Summary
Presentiamo un in vivo imaging protocol per la corteccia cerebrale di topi neonatali di imaging due fotoni. Questo metodo è adatto per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, i meccanismi molecolari che controllano le dinamiche neuronali e i cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.
Abstract
Imaging del due-fotone è un potente strumento per l'analisi in vivo di circuiti neuronali nel cervello dei mammiferi. Tuttavia, un numero limitato di metodi di imaging in vivo esiste per l'esame del tessuto di cervello di mammiferi neonati dal vivo. Qui riassumiamo un protocollo per l'imaging di singoli neuroni corticali in topi neonatali vivente. Questo protocollo comprende le seguenti due metodologie: (1) il sistema di Supernova per radi e luminosi etichettatura dei neuroni corticali nel cervello in via di sviluppo e (2) una procedura chirurgica per il fragile cranio neonatale. Questo protocollo permette l'osservazione dei cambiamenti temporali dei singoli neurites corticali durante fasi neonatale con un elevato rapporto segnale-rumore. Con etichetta cellula-specifico del silenziamento genico e knockout può essere ottenute anche combinando la Supernova con gene CRISPR/Cas9 sistemi di editing e di interferenza del RNA. Questo protocollo può, quindi, essere utilizzato per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, meccanismi molecolari che controllano la dinamica neuronale e cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.
Introduction
Il cablaggio preciso di circuiti neuronali nella corteccia cerebrale è essenziale per le funzioni cerebrali superiori tra cui percezione, cognizione e apprendimento e memoria. Circuiti corticali sono dinamicamente raffinati durante lo sviluppo postnatale. Studi hanno studiato il processo di utilizzo di circuito corticale formazione istologica e analisi di coltura in vitro . Tuttavia, le dinamiche di formazione del circuito in mammiferi viventi sono rimasta per lo più inesplorata.
Microscopia del due-fotone è stato ampiamente utilizzata per le analisi in vivo di circuiti neuronali al cervello di topo adulto1,2. Tuttavia, a causa di problemi tecnici, solo un limitato numero di studi hanno affrontato la formazione di circuiti neuronali in topi neonati. Ad esempio, Carrillo et al. eseguita l'imaging time-lapse di arrampicata fibre nel cervelletto in seconda settimana postnatale3. Portera-Cailliau et al ha segnalato l'imaging degli assoni in strato corticale 1 nel primo postnatale settimana4. Nello studio presente, riassumiamo un protocollo per l'osservazione dei neuroni corticali di livello 4 e loro dendriti in topi neonati. Risultati ottenuti dall'applicazione del presente protocollo, che comprende due metodologie, sono riportati nella nostra recente pubblicazione5. In primo luogo, utilizziamo la Supernova vettore sistema5,6 per le etichette dei singoli neuroni nel cervello neonatale. Nel sistema Supernova, le proteine fluorescenti utilizzate per l'etichettatura di un neurone sono atterramento intercambiabili e con etichetta gene cellula-specifico e analisi di modifica/eliminazione diretta sono anche possibili. In secondo luogo, descriviamo una procedura chirurgica per la preparazione di finestra cranica in topi neonatali fragili. Insieme, queste metodologie consentono l'osservazione in vivo di singoli neuroni nel cervello neonatale.
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Protocol
Gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità delle direttive sul benessere degli animali prescritte dall'istituzione dello sperimentatore.
1. preparazione dei cuccioli per l'Imaging
Nota: Cuccioli con scarsamente etichettati neuroni corticali ottenibili mediante elettroporazione in utero (IUE) di Supernova vettori5,6. Il sistema di Supernova consiste di seguenti due vettori: TRE-Cre e CAG-loxP-STOP-loxP-Gene X-ires-tTA-WPRE. In questo sistema, etichettatura sparse si basa sulla perdita TRE. In una scarsa densità di popolazione di neuroni trasfettati, TRE unità l'espressione debole della Cre e tTA. Successivamente, solo in queste cellule, l'espressione del gene X è facilitata da un feedback positivo dei cicli tTA-TRE. Il raggiunto etichettatura radi e luminoso permette la visualizzazione dei dettagli morfologici di singoli neuroni in vivo. Dettagli della procedura IUE non descritti nel presente protocollo in quanto sono stati descritti altrove7,8,9,10,11.
- Prepararsi a tempo-incinta topi IUE.
- Preparare una soluzione di DNA per IUE. Per l'etichettatura di tipo sparse con RFP, utilizzare una soluzione contenente pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l) o una soluzione contenente pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l).
