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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz basierende Assays, die die Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz durch fluorometrisch und bildgebende Untersuchungen in lebenden Zellen misst. Dieser Test kann verwendet werden, für das screening von Drogen oder Zielgene, die Plasmamembran Wiederverschließen in Säugetierzellen zu regulieren.

Abstract

In ihrer physiologischen Umgebung sind Säugerzellen häufig mechanischen und biochemischen Belastungen ausgesetzt, die Plasmamembran Schäden zur Folge haben. In Reaktion auf diese Schäden verschließen komplexen molekularen Maschinen schnell der Plasmamembran für die Wiederherstellung der Barrierefunktion und Überleben der Zellen zu erhalten. Trotz 60 Jahre Forschung in diesem Bereich fehlen uns noch ein gründliches Verständnis der Zelle Wiederverschließen Maschinen. Mit dem Ziel der Identifizierung von Zellkomponenten haben dieser Kontrolle Plasmamembran Wiederverschließen oder Medikamenten, die Wiederverschließen verbessern können, wir einen Fluoreszenz-basierte Hochdurchsatz-Assay entwickelt, der der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugetierzellen misst kultiviert in Mikrotiterplatten. Als Modellsystem für die Plasmamembran Schaden, sind bakterielle Pore-forming Toxin Listeriolysin O (LLO), bildet große 30-50 nm Durchmesser proteinhaltige in Cholesterin-haltige Poren Zellen ausgesetzt Membranen. Die Verwendung eines Lesers temperaturgeführte Multimode Mikrotestplatte ermöglicht rasche und sensible Spectrofluorometric Messungen in Kombination mit Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie-Imaging lebender Zellen. Kinetische Analyse durch eine Membran impermeant Nukleinsäure-bindenden Fluorochrom emittiert Fluoreszenz-Intensität reflektiert das Ausmaß der Membran Verwundung und Wiederverschließen auf Bevölkerungsebene Zelle, so dass für die Berechnung der Zelle Wiederverschließen Effizienz . Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildgebung ermöglicht die Aufzählung der Zellen, die konstitutiv ausdrücken eine fluoreszierende Chimäre aus der nuklearen Protein Histon 2 b, in jede Vertiefung der Mikrotestplatte, um mögliche Schwankungen in ihrer Anzahl zu berücksichtigen und können für eventuelle Identifizierung von unterschiedlichen Zellpopulationen. Dieser Hochdurchsatz-Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug erwartet, um unser Verständnis der Membran Reparaturmechanismen über Screening für Host Gene erweitern oder exogen hinzugefügt, dass Kontrolle Plasmamembran Wiederverschließen Verbindungen.

Introduction

Säugerzellen unterliegen mechanischen, osmotische und biochemischer Stress, was zum Verlust der Integrität der Plasmamembran. Ohne schnelle und effiziente Wiederverschließen, würde geschädigte Zellen programmierten oder nekrotischen Tod schnell erliegen. Seit den 1960er Jahren haben Bemühungen um die Plasmamembran Wiederverschließen Prozess verstehen von den verheerenden Folgen, verbunden mit seiner Funktionsstörungen motiviert. In der Tat sind Krankheiten wie Muskeldystrophie Limb-Gürtel, Diabetes und Chediak-Higashi-Syndrom mit mangelhaft Plasmamembran Reparatur durch Mutationen im gen Kodierung Dysferlin, Produktion von advanced Glycation Endprodukte und defekte verbunden worden die lysosomalen Menschenhandel Regler CHS1, bzw.1,2,3,4,5,6. Allerdings ist bislang, unser Verständnis der Membran Wiederverschließen nach wie vor begrenzt7. Erste Studien haben gezeigt, dass die Membran Wiederverschließen durch den Zustrom von extrazellulären Ca2 + durch die beschädigte Plasmamembran8,9,10initiiert wird. Seitdem sind mehrere nicht gegenseitig Ca2 +-abhängige Mechanismen sind vorgeschlagen worden, um Zellen zu versiegeln. Die Patch-Hypothese schlägt vor, in der Nähe der Wunde, intrazelluläre Vesikeln miteinander und die beschädigten Plasmamembran verschmelzen zu handeln als ein Patch11,12,13,14. Ein zweites Modell schlägt vor, dass Kalzium-abhängige Exozytose Website Versionen von Lysosomen an der Wunde des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, die Sphingomyelin Ceramid im äußeren Merkblatt der Plasmamembran umwandelt. Diese plötzliche Änderung in der Lipidzusammensetzung führt Ceramid-driven Endozytose von der beschädigten Region15,16,17. Schließlich geht der dritte vorgeschlagene Mechanismus eine Rolle für die Endosomal Sortierung komplexer erforderlich für den Transport (ESCRT) Förderung die Bildung von Vesikeln nach außen gerichtete, die Weg von der Plasmamembran18Knospe. Nur eine begrenzte Anzahl von Proteinen in diesen Modellen identifiziert wurde, und ihre Maschinen muss weiter aufgeklärt.

Hier beschreiben wir einen Hochdurchsatz-Assay, den Maßnahmen der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz bei anhaftenden Säugerzellen unterzogen um zu Schäden durch rekombinante Listeriolysin O (LLO)19vermittelt. LLO ist eine Pore-forming Toxin (PFT) abgesondert von der fakultativen intrazellulären Erreger Listeria Monocytogenes20,21,22 und gehört zu den MACPF/CDC (Membrane Angriff komplex, Perforin, und Cholesterin-abhängige Cytolysin)-Superfamilie. MACPF sind Säugetiere Pore-forming Proteine beteiligt, Immunabwehr, während CDCs bakterielle Toxine hauptsächlich sind produziert durch gram-positive Erreger, die Wirtszellen zur Förderung ihrer pathogenen Lebensstile23beschädigen. CDCs sind als wasserlösliche Monomere synthetisiert oder Dimere, die an Cholesterin binden in der Plasmamembran und oligomerize zu einem prepore Komplex von bis zu 50 Untereinheiten. Komplexe Prepore ordnet dann um β-Stränge über die Lipid-Bilayer bildet eine β-Fass-Pore, die 30-50 nm im Durchmesser24,25,26,27umfasst einzufügen.  Diese großen Poren erlauben Fluten von Ionen und kleine Zellkomponenten innerhalb und außerhalb der Zelle; jedoch haben einige Studien vorgeschlagen, Poren kleiner Größen auch gebildete28,29,30 sind. Unter die CDCs zeigt LLO einzigartige Eigenschaften einschließlich irreversible pH-Wert und Temperatur-abhängige Aggregation, die förderlich für Hochdurchsatz-Analysen31,32ist. LLO kann Zellkulturmedium bei 4 ° c, eine Temperatur, die freizügig ihre Bindung an Zellen, aber nicht zur Bildung von komplexen Pore hinzugefügt werden. Einleitung der Porenbildung kann dann synchronisiert werden, durch Erhöhung der Temperatur um 37 ° c, so dass für die effiziente Verbreitung der Toxin-Moleküle in der Ebene der Membran zu Form Oligomere und zum Konformationsänderungen Umbau Pore Generation beteiligt. Daher wird nach dem Wechsel der Temperatur, der kinetische Zellschäden die Menge des Toxins an die Plasmamembran gebunden abhängen. Vor allem lösliche LLO (nicht an der Plasmamembran gebunden) rasch und irreversibel aggregiert, wenn die Temperatur 37 ˚C erreicht die verringert die Notwendigkeit ungebundenes Toxin Moleküle abzuwaschen und das Ausmaß der Membranschäden im Laufe der Zeit. Zu guter Letzt, weil LLO an Cholesterin bindet und Cholesterin-reiche Membranen Poren bildet, ist dieser Assay offen für eine Vielzahl von Säugerzellen. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, die LLO betrifft Wirtszelle Signalisierung hauptsächlich über Porenbildung, mit wenigen Ausnahmen in die Pore-unabhängige Zelle Signalisierung kann auftreten,33,34,35,36 ,37,38,39. Es kann also nicht sein, dass LLO Signalisierung Aktivitäten beeinflussen den Prozess der Membran Reparatur ausgeschlossen.

