Summary
多くの治療法や遺伝的変異性成熟と不妊治療のタイミングに影響を与えます。このプロトコルでは、マウスおよびラットの性成熟動物で不妊治療研究を設定する前に思春期の発症を評価する非侵襲的な方法について説明します。
Abstract
生殖能力の評価は、治療や生殖の軸は、視床下部-下垂体-性腺軸とも呼ばれますに遺伝子操作の影響を理解する重要です。生殖軸は再生のための有利な条件に不妊治療の適応環境と内部の入力のキー インテグレーターです。マウスおよびラットの不妊治療研究に着手、前に性的に成熟を観察される生殖表現型に起因する可能性を除外する評価遅延または不在の思春期発症。このプロトコルでは、膣口と最初の発情を女性、男性包皮分離の決断のもとで思春期の発症を評価する非侵襲的なアプローチについて説明します。思春期の補完と性的成熟度の達成の確認後不妊治療研究を開始できます。プロシージャには、マウスとラット、不妊研究をセットアップする方法を評価し、治療や遺伝子欠失の肥沃度の影響があるかどうかを判断するパラメーターに最適な飼育条件がについて説明します。
Introduction
思春期までの移行は、性的成熟と生殖能力を達成するために必要です。思春期の転移と成人期の肥沃度の維持は、視床下部-下垂体-性腺軸 (図 1) とも呼ばれます、生殖軸によって調整されます。思春期発症のタイミングと肥沃度の維持が子孫、親1,2の生存の可能性を高めるための内部として環境要因によって堅く調整されます。このプロトコルはマウスおよびラット生殖能力を評価するために不妊治療研究を設定する前に性的に成熟を確認する思春期の発症を決定する非侵襲的なアプローチを提供します。
不妊治療研究性成熟動物でされるので、動物は思春期を経て後開始することができます。思春期の発症する前に生殖の軸は静止、思春期 (図 1) を開始する不十分な量で下垂体に性の成熟、性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) のキーのドライバーがリリースされます。思春期の発症は、正中隆起の GnRH 放出の増加の結果複雑なプロセスです。GnRH は黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモン (FSH) の分泌、下垂体から生殖腺の成熟と生殖機能 (図 1)3,4,5に不可欠な 2 つのホルモンを促進します。.
生殖軸への侮辱減らされた豊饒とも事前または遅延思春期発症することができます。内分泌撹乱化学物質6,7体の増加/減少体重1,8の変更への露出のような思春期の発症と生殖能力のタイミングに影響を与える知られている状況日長2,9と遺伝的変異10,11,12,13,14,15。
性的成熟度の発症は、不妊治療法を設定する前に完了する必要がある重要なステップです。採血や動物16,の犠牲を必要としない場合、包皮分離、腟口、最初の発情思春期発症の決定の利点はこれらのプロシージャの非侵襲的な特性17。
思春期の発症を決定したら不妊研究を正しく設定生殖軸の整合性に関する重要な情報を提供して通常 (改良) のさらなる研究のための実験動物の生成の 2 番目の利点は、18します。 このプロトコルで記述されている不妊治療研究のセットアップは男性と女性の生殖能力のマイナーおよびメジャーの赤字を検出できます。キー パラメーター評価 1) 最初のごみ、2) 所定の時間枠と 3) ゴミの大きさで生成リットル数時間が含まれます。最後に、フォロー アップの不妊治療障害の原因を識別するために行なうことができる研究の種類に関する推奨事項が含まれます。
記述されていたプロトコルはマウスと代表のデータ反映トランスジェニック マウスでの作業。ただし、含まれているすべてのプロトコルはラットで均等に有効です。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは機関動物ケアおよび使用委員会のミシガン州立大学によって承認されケアと実験動物の使用のためのガイドに従って実施します。
1. 思春期の発症を決定します。
- 最低限の衣服制度ガイドラインに従ってください、きれいな白衣と清潔な手袋を着用する必要があります。常に清潔な手袋を着用してマウスを処理します。
- テーブルの上にパッドを配置することによって作業領域を準備します。
- パッドの上向きグリッドとクリーン マウス ケージ上部に配置します。
- 作業領域のスケールを設定します。規模と風袋をクリーンの 500-1000 mL ビーカーを置きます。
- 作業領域は、レコードの体重と包皮分離、膣開口部または最初の発情の横にシートを配置します。
- 研究用マウスを識別します。思春期に達するまで思春期発症の日常点検を実行します。研究を通して一日の同時検査を実行します。思春期の発症は早ければ生後 11 1219, 発生する可能性がしかし、最も実験的設定で思春期発症の監視が始まります 〜 22 日.