Nota: Varie proteine possono essere espresso nei neuroni con etichettati utilizzando diverse combinazioni di vettori. Inoltre, vari geni possono essere abbattuto o eliminato specificamente in cellule con etichetta5,6 (ad esempio, una serie di vettori per il sistema di Supernova sono disponibili da RIKEN BioResource Research Center e da Addgene). - Eseguire regolari IUE7,8,9,10,11 per etichettare i neuroni corticali. Per l'etichettatura dei neuroni di strato 4, utilizzare embrionali giorno-14 embrioni.
- Attesa per la consegna del cucciolo e crescita.
2. chirurgia
- Anestetizzare il postnatale giorno-5 (P5) pup utilizzando gas isoflurano (1,0%). Eseguire un test di coda-pizzico per controllare il livello dell'anestesia. Se il cucciolo risponde per il pizzico, aumentare la concentrazione di isoflurane (fino a 2,0%) o attendere la risposta scomparirà. Mantenere la temperatura corporea del cucciolo durante la chirurgia usando un termoforo.
- Iniettare per via sottocutanea un analgesico (carprofen, 5 mg/kg).
- Sterilizzare la pelle di pup che copre il cranio strofinando con etanolo al 70% tre volte.
- Rimuovere circa 20 mm2 di pelle che copre il cranio con le forbici sterilizzate con etanolo al 70% (Figura 1A).
- Togliere la mascherina del cranio usando pinze sterili e un batuffolo di cotone pulito e sterile (Figura 1A).
- Applicare l'adesivo del tessuto utilizzando punte di carico alla superficie della pelle incisi per fermare l'emorragia. Non applicare adesivo del tessuto per l'area di imaging (Figura 1B) perché questo rende più difficile l'apertura del cranio.
- Collocare il cucciolo su un rilievo di riscaldamento (37 ° C) e consentirle di recuperare dall'anestesia. Attendere fino a quando l'adesivo del tessuto ha asciugato e solidificato (circa 30 min).
- Se necessario, applicare più tessuto adesivo e attendere che si asciughi e solidificare.
3. cranica finestra preparazione
- Anestetizzare il pup utilizzando isoflurano (1.0-2.0%) e controllare il livello di anestesia di un test di coda-pizzico.
- Aprire con cautela il cranio con una lama di rasoio sterilizzata, lasciando intatta il dura (1 mm di diametro) (Figura 1). Utilizzare una spugna di gelatina (tagliato in piccoli pezzi, circa 2 mm di <3, utilizzando forbici sterilizzate e applicarle con una pinzetta) imbevuto di corteccia tampone12 (125 mmol/L NaCl, KCl di 5 mmol/L, glucosio di 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 e 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) per fermare l'emorragia. Quando si apre il cranio, applicare un buffer di corteccia per mantenere umida la superficie del cervello.
- Rimuovere qualsiasi buffer e sangue dalla superficie dural utilizzando una spugna di gelatina. Applicare un suggerimenti di strato sottile di 1,0% dell'agarosi di basso-punto di fusione (disciolto nel buffer di corteccia) utilizzando giallo. Utilizzando una macchina del blocco di calore, mantenere la temperatura della soluzione di agarosio a 42° C fino al applicazione.
Nota: Il drenaggio del buffer e del sangue deve essere eseguito dal lato del craniotomy pur avendo cura che la spugna di gelatina secca non venga a contatto con la dura madre. In caso contrario si potrebbe danneggiare la dura madre. - Applicare un coprioggetto in vetro rotondo (n. 1, 3 mm di diametro) lo strato di gel di agarosio. Rimuovere tutte le bolle tra il vetrino coprioggetto e lo strato di gel di agarosio versando un eccesso di gel di agarosio tra di loro. Rimuovere il gel in eccesso che fuoriesce da sotto il vetrino coprioggetto usando la pinzetta (Figura 1 e 1E).
- Fissare il vetrino coprioggetto utilizzando cemento dentale (Figura 1F).
- Miscelare la polvere e il liquido di cemento. Applicare la miscela utilizzando punte gialle prima di esso diventa solidificato. Non applicare il cemento dentale sulla dura, perché questo può danneggiare il cervello.
- Allegare una sterile titanio barra (su misura, circa 30 mg, Vedi Figura 1) l'osso cranico utilizzando cemento dentale. Allineare la barra di titanio e il vetrino coprioggetti (sulla superficie del dura) in parallelo per catturare facilmente le immagini.
- Coprire il cranio esposto con cemento dentale (Figura 1 H).