Dieser Assay bewertet direkt das Ausmaß der Zelle Verwundung durch Messung der Einbau von einer Zelle impermeant Fluorochrom (z.B. Propidium Jodid), die passiv verletzte Zellen und wird stark fluoreszierende, sobald es mit Nukleinsäuren assoziiert . Daher kann die Fluorochrom in Zellkulturmedium während das Experiment, so dass Echtzeitanalysen der Zelle Verwundung gepflegt werden. Der Fluoreszenzintensität des Farbstoffs Nukleinsäure-Bindung erhöht die Konzentration des Toxins und für eine bestimmte Konzentration des Toxins wird im Laufe der Zeit erhöhen, bis alle Poren gebildet werden und Zellen sind vollständig repariert oder Sättigung erreicht ist. Der Zustrom von extrazellulären Ca2 + Poren der Membran ist eine conditio Sine Qua Non -Event für Wiederverschließen. Daher die resealing Effizienz kann indirekt nachgewiesen durch den Vergleich Zelle Verwundung in Kulturmedium mit Ca2 + (permissive Reparaturbedingung), Verwundung in einem Ca2 +-freie Mitte (Reparatur einschränkende Bedingung). Da der Fluoreszenzintensität der Nukleinsäure-Bindung Farbstoff direkt proportional zu der Zellkonzentration in jedes gut ist, ist es wichtig, Samenzellen bei der gleichen Konzentration in alle Wells. Es ist auch wichtig, Zellen in jedem gut vor und nach der Test um sicherzustellen, dass die Zelle Ablösung tritt nicht auf, als schwimmende, aggregierte Zellen Fluoreszenz Lesungen verdecken können die Interpretation der Daten erschweren kann, aufzählen. Um Zellen aufzuzählen, wurden Zellen mit dem Ausdruck ihrer nuklearen lokalisiert Histon 2 b-GLP (H2B-GFP) in diesem Test verwendet. Temperaturgeführte, Multimode, kombinieren Mikrotestplatte Leser schnelle Hochdurchsatz-Messungen (mit einem 96 oder 384-Well-Plattenformat) Fluoreszenz-Intensitäten mit Mikroskopie-Bildgebung von lebenden Zellen bei 37 ° C. Letzteres kann verwendet werden, zum Auflisten der Zellzahl und die eventuelle Bildung von unterschiedlichen Zellpopulationen zu beobachten.

Letztlich dieser Assay bietet dem Anwender die Möglichkeit, ihr Wissen über die Komplexität der Membran Reparaturmechanismen durch Screening für Host-Moleküle zu erweitern oder exogen zusätzliche Verbindungen, die Membran steuern können zu reparieren. Das folgende Protokoll beschreibt die experimentellen Schritte, um die resealing Effizienz der Zellen, LLO messen und bewerten die Auswirkungen einer bestimmten Droge oder zellulären Behandlung auf Wiederverschließen Effizienz.

