt bör utföras för framställning av tydliga bilder av neuronala morfologi eftersom mer ljusspridning förekommer i mus hjärnan. Ljusspridning kan möjligen minskas med en längre våglängd laser för fluorescerande protein excitation och proteiner med längre fluorescens utsläpp våglängder.
En annan begränsning i detta protokoll skulle kunna vara att operationen för kraniala fönster implantation kan påverka bildandet av en normal kortikala krets på grund av hjärnan inflammation12. Dock finns det en hög sannolikhet att i vivo imaging är mer fysiologiska jämfört med in vitro- imaging såsom time-lapse avbildning av hjärnan slice preparatet, som också bör ge upphov till allvarlig inflammation av ischemi och skivning. Det har också rapporterats att upprepad exponering för isofluran kan påverka flera neuronala processer18. Kontroll experiment ska utföras för att verifiera lämpligheten av resultaten av i vivo imaging. När det gäller vår avbildning av layer 4 nervceller i somatosensoriska cortex bekräftat vi en normal ökning dendritiska Totallängd och förvärvet av orientering bias av dendritiska projektioner av taggiga stjärnformade nervceller5,20.
Nyligen genomförda studier rapporterade > 1 - mm-djup imaging i en vuxen mus hjärna vari dura togs bort under operation19. Däremot, har vi kunnat rapport upp till 400-µm-djup imaging i nyfödda5. Eftersom dura kan inte tas bort hos nyfödda och detta i sin tur leder till en hög ljusspridning, anser vi att deep imaging hos nyfödda är mer utmanande än hos vuxna. Framtida förbättring i fluorescerande sonder, lasrar och detektorer bör tillåta deep imaging i neonatal hjärnor.
Vi hittills har rapporterat 18-timmars time-lapse imaging använder den förevarande protokoll5. Vi har nyligen lyckats 72-timmars time-lapse imaging genom att förbättra de protokoll20. Vi kommer att fortsätta att förfina protokollet presenteras här (t.ex., långsiktiga, högre tid eller rumslig upplösning imaging) för att avslöja dynamiska mekanismer av neuronala krets utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar T. Sato, M. Kanbayashi och S. Kouyama för deras tekniskt bistånd. Detta arbete var stöds av JSPS KAKENHI Grant nummer JP15K14322 och JP16H06143, Takeda vetenskapsstiftelsen, Stiftelsen Uehara Memorial och den Collaborative Research Project av Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M.) och KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, och JP15H04263 och Grant-i vetenskaplig forskning på områden som Innovation ”dynamisk reglering av hjärnans funktion av skrot & Build System” (JP16H06459) från MEXT (TI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