- Recuperare il cucciolo dall'anestesia. Tenerlo su un termosifone (37 ° C) fino a quando il cemento dentale ha solidificato (1 h).
4. due-fotone di Imaging
Nota: Le immagini in vivo nella Figura 2 sono stati acquisiti utilizzando un microscopio a due fotoni con un laser di titanio-zaffiro (fascio di diametro [1/e2]2: 1,2 mm).
- Impostare la lunghezza d'onda laser del due-fotone. Per l'eccitazione del RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 µm di profondità).
Nota: La potenza del laser deve essere ridotti poiché la posizione z sposta verso l'alto. - Pulire la superficie del coprivetrino con etanolo al 70%.
- Anestetizzare il pup utilizzando isoflurano (1.5-2.0%) e verificare il livello di anestesia utilizzando un test di coda-pizzico.
- Fissare il cucciolo alla piastra di titanio sul palco imaging utilizzando una barra di titanio sulla testa di pup (Figura 2A e 2B). Regolare la testa in modo che il vetrino coprioggetto è parallelo alla lente dell'obiettivo utilizzando il palcoscenico di Goniometro (Figura 2B). Mantenere la temperatura corporea del cucciolo utilizzando un termoforo (37 ° C).
- Impostare la concentrazione di isoflurane 0,7% - 1.0%.
Nota: Una concentrazione molto alta isoflurano può causare la morte accidentale del cucciolo durante la formazione immagine. - Posto la tappa imaging sotto la lente dell'obiettivo (20 X, NA 1.0) del due-fotone microscopio (fig. 2B e 2C).
- Applicare una goccia di acqua sul vetrino coprioggetti. Utilizzare epi-fluorescenza per individuare i neuroni con etichetta proteina fluorescenti nella zona dove è stata esposta la dura madre.
- Acquisire immagini dello stack z a intervalli 1.4-µm. Per strato 4 neurone imaging, impostata la z-larghezza 150-300 µm a immagine intera morfologia dendritica (Figura 2D e 2E). L'uso rallentare la scansione e in media per ottenere immagini nitide, mostrando la morfologia neuronale (prende solitamente > 20 min per acquisire l'intera morfologia dentritica).
Nota: I seguenti parametri sono raccomandati per l'imaging. Lunghezza d'onda di eccitazione: 1.000 nm, scanner: tipo di galvanometro, specchio dicroico: 690 nm, filtro di emissione: 575-620 nm passa-banda, rivelatore: tipo GaAsP, ottenere l'impostazione > 100, immagine dimensione > 512 x 512 µm, campo di vista > 600 x 600 µm, pixel risoluzione < 1.2 µm.
5. recupero e professione d'infermiera
- Staccare il cucciolo dalla fase di formazione immagine.
- Collocare il cucciolo su un termosifone (37 ° C) e consentirle di recuperare (15 min).
- Nutrire il cucciolo latte caldo utilizzando una micropipetta a intervalli di 2 h e delicatamente stimolare lo stomaco per consentire l'escrezione. Confermare che il cucciolo sta bevendo latte misurando il peso corporeo.
6. re-imaging
- Anestetizzare il pup con isoflurano (1.5-2.0%) e verificare il livello di anestesia utilizzando un test di coda-pizzico. Allegare alla fase di formazione immagine.
- Individuare i neuroni in precedenza imaged e acquisire un'immagine dello stack z. L'identificazione dei neuroni è facile a causa della loro scarsa etichettatura con Supernova.
- Ripetere i passaggi 5.1-6.2 imaging è completato. Nota: Il cucciolo può essere imaged fino a 18 ore senza perdere peso.
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Representative Results
Figure 2D - 2F Visualizza risultati rappresentativi di due fotoni time-lapse imaging dei neuroni corticali strato 4 utilizzando il presente protocollo. Ai fini dell'analisi, selezionare i neuroni con morfologia chiaro dendritica durante i periodi di formazione immagini. Abbiamo analizzato la morfologia dendritica dei neuroni imaged utilizzando software di analisi morfologica. Ricostruzione di morfologia dentritica rappresentativo è mostrato nella Figura 2F. Neuroni risultati disconnessa dendriti (Figura 2) dovrebbero essere esclusi dall'analisi, poiché disconnesse dendriti indicano morte cellulare indotta da danno durante la chirurgia o l'imaging. Inoltre, i neuroni con punte dendritiche offuscate dovrebbero essere esclusi (ad es., il neurone con la punta della freccia in Figura 2D).