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Protocol

1. Vorbereitung

  1. Zelle-Beschichtung
    Hinweis: Menschlichen zervikale Epithelzellen, HeLa und HeLa auszudrücken Histon 2 b-GLP (H2B-GFP), wurden in diesem Protokoll verwendet, aber dieser Assay an anderen Säugerzellen19angepasst werden kann.
    1. Nehmen Sie adhärente Zellen aus einem 75 cm2 Zelle Kultur Kolben durch Waschen der Zellen mit 2 mL Trypsin-EDTA 0,25 ab %. Ersetzen Sie die gebrauchte Trypsin mit 2 mL frische Trypsin-EDTA 0,25 %.
    2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° c für 5 min, bis die Zellen haben abgerundet und losgelöst von der Küvette.
    3. Aufschwemmen der Zellen in 8 mL Wachstumsmedium (DMEM mit 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin).
    4. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hemocytometer und 10 µL Zellsuspension.
    5. Die Zellen im Wachstumsmedium zu einer Konzentration von 2,5 x 105 Zellen/mL zu verdünnen.
    6. Gießen Sie die Zellsuspension in einer sterilen Pipette Schüssel und mischen Sie die Suspension mit einer serologischen 10 mL-Pipette.
    7. Mit einem 12-Mehrkanal-Mikropipette und 200 µL Spitzen, HeLa-Zellen (2,5 x 104 Zellen/100 µL/Well) in dreifacher Ausfertigung (oder Vierfachbestimmungen) in eine 96-Well flachen, klaren, schwarzen Polystyrol Gewebekultur behandelt Bodenplatte verteilen.
      Hinweis: Eine Beschichtung-Anordnung wird als ein Beispiel in Abbildung 1dargestellt.
    8. Kultur der Zellen für 24 h in einem befeuchteten Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° c und 5 % CO2.
  2. Stammlösung Vorbereitung
    1. Bereiten Sie 1 L einer 10 X Aktie des Puffers M (zum Vorbereiten von M1 und M2) durch Zugabe von 95 g Hanks ausgewogen Salzlösung, 0,476 g MgCl2 (5 mM), und 23,83 g HEPES (100 mM) auf 900 mL Wasser. Passen Sie den pH auf 7,4 und erhöhen Sie die Lautstärke auf 1 L. Filter zu sterilisieren.
    2. Bereiten Sie 50 mL einer 50 x (1,25 M) Lager von Glukose durch Zugabe von 11,26 g D-(+)-Glucose auf insgesamt 50 mL Wasser. Filter zu sterilisieren die Lösung.
    3. Bereiten Sie 50 mL einer 100 x (120 mM) bestand von Kalzium durch Zugabe von 0,666 g CaCl2 auf insgesamt 50 mL Wasser vor. Filter zu sterilisieren die Lösung.
    4. Bereiten Sie 50 mL einer 10 x (50 mM) bestand von Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', Tetraacetic Säure (EGTA) durch Zugabe von 0,951 g EGTA, 40 mL Wasser. Erhöhen Sie den pH-Wert auf 8 mit NaOH der EGTA aufzulösen, dann erhöhen Sie die Lautstärke auf 50 mL. Filter zu sterilisieren die Lösung.
    5. Vorbereitung einer einzelnen 96-Well-Platte, 50 mL Medium 1 (M1, enthält Ca2 +), 50 mL Medium 2 (M2, Ca2 +-frei), und 15 mL Medium 2 mit EGTA, entsprechend ergänzt:
      1. Fügen Sie für M1 5 mL 10 x 1 mL 50 X Glukose Puffer M und 0,5 mL 100 X CaCl2zu 43,5 mL Wasser hinzu.
      2. Fügen Sie für M2 5 mL 10 x Puffer M und 1 mL 50 X Glukose 44 mL Wasser hinzu.
      3. Für M2/EGTA, fügen Sie 1,5 mL 10 x Puffer M und 1,5 mL 10 X EGTA auf 12 mL Wasser.
        Hinweis: Alle Lösungen mit Propidium Jodid (PI) sollten bereit sein, direkt vor dem Hinzufügen zu den Zellen.
  3. Platte Leser/Imaging Cytometer Einstellungen
    Hinweis: Benutzen Sie einen Multi-Mode-Platte-Reader mit zwei Erkennungseinheiten ausgestattet: eine Spectrofluorometer und eine bildgebende Cytometer. Begrenzen Sie die Fluoreszenz-Exposition zur Vermeidung von Immunofluoreszenz die Fluorophore.
    1. Vorwärmen des Platte Lesers auf 37 ° C vor der Durchführung des Tests.
    2. Richten Sie die Parameter für die kinetische Assay entsprechend im Modus " Einstellungen ":
      1. Wählen Sie Monochromator, FL (Fluoreszenz)und kinetische für die optische Konfiguration aus, lesen Sie Modi und lesen Sie Typ, bzw. zu.
      2. Wählen Sie unter Wellenlänge Einstellungeneine 9 und 15 nm Anregung und Emission Bandpass, beziehungsweise. Für Assays setzen mit Propidium Jodid (PI), Sie die Anregung und Emission Wellenlängen bis 535 und 617 nm.
      3. Wählen Sie unter Plattenart 96 Wells für das Plattenformat und eine voreingestellte Platte Konfiguration entspricht eine schwarze Wand klar Bodenplatte.
      4. Markieren Sie unter Bereich lesendie Brunnen, die während der kinetischen analysiert werden.
      5. Unter PMT und Optikdie Blitze pro gelesene auf 6 voreingestellt und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Lesen von unten.
      6. Unter Timing 00:30:00 Uhr im Feld Laufen Gesamtzeit für einen 30 min. kinetischer Assay einfügen und 00:05:00 Uhr für das Intervalleinfügen.
        Hinweis: Für jedes Mal zu zeigen und eine Wellenlänge, die Lesung eine volle 96-Well-Platte ist 30 s.
      7. Überprüfen Sie die angegebenen Einstellungen in den Einstellungen auf der rechten Seite und wählen Sie "OK". Führen Sie Presse Lesen , die kinetischen einzuleiten.
    3. Richten Sie die bildgebenden Parameter entsprechend im Modus "Einstellungen":
      1. Wählen Sie Minimax, Imagingund Endpunkt für die optische Konfiguration aus, lesen Sie Modi und lesen Sie Typ, bzw. zu.
      2. Wellenlängen, wählen Sie unter Licht übertragen, und eine oder beide der Fluoreszenz Kontrollkästchen der entsprechenden Anregung und Emission Wellenlängen von 456/541 nm (GFP) und 625/713 nm (PI).
      3. Verwenden Sie die gleichen Optionen für das Plattenart und Lesen Sie , wie in den Schritten 1.3.2.3. und 1.3.2.4 definiert.
      4. Wählen Sie unter Gut Bereich Einstellungdie Anzahl der Standorte in einen Brunnen, abgebildet werden.
        Hinweis: 12 Standorte entsprechen zu einem Full-Well-Bild.
      5. Wählen Sie unter den Erwerb Bildeinstellungendie Belichtungszeiten für Durchlicht, 541 (GFP) und 713 (PI). Für GLP Bild, das ganze gut mit einer Belichtungszeit von 20 ms/Bild. Für übertragen Licht (TL) und PI Fluoreszenz, ein einzelnes Bild von der Mitte von jedem Bohrloch mit Belichtungszeiten von 8 bis 20 ms, bzw. zu erwerben.
      6. Überprüfen Sie die angegebenen Einstellungen in den Einstellungen -Informationen auf der rechten Seite und wählen Sie "OK". Die Erfassungszeit für imaging-die gesamte Oberfläche von jedem Bohrloch (12 Bilder/Na) einer 96-Well-Platte und für eine Wellenlänge ist ~ 15 min. Presse Lesen , Bildgebung zu initiieren.
        Hinweis: Die Erfassungszeit von einem einzigen Bild/Brunnen einer 96-Well-Platte erfordert ~2.5 min/Platte für eine Wellenlänge. Die oben beschriebenen Parameter entsprechen den spezifischen Ausrüstung in unserem Labor. Spectrofluorometric Messungen: eine Xenon Blitzlampe 1,0 nm Schrittweite Erregung Wellenlängen (250-850 nm) mit einer verstellbaren 9 oder 15 nm Bandpass anzeigen, melden Sie sich ein Photomultiplier-Röhren-Detektor mit einer > 6 Dynamikbereich und eine verstellbare 15 oder 25 nm Emission Bandpass. Imaging Cytometer: eine Beleuchtung Lichtquelle in der Lage, des weißen Lichts, 460 nm und 625 nm Erregung Wellenlängen mit einem 20 nm Bandpass, Emission Filter zentriert auf 541 nm (108 nm Bandpass) und 713 nm (123 nm Bandpass), bzw., und eine 4 X Objektiv gekoppelt an ein 1,25 12-Bit Charge - Coupled Device Megapixelkamera.

(2) assay

Hinweis: Zum Zeitpunkt des Tests müssen Zellen Zusammenfluss von 70-90 % sein. Während der Wäsche Schritte sollte das Medium entnommen und an der Seitenwand des Brunnens (nicht direkt über die Zellen) angewendet. Behalten Sie die Temperatur der LLO auf < 4 ° c seine Aggregation bis Schritt 3.1.5 zu verhindern.

  1. Bereiten Sie einen Bestand von 30 µM PI in M1 und ein Bestand von 30 µM PI in M2 bei 37 ° c vorgewärmt.
  2. Vorsichtig Waschen der Zellen in Platte 1 mit einer 12-Mehrkanal-Mikropipette und 200 µL Tipps, wie folgt:
    1. Entfernen Sie für Reparatur-freizügigen Bedingungen die Wachstumsmedium und waschen, die die Zellen zweimal mit 200 µL/Well M1 bei 37 ° c vorgewärmt. Ersetzen Sie das Medium mit 100 µL/Well des warmen M1 mit 30 µM PI.
    2. Für reparieren Sie restriktive Bedingungen zu, entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 µL/Well warm M2 mit 5 mM EGTA, Ca2 +, gefolgt von einem waschen mit 200 µL/Well M2 Chelatkomplex. 30 µM PI-haltigem Medium mit 100 µL/Well warm M2 zu ersetzen.
    3. Nachdem das Wachstumsmedium gewaschen und mit Propidium Jodid-haltigem Medium ersetzt wurde, direkt zu 2.1.3 Schritt zu bewegen.
  3. Bild-Platte 1 unter Durchlicht, GLP und PI als detaillierte unter 1.3.3 (Pre-kinetische). Dieser Schritt dauert 15-20 min.
  4. Bereiten Sie den Zeitraum 15 min im Schritt 2.1.3 Platte 2 mit einem 12-Mehrkanal-Mikropipette und 200 µL Tipps wie folgt:
    1. Legen Sie eine 96-Well Rundboden Polypropylen Mikrotestplatte auf Eis. Konfigurieren Sie die Platte mit ein experimentelles Design entsprechende Platte 1 (Abbildung 1).
    2. Für Reparatur-freizügigen Bedingungen hinzufügen 100 µL/Well des eiskalten M1 mit 60 µM PI, gefolgt durch die Zugabe von 100 µL/Well des eiskalten M1, 4 x LLO oder nicht für das Steuerelement enthält.
    3. Für Reparatur-restriktiven Bedingungen hinzufügen 100 µL/Well des eiskalten M2 mit 60 µM PI, gefolgt durch die Zugabe von 100 µL/Well des eiskalten M2, 4 x LLO oder nicht für das Steuerelement enthält.
  5. Platzieren Sie nach der imaging-Platte 1 (Schritt 2.1.3), sofort es auf Eis, mit Alu-Folie, um die Platte vor dem direkten Kontakt mit Eis zu trennen. Lassen Sie Platte 1 bis 5 min abkühlen.
  6. Mit einem 12-Mehrkanal-Mikropipette und 200 µL Spitzen, 100 µL aus jedem Brunnen in Platte 2 (Schritt 2.1.4) in die entsprechenden Vertiefungen in die Platte 1 übertragen. Um das Toxin in den Medien der Platte 1 richtig zu verteilen, setzen Sie die Tipps unten der Meniskus und werfen Sie sanft die Lautstärke ohne Luftblasen.
    Hinweis: Nicht rauf und runter, pipette, wie dies die Zellen versehentlich lösen kann.
  7. Lassen Sie die Platte für eine zusätzliche 1 min um das Toxin an Zellen zu binden und Sofortüberweisung Platte 1 Platte Leser zum kinetischen Test mit dem Spectrofluorometer-Modus (Schritt 1.3.2) zu ermöglichen.
  8. Am Ende der kinetischen Test sofort Bild Platte 1 (Post-kinetische) mit Schritt 1.3.3.