- (ステップ 1.2) 作業領域にマウス ケージを配置します。ケージを開き、テーブルの上のふた、水のボトル、食品ホルダーを配置します。
- 雄マウスの包皮分離を決定します。
- 尾、マウスを押しながらステップ 1.2.1 からクリーン マウス ケージ上に配置します。テールから軽く押し、ながら聞かせて 〜 5 のケージ上部のグリッドを探るマウス s。
- そっと尾を引いて後方。これは通常その脚でグリッドに保持しながら前進動物で起因します。皮膚へのアプローチ他の手には首と耳が近くです。
- 肩と首を親指と人差し指の間のたるんだ皮膚を把握します。それは噛まないようにしてその頭を回ってからマウスを防ぐ、皮膚の良いホールドを得ることが重要です。
- 残りの指で背中の皮膚をつかんで手を押すことによってそれを保持します。呼吸、血流、または有害な骨は、筋肉や皮膚を妨げることがなくしっかり保持します。手の手のひらにマウスの背中を支えながらマウスの腹を公開する手をオンにします。
- 無料の手でゆっくり押し戻しますペニスの周りの皮膚を行わず。包皮分離で包皮の皮膚はスライド後方陰茎亀頭(図 2 a、包皮分離を示す矢印) を公開します。包皮分離の有無を記録します。
- ゆっくりステップ 1.2.2 から 500-1000 mL ビーカーにそれを配置することによって、マウスの重量を量る、重量を記録します。
- ケージの床にビーカー 0-2 cm を保持することによって住宅ケージ内マウスを再導入し、独自に終了するマウスを許可するビーカーの上ゆっくりとヒントします。きれいに水と中性洗剤でビーカーとスケールにそれを返すとスケールを風袋の前にそれを乾燥させる。
- 雌マウスの膣に開口部を決定します。
- 作業領域 (ステップ 1.2) に綿ボール、ビーカーと滅菌水のボトルを置きます。ビーカーに水を注ぐ。滅菌水でコットン ボールを湿らせるし、ステップ 1.2.1 からケージ上部の横に配置します。
- (ステップ 1.2) 作業領域でマウス ケージを配置し、尾の根元を持ち、ホーム檻からケージ上部 (ステップ 1.2.1) へマウスを転送します。軽くマウスの前方への動きを奨励する尾部を引き戻します。
- 無料の指を使って腰をサポートしながら、尾を持ち上げます。ケージの上部が付いている接触を維持するために後肢を許可します。マウスがあまりにも多く、それを保持する、手 1.5.1-1.5.4 の手順で説明するように。
- ゆっくりステップ 1.6.1 から水加湿コットン ボールで外陰部をきれいに。各マウスのクリーン加湿コットン ボールを使用します。膣口、外陰部を検査、膣が完全に開いているかどうかを判断する (図 2 a、女性の膣口)。
- 膣口が発生した場合に記録します。マウスの重さし、手順 1.5.6-1.5.7 で説明したよう、ホームのケージに戻る。
- 最初の発情初回排卵のインジケーター。
- 作業領域 (ステップ 1.2) に滅菌水、ラベルの付いたガラス スライド クリーン チップ 200 μ L ピペットとビーカーを置きます。
- 手順 1.6.2-1.6.3 で説明したように女性を保持します。膣の開口部に滅菌水の 〜 50 μ L を含むピペットの先端を配置します。
- 優しく膣壁から導入し、2-4 倍 〜 50 μ L の水を再吸収によってセルをフラッシュします。ラベルの付いたガラス顕微鏡スライド上にピペット チップからコンテンツを塗りつけます。
- 慎重に 10 倍または 20 × 対物を用いた明視野顕微鏡で細胞の形態を観察または ~ 1 h の汚れセンサーをしましょうと、対比染色 (ddH2O に溶解) 0.1% メチレン ブルー溶液で (図 2 b)。0.1% メチレン ブルー溶液に乾燥したスライドを浸し、対比染色に 〜 30 s。スライドの空気を 1 時間乾燥してみましょう。
- ステップ 1.7.4 10 X、20 X の明視野顕微鏡のスライドを確認します。発情周期 (図 2 b) の 4 つの段階を区別することができる細胞の形態を観察することによって発情周期 (図 2 b)20のステージを確立します。
注: Metestrus は、白血球と核の上皮細胞と角化上皮細胞 (図 2 b) による発情の混合物によって角化扁平上皮細胞、白血球、白血球による発情、proestrus の混合物によって特徴付けられます。20。 - 体重を記録し、手順 1.5.6-1.5.7 で示すように、その家のケージにマウスを返します。腟脂膏ときマウスが (図 2 b)、最初の発情日に終了します。
2. 望ましい飼育部屋条件
- 飼育室が温度 20 〜 24 ° C、55 ± 10% の湿度と同種ルーム 300 〜 400 の強さの光ルクス床21の上方約 1 m。この光の強度には、望ましい 25 80 ルクスの中期ケージ光強度ことができます。光の強度をテストするには、照度計を使用します。