Figura 1: chirurgia, preparazione di finestra cranica e fissaggio della barra di titanio. (A), questo pannello mostra la rimozione della pelle che copre il cranio. (B), questo pannello mostra la fissazione del divario tra la pelle e il cranio. Fare attenzione a non applicare l'adesivo per l'area di imaging. (C) si tratta di un'immagine del dura esposta. Una lama di rasoio è stata inserita tra il cranio e la dura madre, e il cranio era sbatteva aperta a sinistra dell'area esposta (punta di freccia). L'osso quindi può essere facilmente rimosso usando il forcipe. (D) questo è un disegno schematico, mostrando una vista verticale della finestra cranica. Il divario tra il vetro di copertura e la dura madre è riempito con un sottile strato di gel di agarosio. Il coprioggetto è fissato al cranio con un cemento dentale. Vetrino coprioggetti (E), A forma circolare sono posto sullo strato di gel di agarosio. (F) Questa è un'immagine del coprivetrino protetto. (G), questo pannello mostra il disegno della barra di titanio. La barra di titanio contiene due fori per le viti per il fissaggio alla fase di formazione immagine (Vedi Figura 2) e una parte piatta e rettangolare che è fissata alla testa di pup. (H), la parte rettangolare del titanio barra è attaccato al cranio di pup utilizzando cemento dentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: In vivo imaging due fotoni dei neuroni corticali in topi neonatali. (A), questo pannello Visualizza la struttura della placca in titanio. Il piatto di titanio ha due fori per le viti per fissare la barra di titanio e quattro fori per le viti per fissare la fase di goniometro, che è disposto sulla fase di formazione immagine. 2.5 mm (di diametro) x viti 2 mm (in lunghezza) vengono utilizzati per il fissaggio. (B) Questa è un'immagine rappresentativa del cucciolo associata alla fase di formazione immagine. Temperatura corporea del cucciolo viene mantenuta utilizzando un riscaldatore. (C), il cucciolo è anestetizzato usando isoflurane durante l' in vivo imaging procedura. (D), questo pannello mostra un'immagine di time-lapse Z-stack rappresentativa dello strato 4 neuroni corticali di un cucciolo di P5. La punta della freccia indica il neurone con dendriti offuscate, che dovrebbe essere rimossa dall'analisi. (E), questo pannello mostra maggiore ingrandimento immagini time-lapse del neurone con le frecce nel pannello D. Blu punte di freccia: dendritiche suggerimenti che vengono ritratti in sagittarie 4,5 h, giallo: dendritiche suggerimenti che sono allungati in 4,5 h, piccole frecce bianche: assone di una cellula vicina. (F) si tratta di un modello 3D della traccia del neurone nella figura a sinistra del pannello Edendritica. Cerchi blu indicano la posizione del corpo cellulare. (G) questo pannello mostra rappresentativi neuroni con dendriti disconnessi, che non sono inclusi nell'analisi. I dati di esempio in pannelli D - G contengono NR1 (un'essenziale unità secondaria del ricevitore del glutammato di NMDA-tipo) - buttato - neuroni (a causa di dati limitati disponibili da parte degli autori). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Fasi critiche nel protocollo e risoluzione dei problemi:
La fase più critica del protocollo è la rimozione del cranio (passo 3.2 del protocollo). Al momento dell'inserimento, la lama di rasoio spesso aderisce al dura, provocando sanguinamenti dural e danni al cervello. Questo può essere evitato aggiungendo una goccia di tampone di corteccia sul cranio e rimuovendo il cranio nel buffer di corteccia.
Sanguinamento da dura e la pelle dopo preparazione cranica finestra conduce all'occlusione della finestra. Per evitare questo, il tessuto adesivo e dentale cemento usato dovrebbe essere consentito a completamente asciutto prima di procedere al passaggio successivo. Più cuccioli con una finestra cranico dovrebbero essere preparati dal momento che è difficile evitare completamente l'emorragia. In generale, se la finestra cranica rimane chiaro e stabile per la post-chirurgia 2-3 h, il cucciolo può essere utilizzato per l'imaging di time-lapse.
Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/Alternative:
Qui, abbiamo descritto un metodo per in vivo imaging della corteccia neonatale del due-fotone. Questo protocollo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi precedentemente segnalati. Questi sono elencati come segue.