3. Analyse: Cell Enumeration

  1. Bestimmen Sie die Zellzahl auf die nukleare Fluoreszenz unter Verwendung der Mikrotestplatte Zelle Enumeration Software basiert.
    1. Innerhalb der Einstellungen, wählen Sie Re-Analyseund unter der Kategorie Abschnitt innerhalb der Analyse Bildeinstellungen Diskrete Objekt-Analyse mit 541 als die Wellenlänge für die Suche nach Objekten.
    2. Innerhalb der Objekte finden-Option, mit der Suche nach Methode, Zeichnen Sie auf Bilder wählen Sie Kerne unter der Registerkarte "Einstellungen", und klicken Sie auf anwenden.
    3. Drücken Sie "OK" und Lesen Sie die Zelle zählen Algorithmus zu initiieren.
  2. Alternativ, wenn kein solches Tool verfügbar ist, verwenden Sie eine Bildanalyse-Software wie ImageJ Zellen auflisten.
    1. Öffnen Sie in ImageJ die Bilddatei als Stapel.
    2. Konvertieren des Stapels auf 8-Bit-Graustufen-Bilder durch Klick auf Bild in der Menüleiste, bewege den Mauszeiger über Typ, und wählen Sie 8-Bit.
    3. Subtrahieren Sie den Hintergrund: Klick Bild in der Menüleiste, zeigen Sie auf anpassen, und wählen Sie Helligkeit/Kontrast. Stellen Sie den Mindestwert um die Hintergrundgeräusche zu entfernen, und wählen übernehmen.
    4. Schwelle, binäre Abbilder zu erstellen: Klicken Sie Bild in der Menüleiste, zeigen Sie auf anpassen, und wählen Sie Schwelle. Wählen Sie dunklen Hintergrund aus, stellen Sie die minimale und maximale Grenzwerte, und klicken Sie auf anwenden.
    5. Bei Überschneidungen der Kerne, kann eine Wasserscheide Tool Segment Kerne verwendet werden. Klicken Sie auf Prozess im Menü, bewege den Mauszeiger über binäre und wählen Sie Wasserscheide.
      Hinweis: Dies wird automatisch verbundenen Kernen trennen.
    6. Analysieren Sie die maskierten Bilder nach benutzerdefinierten Kriterien (Größe und Zirkularität) die Identifizierung der Kerne zu verfeinern und Zellenrückstand ausschließen.
      1. Klicken Sie auf analysieren , in das Menü und dann analysieren Partikel. Legen Sie die gewünschte Größe (Pixel ^ 2) und Zirkularität (ein Wert von 1 ist ein perfekter Kreis) reicht, die ausreichen, um die einzelnen Zellen/Kerne enthalten.
      2. Wählen Sie im Feld Dropdown-Liste anzeigen die Option(en) gewünscht, überprüfen Sie zusammenfassenzu, und klicken Sie auf "OK" , um Zellen zu erhalten.

4. Analyse: Kinetische Kurven

  1. Übertragen Sie die kinetische Daten von der Platte-Reader-Software zum einen analytischen Daten-software
  2. Für jede Versuchsbedingung durchschnittlich die Fluoreszenz-Intensitäten der Wiederholungen bei jeder Timepoint, zusammen mit den entsprechenden Standardabweichung und Standardfehler des Mittelwerts für jede experimentelle Bedingung.
  3. Für jede Versuchsbedingung verfolgen die entsprechenden kinetische Kurve: PI Intensität (y-Achse) im Vergleich zur Zeit (x-Achse).
  4. Um die resealing Effizienz einer bestimmten Behandlung Bedingung zu berechnen, berechnen Sie die Fläche unter der Kurve (AUC) von der + LLO in M1 (AUC(M1)) und + LLO in M2 (AUC(M2)). Verwenden Sie den Ansatz zur Bewertung der Effizienz (E) der Wiederverschließen unten vorgeschlagen:
    Equation
  5. Einen Abgleich zwischen Kontroll- und Behandlung durch die Bestimmung der Wirkungsgrad (REff) unten angegeben:
    Equation 2
    REFF = 1, Testbehandlung hat keine Auswirkung auf Reparatur
    REFF < 1, Testbehandlung hemmt Reparatur
    REFF > 1, Testbehandlung verbessert die Reparatur
  6. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve unter Verwendung der folgenden Gleichung:
    Equation 3, wobei k ist die Gesamtzahl der Follow-ups.

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Representative Results

Zelle zählen Genauigkeit: HeLa-Zellen dienen häufig als eine Modellreihe Säugetier-Zelle Membran Reparaturmechanismen zu erkunden. Membran-Reparatur auf der Zellebene Bevölkerung zu beurteilen, ist es wichtig, Platte Zellen in der gleichen Konzentration in alle Wells für richtige Dateninterpretation. Es ist auch wichtig, die zum Zeitpunkt des Tests zu überprüfen, ob Zellzahlen über Brunnen gleichwertig sind. HeLa-Zellen, die konstitutiv Histon 2 b mit GFP (H2B-GFP) verschmolzen ausdrücken wurden in diesem Assay Zellen basierend auf Erkennung von ihren fluoreszierenden Kerne automatisch auflisten eingeführt. Um die Genauigkeit in Zelle-Enumeration zu etablieren, wurden zweifache Verdünnungsreihen von HeLa H2B-GFP Zellen in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte und kultivierten für 4 h vernickelt. Dieser Zeitraum reicht für Zellhaftung und bietet begrenzte Zellteilung. Voller Brunnen wurden unter Durchlicht (TL) abgebildet und GFP Fluoreszenz Beleuchtung und Zellzahlen wurden bewertet anhand der GFP Fluoreszenz unter Verwendung der Platte-Leser-Analyse-Software (Abb. 2A und 2 b). Die durchschnittliche Zelle zählt ± Standardabweichung gegen Cell seeding Konzentrationen aufgetragen wurde, und eine Linie Ausgleichsgerade angegeben ein 1.08:1 Verhältnis des Grafen von Zelle zu Zelle, Aussaat, beweisen die Richtigkeit des Zählens (Abbildung 2). Durch bildgebende Verfahren aller Brunnen vor kinetischer Assay, kann sicherstellen, dass Zellzahlen unter alle Brunnen im Einklang stehen. Auch durch bildgebende Brunnen nach der kinetischen Test, kann man festzustellen, ob Exposition gegenüber dem Toxin Zelle Ablösung verursacht.

Ausdruck der GLP Propidium Jodid (PI) Intensität Messungen (IPI) nicht stört: um sicherzustellen, dass H2B-GFP nuklearen Verein Gründung PI oder PI Intensität Fluoreszenzmessung iPI, ichPI nicht stört war im Vergleich in HeLa und HeLa H2B-GFP Zellen, die ausgesetzt wurden oder nicht, auf 1 nM LLO (Abbildung 3). In Abwesenheit von PI gab es eine ähnlich geringe Hintergrundfluoreszenz in HeLa und HeLa H2B-GFP, darauf hinweist, dass die GLP nicht durch PI Fluoreszenz Emission Filter blutet. In Anwesenheit von PI, aber fehlender LLO gab es eine ähnliche basale PI Fluoreszenzemission in HeLa und HeLa H2B-GFP, die nicht im Laufe der Zeit geändert haben. Dies bestätigt, dass Ausdruck der GLP Messung der Fluoreszenz PI nicht beeinflusst und angedeutet, dass PI nicht beschädigte Zellen über den Zeitrahmen des Experiments nicht durchdringen. Zugabe von LLO führte zu einem Anstieg in PI Fluoreszenz im Laufe der Zeit, die in HeLa und HeLa H2B-GFP ähnlich war. Dieser Anstieg ist auf die Zelle Verwundung von LLO kombiniert mit PI Verband mit Nukleinsäuren. Zusammen, schaffen diese Ergebnisse, dass Ausdruck der Histon-2 b-GLP PI Gründung oder Messung der Fluoreszenz bleibt unberührt.

PI-Fluoreszenz stört nicht mit GFP-basierte Zellzählung: wechselseitig, war es wichtig, sicherzustellen, dass PI nuklearen Einbeziehung in den verletzten Zellen GFP-basierte Zellzählung nicht stört. Repräsentative Fluoreszenzbilder HeLa und HeLa H2B-GFP ausgesetzt 1 nM LLO im Beisein von PI zeigte, dass es eine deutliche Anreicherung von PI in den verletzten Zellen Post Kinetik als erwartet (Abbildung 4A). Bildgebung zeigte auch, dass PI durch GLP-Fluoreszenz-Detektion (Abbildung 4A und Tabelle 1) bluten könnte. Diese Fluoreszenz-Crossover geschätzt wurde am besten auf die Post-kinetische Bilder von HeLa-Zellen, die GFP nicht ausdrücklich, aber immer noch angezeigt grün fluoreszierenden Kerne (Abb. 4A). Dieses Crossover könnte auch durch die Messung der GFP-Fluoreszenz-Intensität (IGFP) in HeLa H2B-GFP Zellen belegt die Post-kinetischen deutlich im Vergleich zu vorher kinetische (Abbildung 4 b erhöht). Wichtig ist, betroffen PI Fluoreszenz Crossover Zellzählung, weil die Segmentierung Prozess in der Aufzählung der Kerne nicht betroffen durch eine Zunahme der GFP Fluoreszenz (Abbildung 4) ist nicht.

Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz: In diesem Abschnitt stellen wir die grundlegende Methodik zur Messung der Effizienz der Membran Wiederverschließen. Um den Prozess der Membran Wiederverschließen Beweise, HeLa H2B-GFP Zellen ausgesetzt waren, oder nicht, 1 nM LLO in das Vorhandensein (M1) oder fehlen (M2) der extrazellulären Ca2 + (Abbildung 5). Wie erwartet, in Ermangelung der LLO, konstant ichPI in M1 und M2. Zugabe von LLO in Ca2 +-mit Medium führte eine stetige Zunahme im PI-Fluoreszenz-Intensität (IPI), während bei fehlender extrazelluläre Ca2 +, gab es ein deutlich steiler Anstieg PI Fluoreszenz, reflektieren die fehlender Membran Wiederverschließen. Zur Beurteilung der resealing Effizienz, definiert als die Fähigkeit der Zellen, in Bezug auf M2 M1 zu reparieren (Schritt 1.5.4.1), die Fläche unter der M1 und M2 Kurven (AUC) wurden ermittelt und die Effizienz der Reparatur (E) 0,287 sein berechnet wurde.

Eine Alternative zu PI: PI hat als ein Marker für die Plasmamembran Schaden ubiquitär verwendet worden. Es gibt jedoch andere Nukleinsäure-Bindung Farbstoffe, die auch für diesen Test geeignet sind. Zum Beispiel eine Membran impermeant Carbocyanine Nukleinsäure-Bindung (CNABD) Exponate ein Emissionsspektrum Hineingreifen in die weit rot zu färben und hat eine hohe Spezifität für doppelte stranded DNA. PI bindet auf der anderen Seite DNA- und RNA-40,41. Im Gegensatz zu PI überlappt die Anregung und Emission-Spektren von CNABD nicht mit denen der GFP besser spektrale Auflösung zwischen den beiden Fluorochromes ermöglichen. Darüber hinaus hat die CNABD, die in diesem Protokoll verwendeten ein Aussterben Koeffizienten fast doppelt so viel, die von PI, was bedeutet, dass für ihre jeweiligen Erregung Wellenlängen dieser Farbstoff absorbiert Energie als PI mehr fähig ist, was zu einer stärkeren Fluoreszenzemission. Quantitative Fluoreszenzanalyse CNABD und GFP-Bilder zeigten, dass diese Farbe einen großen Fluoreszenz Dynamikbereich aufweist emittiert keine deutlich bei den Wellenlängen der GFP Fluoreszenz und hat keinen Einfluss auf die Anzahl der Zellen (Abbildung 6A-D). In der Tat, HeLa H2B-GFP Zellen inkubiert in M1 oder M2 Medium mit CNABD und beschädigt von 1 nM LLO ausgestellt bzw. eine 4 und 5.5 - fache Steigerung ichCNABD im Vergleich zu den Kontrollen nicht beschädigt (Abb. 7A). Zum Vergleich: Zellen ausgesetzt auf 1 nM LLO im Beisein von PI eine 2,5 - 3 fache Erhöhung in PI Fluoreszenzintensität in M1 und M2, ausgestellt bzw. (Abbildung 5). Wie PI, CNABD Exponate zunehmender Fluoreszenzintensität mit zunehmender LLO Konzentration in M1 (Abb. 7A), und die daraus resultierenden Reparatur Effizienz wurde berechnet, wie im Schritt 1.5.4.1 (Abb. 7 b) beschrieben. Wir berichten, dass die Zelle Wiederverschließen Effizienz sinkt als LLO Konzentration erhöht. Dieses Phänomen spiegelt die Tatsache, dass Zellen verringern ihre Kapazität zu verschließen, wenn übermäßige Schäden verursacht werden.