1) corticali neuroni possono essere scarsamente e brillantemente contrassegnati tramite trasfezione di vettori di Supernova utilizzando IUE. IUE è stato ampiamente usato per l'etichettatura dei neuroni corticali durante lo sviluppo di fasi. Tuttavia, un semplice IUE è inadatto per l'imaging di singoli neuroni dal momento che i neuroni possono essere etichettati troppo densamente7,8,9,10. Inoltre, utilizzando il sistema di Supernova, vari tipi di proteine fluorescenti possono essere utilizzati per etichettare sparse popolazioni di neuroni. Ad esempio, usando Supernova-mediata sparse etichettatura di un indicatore di calcio codificato geneticamente GCaMP13,14, abbiamo abbiamo recentemente effettuato un'analisi funzionale dei singoli neuroni nel livello di corteccia in via di sviluppo 4 (P3 a P13) 15.
2) il metodo descritto in questo studio è adatto a chiarire i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo di circuiti neuronali. Il sistema di Supernova permette scarsamente etichettati cellula-specifico knockout di qualsiasi gene. Così, si possono osservare le dinamiche di un neurone contenente una rottura del gene specifico. A tale scopo, sistemi basati su genetica ad esempio MADM16 e chiazza di petrolio17 precedentemente sono stati segnalati. Tuttavia, poiché l'allevamento delle linee del mouse è essenziale per questi sistemi, richiedono molto tempo e costi rispetto al protocollo descritto qui.
3) questo studio utilizza una lama di rasoio per la rimozione del cranio. Questo riduce al minimo il sanguinamento da dura e permette l'apertura di una vasta zona del cranio (< 2 mm di diametro). Utilizzando questa procedura, è stato possibile osservare l'attività spontanea del livello 4 neuroni nella zona intera botte grande all'interno della corteccia somatosensoriale15.
Limitazioni del metodo:
Uno svantaggio dell'imaging in vivo del cervello neonatale del mouse, confrontato con l'imaging di animali trasparenti come larve di zebrafish e girini di Xenopus , è la più bassa risoluzione spaziale e temporale. Lento di scansione e in media devono essere eseguite per producendo immagini chiare della morfologia neuronale poiché la diffusione più luce si verifica nel cervello del topo. Dispersione della luce possibilmente può essere ridotto utilizzando un laser di lunghezza d'onda più lungo per la proteina fluorescente eccitazione e proteine con lunghezze d'onda di emissione di fluorescenza.
Un'altra limitazione del presente protocollo potrebbe essere che l'intervento chirurgico per l'impianto finestra cranica può influenzare la formazione di un circuito corticale normale a causa di infiammazione del cervello12. Tuttavia, c'è un'alta probabilità che in vivo imaging è più fisiologico rispetto con imaging in vitro come Time-lapse immagini della preparazione di fetta di cervello, che dovrebbe anche dar luogo ad infiammazione severa di ischemia e affettare. Inoltre è stato segnalato che l'esposizione ripetuta alle isoflurano può interessare diversi processi neuronali18. Esperimenti di controllo devono essere eseguiti per verificare l'adeguatezza dei risultati ottenuti da imaging in vivo . Nel caso nostro imaging dei neuroni di strato 4 nella corteccia somatosensoriale, abbiamo confermato un aumento normale lunghezza totale dendritica e acquisizione di bias di orientamento delle proiezioni dendritiche dei neuroni stellati spinosi5,20.
Recenti studi segnalati > 1 mm-formazione immagine di profondità in un cervello di topo adulto in cui il dura è stato rimosso durante la chirurgia19. D'altra parte, siamo stati in grado di riferire fino a 400-µm-profondità imaging in neonati5. Poiché la dura madre non può essere rimosso in neonati e ciò, a sua volta, porta ad un'elevata diffusione della luce, riteniamo che la formazione immagine profonda in neonati è più impegnativo che negli adulti. Miglioramento futuro in sonde fluorescenti, laser e rivelatori dovrebbe consentire profonda di imaging nel cervello neonatale.
Finora, abbiamo segnalato 18 ore Time-lapse imaging mediante il presente protocollo5. Recentemente, siamo riusciti a 72 ore Time-lapse imaging migliorando il protocollo20. Continueremo a perfezionare il protocollo presentato qui (ad esempio, a più lungo termine, maggiore tempo e formazione immagine risoluzione spaziale) per rivelare meccanismi dinamici di sviluppo dei circuiti neuronali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano T. Sato, M. Kanbayashi e S. Kouyama per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da JSP KAKENHI Grant numeri JP15K14322 e JP16H06143, la Takeda Science Foundation, la Fondazione Memorial Uehara e il Collaborative Research Project di Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M) e da KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 e JP15H04263 e Grant-in ricerca scientifica sulle aree dell'innovazione "Regolazione dinamica della funzione del cervello di Scrap & Build System" (JP16H06459) dal MEXT (T.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
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