Qualitätsbeurteilung von der Membran-Reparatur-Test: ein kritischer Aspekt jeder Assay ist seine Robustheit oder die Fähigkeit zu erkennen und Unterschiede zwischen den negativen und positiven Steuerelementen beheben. Signal-Variation zwischen positiven und negativen Kontrollen muss ausreichend Dynamikbereich und Reproduzierbarkeit anzeigen. In dieser Membran-Reparatur-Assay sind die positiven und negativen Kontrollen Zellen bzw. LLO im Reparatur-permissive (M1) und Reparatur-restriktiven (M2) Bedingungen ausgesetzt. Zwei Ansätze wurden ergriffen, um die Robustheit des Assays für Hochdurchsatz-Analyse zu bewerten. Erstens der Z-Faktor oder screening-Fenster-Koeffizient, bestimmt, ob ein bestimmten Satz von Bedingungen eine große bietet genug Dynamik, unter Berücksichtigung der Signal-Variabilität. Z-Faktoren innerhalb der Bereiche 0 < Z ≤ 0,5 und 0,5 < Z ≤ 1 entspricht ein akzeptabel und sehr guter Test, bzw.42,43. Eine Einschränkung bei der Verwendung des Z-Faktors für die Beurteilung der Qualität ist, dass Bedingungen geprüfte in der Regel mehr moderate Werte im Vergleich zu den extremen positiven und negativen Kontrollen zeigen. Daher ist, wie ein zweiter Ansatz, berechneten wir die streng standardisierte mittlere Differenz (SSMD, β), die Unterschiede zwischen experimentellen Bedingungen identifizieren können, die nichts anderes als ein negatives Ergebnis basiert auf einer qualifizierten Z-Faktor44 kategorisiert werden würde ,45. SSMD Werte können kategorisiert werden, in Stärke von wirkungslos (β = 0) bis extrem stark (β ≥ 5). Anhand der Daten aus Abbildung 7A und AUC für den Vergleich von M1 im Vergleich zu M2 Bedingungen Exposition gegenüber 0,25 und 0,5 nM LLO produziert Z-Werte von 0.3100813 und 0.137313 und β = 6.0672 und 4.803308, bzw. darauf hinweist, dass ein der LLO Konzentrationen Fenster geeignet für den Assay. Mit zunehmender Konzentration der LLO über 1 nM, die Lücke in der ICNABD kinetische Kurven zwischen M1 und M2 Bedingungen schließt was zu drastisch reduzierten Z-Faktor und SSMD-Werten (Abb. 7 b). Solche hohen Konzentrationen von LLO entsprechen Bedingungen in denen Reparatur-Potenzial wird aufgewogen durch Schäden und negiert damit den Einsatz des Tests bei der Identifizierung von Faktoren, die in der Membran Reparatur. Dies wird weiter durch die Abnahme der Reparatur Effizienz (E) als LLO Konzentration erhöht (Abb. 7 b) dargestellt. Alle Daten (Z-Faktor, SSMD und E) mit 3 biologische Wiederholungen erzeugt wurden und 3 Technische repliziert pro Versuchsbedingung für Assay-Validierung. Zusammen, diese Daten zeigen, dass dieser Test die erwarteten Robustheit für einen Hochdurchsatz-Assay mit LLO Konzentrationen unter 1 hat nM für HeLa-Zellen.

Nachweis der Grundsatz: Sobald die Robustheit des Assays gegründet wurde, führten wir zusätzliche Experimente als Beweis des Prinzips, dass dieser Test hat die Empfindlichkeit und Auflösung um einen Defekt in der Reparatur-Prozess zu identifizieren. Wir berücksichtigt, dass Hochdurchsatz-Assays verwendet werden, da ein Screening-Verfahren "Hits" innerhalb der großen Bildschirme zu identifizieren, die weniger als 3 biologische einbeziehen kann repliziert. Daher ist es relevant, dass das experimentelle Design die Erkennungsmöglichkeiten bietet, "Hits" zu identifizieren innerhalb einer einzigen Assay. Daher kann unter einer Hochdurchsatz-Screen der Assay-Layout angepasst werden 4 Technische Wiederholungen um statistische Energie in einem einzigen Experiment zu erhöhen. Zellen in vervierfacht überzogen waren und waren vorbehandelt 1 h vor dem Assay mit Desipramin, einen pharmakologischen Inhibitor der lysosomalen Proteinen saure Sphingomyelinase (ASM) der Plasmamembran Reparatur15,17 eine Rolle spielt ,46. Wichtiger ist, die Behandlung mit Desipramin hatte keinen Einfluss auf Zellzahlen in der Assay, zulassend angemessenen Vergleich zwischen Desipramin-behandelten und unbehandelten Zellen (Abbildung 8A). Hemmung des ASM in Desipramin-behandelten Zellen ergab einen Defekt in der Membran Wiederverschließen Effizienz bei LLO, wie durch die Abnahme in E und REff (Abbildung 8 b und 8 C) dargestellt. Mit einem gemischte Effekte-Modell, behandelt Desipramin-ein Vergleich zu unbehandelten Zellen, 0,25 und 0,5 nM LLO in M1 bzw. p-Werte von 0.0010 und 1 x 10-10, zeigte. Gemeinsam zeigen Daten, dass 0,25 und 0,5 nM LLO entsprechenden Konzentrationen, Mängel in der Reparatur in einer Hochdurchsatz-experimentelle Einstellung zu identifizieren, mit möglichen statistischen Analysen von einem einzigen Experiment einmal technische repliziert werden auf vier erhöht . Beachten Sie, dass der statistische Ansatz des Modells gemischte Effekte zwischen vervierfacht Variationsmöglichkeiten über mehrere biologische Wiederholungen nicht berücksichtigt werden. Alle wichtigen Erkenntnisse, die mit einem biologischen replizieren sollten zusätzliche experimentelle Einstellungen überprüft werden.

Figure 1
Abbildung 1: Versuchsanordnung. Das Flussdiagramm zeigt eine repräsentative Plattendesign so konfiguriert, dass die Wirkung von sieben Testbedingungen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen testen. Zusätzliche Kontrollen sollten gegebenenfalls für Medikament Beispielfahrzeuge einbezogen werden. Zellen sind vergoldet (Tafel 1) 24 h vor dem Experiment. Am Tag des Experiments werden Zellen in Platte 1 mit M1 oder M2 Medium bei 37 ° C vorgewärmt gewaschen, und die Platte ist abgebildet (TL, GLP und PI Fluoreszenz) Pre-kinetische. Während die 15 min von bildgebenden, Reagenzien werden auf Eis Platte 2 hinzugefügt. Nach dem Imaging, Platte 1 ist sofort für 5 min auf Eis gelegt, und 100 μl/Well von Platte 2, 1 Platte übertragen. Platte 1 befindet sich in der Platte Leser den kinetischen Test bei 37 ° C für 30 min, gefolgt von imaging (TL, GLP und PI Fluoreszenz) ausgeführt. Daten werden dann analysiert, um Zellen zu zählen und Reparatur Effizienz in allen Versuchsbedingungen zu beurteilen. In großen Datenmengen kann Analyse automatisiert werden. Darüber hinaus kann die Anzahl der technischen Wiederholungen im Hochdurchsatz-Bildschirme auf 4 erhöht werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Zelle zählen Genauigkeit. HeLa-Zellen mit dem Ausdruck GFP-Tags Histon 2 b wurden in Triplicates in den angegebenen Konzentrationen ausgesät. (A) Zellen wurden bei 37 ° C unter Durchlicht (TL) abgebildet und GFP-Fluoreszenz (12 Bilder/Na) und eine Zelle Erkennungsalgorithmus wurde verwendet, um einzelne Kerne (in lila) abzugrenzen. Maßstabsleiste = 1 mm. (B) höheren Vergrößerung der TL, GLP und Zelle-Erkennung (lila) Bilder (Zoom 2 X). Maßstabsleiste = 100 μm. (C) Bild-Analyse-Software verwendet wurde, um die Anzahl der Zellen und die Zelle, die Grafen gegen die anfängliche aufgetragen wurden cell seeding Konzentration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Propidium Jodid Fluoreszenzmessung ist unempfindlich gegen Histon 2 b-GFP Ausdruck. Histon 2 b-GFP zum Ausdruck zu bringen und nicht mit dem Ausdruck HeLa-Zellen ausgesetzt waren, oder nicht, 1 nM LLO in der Gegenwart (durchgezogene Linien) oder Abwesenheit (gestrichelte Linien) von 30 μM PI in Ca2 +-mit Medium (M1). Kinetische Assay gemessen PI-Fluoreszenz-Intensitäten von Spectrofluorometry alle 5 min. für 30 min bei 37 ° C. Daten sind die durchschnittliche PI Fluoreszenzintensität (IPI) ausgedrückt in relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) ± SEM (n = 3 unabhängige Experimente, jeweils im Triplicates durchgeführt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Cell Enumeration ist unbeeinflusst von PI Fluoreszenz. (A) repräsentative Pre- und Post-kinetische Bilder (TL, PI und GLP) Zellen ausgesetzt oder nicht, auf 1 nM LLO in M1. Maßstabsleiste = 100 μm. (B) Quantitative Fluoreszenz-Mikroskopie-Analyse (ichGFP± SEM) offenbart die erhöhte GFP Fluoreszenzmessung durch PI nuklearen Aufnahme auf Zelle Verwundung von LLO (Post-kinetische). (C) Zelle GFP-basierten Enumeration wurde durch die Erhöhung der Intensität der GFP unberührt. Zellzahl pro Bohrloch äußerte sich als durchschnittliche ± SEM (In B und C: schwarze Balken = Pre-kinetische Daten; rote Balken = Post-kinetische Daten; n = 3 unabhängige Experimente, jeweils in Triplicates durchgeführt, einen zweiseitigen Student t-Test wurde verwendet, um quantitative Fluoreszenz zu analysieren Intensität und Zelle Grafen aus aufgenommenen Bilder ** p < 0,01). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz. Histon-2 b-GLP mit dem Ausdruck ihrer HeLa-Zellen ausgesetzt waren, oder nicht, 1 nM LLO in Ca2 +-haltige (M1) oder Ca2 +-frei (M2)-Medium mit 30 μM PI. Kinetische Daten repräsentieren PI-Fluoreszenz-Intensität (IPI) in relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) ± SEM, für 30 min bei 37 ° c gemessen n = 3 unabhängige Experimente, jeweils im Triplicates durchgeführt. Die resealing Effizienz gemessen wurde, wie im Protokoll Schritt 1.5.4 angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Carbocyanine Nukleinsäure verbindlich Farbstoff als eine alternative Farbstoff Membran Wiederverschließen beurteilen. HeLa H2B-GFP Zellen ausgesetzt waren, oder nicht, 0,5 nM LLO für 30 min bei 37 ° C in Gegenwart von 1 μM CNABD in Ca2 +-haltige (M1) oder Ca2 +-frei (M2) Medium. (A) Bilder von HeLa H2B-GFP-Zellen wurden erworben, Pre- und Post-kinetische in M1, die den Farbstoff enthält. Maßstabsleiste = 100 μm. (B und C) integrierte CNABD und GFP-Fluoreszenz-Intensitäten wurden mit der bildgebenden Cytometer gemessen und ausgedrückt in Einheiten der relativen Fluoreszenz (RFU) ± SEM. (D) GLP Fluoreszenzbilder wurden verarbeitet, um HeLa H2B-GFP auflisten Zellen (schwarze Balken = Pre-kinetische Daten, roter Balken = Post-kinetische Daten, n = 3 unabhängige Experimente, jeweils im Triplicates durchgeführt). Eine zweiseitige Student t-Test wurde verwendet, um quantitative Fluoreszenzintensität analysieren und Zelle zählt von aufgenommenen Bilder ** p < 0,01 *** p < 0,001) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Wirkung von LLO Konzentration auf Effizienz, Z-Faktor und SSMD Wiederverschließen. (A) HeLa H2B-GFP Zellen in M1 oder M2 mit 1 μM CNABD inkubiert wurden steigenden Konzentrationen von LLO ausgesetzt und der kinetischen Test für 30 min bei 37 ° C. Daten werden ausgedrückt als CNABD Intensität (ICNABD) im relativen Fluoreszenz Einheiten (RFU) ± SEM (B) der Z-Faktor und streng standardisierten mittlere Differenz (SSMD), als eine Qualitätsbeurteilung für die Robustheit der Membran-Reparatur berechnet wurden Test, mit der Fläche unter der Kurve (AUC) als Metrik für die kinetischen Kurven42,43,44,45. Die resealing Wirkungsgrade wurden berechnet, wie in den Abschnitten Protokoll und Ergebnisse beschrieben (n = 3 unabhängige Experimente, jeweils im Triplicates durchgeführt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Zelle Desipramin verursacht Fehler in Wiederverschließen. H2B-GFP HeLa-Zellen (plattiert in vervierfacht) wurden mit vorbehandelt 30 μM Desipramin (oder nicht) für 1 h bei 37 ° C und dann ans 0,25 oder 0,5 nM LLO im Beisein von 1 μM CNABD in Ca2 +-enthalten (M1) oder Ca2 +-frei (M2) Medium. Zellen wurden abgebildet (Pre- und Post-kinetische) und der kinetischen Test bei 37 ° C für 30 min. (A) Zellen aufgezählt wurden; Daten ausgedrückt werden, wie durchschnittliche Zelle zählt ± SEM (B) CNABD Fluoreszenzintensität (ICNABD) relative Fluoreszenz zum Ausdruck kommt, die Einheiten (RFU) ± SEM (C) Resealing Effizienz in an- und Abwesenheit von berechnet wurden Desipramin. Eine gemischte Effekte-Modell wurde auf Log-transformierten Intensitätswerte vorausgesetzt, eine zufällige abfangen für jede technische Replikation verwendet. Um sowohl eine Verschiebung zu erfassen und in Form der kinetischen Kurven ändern, wurden die wichtigste Auswirkung der Behandlung Zustand und den Effekt der Interaktion zwischen Behandlung Zustand und Zeit gemeinsam für statistische Signifikanz getestet. Eine zweiseitige Student t-Test wurde zur Zellenzahlen von erworbenen Bilder zu analysieren. Der p-Wert wurde mit der gemischte Effekte-Modell errechnet. (4 Technische repliziert, einem Experiment). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Imaging Cytometer Emission Channel Spezifikationen
Fluorophor Fluorophor ex / Em (nm) Grün-Kanal (ex / Em ± Bandpass, nm) Rot-Kanal (ex / Em ± Bandpass, nm)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tabelle 1: GFP, PI und CNABD Anregung und Emission Gipfeln und die grüne und rote Kanal Anregung und Emission Bandpässe für die Bildgebung Cytometer.

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Discussion

Dieser Test misst die Effizienz der Membran Wiederverschließen auf Bevölkerungsebene Zelle mit hoher Durchsatzleistung. Es kann verwendet werden zum Bildschirm für zellulären Komponenten oder Droge-Bibliotheken, die Membran Reparatur beeinträchtigen könnten. Der beschriebenen Test verwendet eine 96-Well-Plattenformat, aber es kann auf 384-Well-Platten für höheren Durchsatz angepasst werden. Ein Vorteil dieser Assay ist seine Fähigkeit zur Fluoreszenz-Messungen von anhaftenden lebenden Zellen in Echtzeit ohne übermäßige Zelle Verarbeitung wie Zelle Ablösung, Fixierung oder Fluoreszenz Kennzeichnung nach Fixierung zu erhalten. Multimode Platte Leserinnen und Leser, wie die in diesem Protokoll verwendeten haben ausreichenden Empfindlichkeit für schnelle Spectrofluorometric Messungen in zeitlichen Intervallen so niedrig wie 30 s für eine 96-Well-Platte. Die Übernahme von Fluoreszenzbilder enthält zusätzliche Informationen, einschließlich Zelle Aufzählung, eventuelle Änderungen in Zellmorphologie und mögliche Identifizierung unterschiedliche Zellpopulationen. Der vorliegende Test begründet nicht die Kinetik der Plasmamembran Wiederverschließen der Ebene der einzelnen Zelle, sondern identifiziert Versuchsbedingungen (pharmakologische Verbindungen oder zellulären Komponenten), die, positiv oder negativ, den Prozess der beeinflussen können Membran Wiederverschließen der Ebene der Zelle Bevölkerung.

Mehrere andere experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um die Membran Wiederverschließen Mechanismen zu beurteilen. Z. B. mechanische Störungen durch Microneedle Punktion, Wulst Abrieb und Laser-Ablation werden mechanische Membranschäden modellieren. Die Messung der Verwundung/Reparatur engagiert sich Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow-Zytometrie durch Quantifizierung des Eintrags fluoreszierende Sonden (FM 1-43, Propidium Jodid, Fluorescein konjugiert Dextrans) oder fluoreszierende Protein Chimären47 tracking ,48,49,50. Jeder dieser Ansätze hat seine eigenen Vorteile; Sie sind jedoch nicht offen für Hochdurchsatz-Screening in lebenden Zellen, wie in diesem Assay präsentiert.

Der vorliegende Test wurde optimiert, um die resealing Effizienz der Zellen durch die Pore-forming Protein LLO, welche Formen große Poren, die Ca2 + diesen Zustrom zu ermöglichen, wie durch mechanische Brüche der Plasmamembran provoziert verwundet zu analysieren. Obwohl Pore bilden Toxine eine Form der Plasmamembran Schäden, Reparatur von großen Toxin Poren sind und mechanische Wunden vorgeschlagen wurden, um gemeinsame Ca2 +teilen-abhängige Signalwege17,51. Es ist wichtig festzustellen, dass LLO Interaktion mit Zellmembran Komponenten wie Cholesterin Zelle Signalisierung beeinträchtigen und dadurch Membran Wiederverschließen Mechanismen im Vergleich zu mechanischen Wunden beeinflussen kann. Unser Wissen über die Membran Reparatur ist immer noch begrenzt und weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob Wiederverschließen von mechanischen Wunden unterscheiden sich von Wiederverschließen nach Entstehung des Toxins Poren. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von LLO. Erstens kann die Einleitung der Membranschäden synchronisiert werden, durch erhöhen der Temperatur von 4 bis 37 ° C. Zweitens, die lösliche Form LLO (nicht an die Zellmembran gebunden) irreversibel Aggregate bei neutralem pH-Wert und 37 ° C, somit zytotoxische Wirkung zu begrenzen und Aufhebung der Notwendigkeit, die Zellen zu waschen. Zu guter Letzt kann der Grad der Schädigung durch die Variation der Konzentration des Toxins eingestellt werden. Allerdings ist eine Einschränkung des Assays der Temperaturschalter zwischen 37 und 4 ° C, die beeinträchtigt die Repair-Mechanismus wie vesikuläre Transport, Endozytose und Membranfluidität, unter anderen Prozessen, die durch Temperatur52beeinflusst werden, 53,54. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass pharmakologischen Inhibitor enthalten in der Probe mit der Gründung der LLO Poren nicht stört, durch Ausführen eines Hämolyse Assays in der Gegenwart (im Gegensatz zu fehlen) des Medikaments55. Durch Potentialdifferenzen Batch LLO Tätigkeit ist es wichtig, einen Vorrat an LLO vorzubereiten, das groß genug für einen gesamten Hochdurchsatz-Bildschirm55.

Wir enthalten die Verwendung von Zellen, die mit dem Ausdruck der nuklearen lokalisiert Histon-2 b-GFP Chimäre als ein Mittel, um die Zellen vor und nach der Membran Reparatur Assays mittels mikroskopischer Imaging gefolgt von Bildanalyse automatisierten aufzählen. Wichtig ist, entsprechende Zelle zählt über Bedingungen und unveränderlichen Zelle zählt vor und nach der kinetische Test sind von entscheidender Bedeutung, wie PI oder CNABD-Fluoreszenz-Intensitäten nicht einfach normalisiert werden. In der Tat führt ein Unterschied in der Anzahl der Zellen in Unterschiede im Grad der Beschädigung durch eine bestimmte Konzentration von LLO, wodurch für über Fluoreszenz Normalisierung aufgrund von Schwankungen Wiederverschließen Effizienz (Abbildung 7) korrigiert werden kann. Wir haben gezeigt, dass Histon-2 b-GFP Ausdruck PI oder CNABD Einbau oder Fluoreszenz-Emission nicht stört. Umgekehrt wirkt PI oder CNABD Einbau nicht GFP-basierte Handy-Enumeration. Wenn andere Kombinationen von Fluorophore eingesetzt werden sollen, wäre es notwendig, mögliche spektrale Überlappung zwischen den Fluorochromes, zu bewerten, da in dieser Arbeit durchgeführt wurde. Auch wenn PI weitgehend Membranschäden Messen verwendet worden ist, zeigen wir, dass CNABD ist ein ausgezeichneter Ersatz, der höhere Quantenausbeute der Fluoreszenz, weist einen größeren Dynamikbereich geeignet zur Charakterisierung Wiederverschließen Effizienz führt.

Z-Faktor und SSMD bestätigt, dass dieser Test die Robustheit notwendig, Hochdurchsatz-Analysen durchzuführen. Die Berechnung der resealing Effizienz ist eine kritische und zuverlässiges Werkzeug, mögliche Treffer zu identifizieren. Darüber hinaus kann das gemischte Effekte-Modell als ein statistisches Werkzeug auszuwertende Treffer innerhalb einer einzigen Assay verwendet werden. Der Versuchsplan muss ein Minimum von drei technischen Wiederholungen enthalten, wenn der Bildschirm kann mehrmals wiederholt werden. Quadruplicates sollte verwendet werden, wenn statistische Werkzeuge, wie z.B. das Modell gemischte Effekte sind in einem einzigen Experiment aufgenommen werden, unabhängig davon, ob es wiederholt werden soll. Es wird jedoch empfohlen, den Bildschirm mehrfach durchzuführen und die Ergebnisse zu validieren, indem Sie ergänzende Experimente durchführen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir bestätigen Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) für freundlicherweise ermöglicht es uns, seine Multi-Mode-Erkennung-Plattform für einige Vorversuchen zu nutzen. Forschung berichtet in diesem Artikel wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases von den National Institutes of Health unter Prämiennummer RO1AI107250, Stephanie Seveau unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

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Immunologie und Infektion Ausgabe 143 Plasmamembran Wiederverschließen Membran-Reparatur Muskeldystrophie Propidium Jodid Carbocyanine Nukleinsäure binden Farbstoff Pore-forming Toxin Listeriolysin O
Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen
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Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

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