- 実験全体の照明の適切なタイミングを確保するための飼育室で照明を制御するのに自動システムを使用します。光と 10 h の闇 (LD14:10) のための21の 14 h で「夏のような"条件に 12 h 日 (12 h 光と闇 12 h、LD12:12) からの齧歯動物の範囲で不妊治療を評価するために最適な日長条件。
- 繁殖ケージを準備します。
- 蓋、水、食糧、寝具および繁殖ペアあたりネスト クリーン マウス ケージを準備します。
- セックスを含むすべての必要な情報とケージのカード記入生年月日、マウス株とを交配を設定するときの日付。
3. 不妊治療研究
- 不妊治療研究に使用される動物を識別します。動物が性的に成熟した (ステップ 1) であることを確認します。マウスにおける不妊治療を設定する一般的に使用される年齢は、年齢は、ほとんどの実験条件で性的成熟が完了した、年齢 10-16 週です。
- きれいなテーブル ステップ 2.3 で準備飼育ケージを配置します。
- キャッチし、マウスを押したまま。
- ゆっくりとマウス ケージに手袋をはめた手を紹介します。手袋と手の香りに合わせてマウスを許可する短い期間 (5 ~ 30 秒)、ケージに手をおきます。多忙なぎくしゃくした動きを避けます。
- ケージの底に近いカップ状の手を下げ、ゆっくりとマウスにそれに近づきます。彼らはすぐに実行されます。手を実行するときは、親指と人差し指の間の 1 つのマウスの尾をトラップします。
- 2-3 s の尾によってマウスを持ち上げます。マウスより長く保持される場合、尾を保持し、尻尾にホールドを維持するカップ状の手でマウスを置きます。
- 尾 (ステップ 3.3) でそれらを保持することによって繁殖ケージに 1 男性とその後 1 女性を転送します。不妊治療法を設定するとき、女性同じ発情期にいるを確認します。ステップ 1.7 に従って膣スミアを実行することによって、女性の発情期を決定します。
- ケージを閉じてマウスが食料、水、ネスティング材料を持っていることを確認します。ケージ ケージのカードとケージのカード ホルダーに取り付けます。
- ハウジング ラックに飼育ケージを配置します。不妊研究の全期間放置飼育ケージとしてできるだけ妨げられていません。30 日間の不妊治療の研究を行います。各繁殖ペアの詳細記録を保つし、1) セットアップ交配日、2) 出産した日、3) 死者と生きている子犬を含む生まれ、子犬の数に注意してください。研究を通して毎日トイレ チェックを実行します。
- 不妊治療を長引かせる手順 3.6 で追加の 30-60 日ない場合や不妊治療に対する弱い影響の研究が確立されます。
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Representative Results
これらの結果は、転写因子腹側前部ホメオ 1 (Vax1) ヘテロ マウス (HET)13、またはVax1 とここで呼ばれる 1 つの対立遺伝子に全身でされている 2 つの異なるトランスジェニック マウス モデルから内 GnRH ニューロン22、ここで条件付き KO (cKO) と呼ばれる条件付きで削除されています。不妊治療研究を設定する前に、すべてのマウスで思春期の発症を確認することが重要です。
まず、日および腟口と包皮分離で重量は確立されました。ヘット マウスの腟口と包皮分離の同じ年齢とコントロール マウスのように体重で発生した (図 3 aとF、それぞれ)。対照的に、膣口と包皮分離大幅 cKO 女性と男性で遅延され、増加体重に関連付けられている (図 3 bとG、それぞれ)。思春期の発症はある程度の体重に関連付けられている、これは特に女性23で。調べるには腟口と包皮分離の遅延が体重増加の遅れに関連付けられていたかどうか、膣口とコントロール (4.5 週齢) 包皮分離の平均年齢で体重を男性に cKO の体重比較男女 4.5 週齢で。4.5 週の年齢で女性のコントロールと cKO は、cKO 男性いたコントロール (図 3 H) よりわずかに重いに対し同等のボディ重量 (図 3) をあった。これは、膣開口部の遅延と cKO 包皮分離の体重増加の遅延に関連付けられていないことを示します。
膣口は、性的成熟と発情、最初の排卵が発生したインジケーター思春期17竣工のマーカーの初期マーカーです。ヘットと cKO 女性はコントロールと同じ年齢と体重で最初の発情を到達したかどうかするには、最初の発情 (図 3Eおよび3 D) まで膣に開口部の日から毎日腟脂膏を行った。ヘット マウスの発情と最初の発情で体重はコントロールと HETs (図 3 D) 間で比較しました。対照的に、cKO 発情サイクルを通じて進行しなかったし、80 日 (図 3E) の年齢で最初の発情はありませんでした。この遅延は、減少、体重 (図 3E) が原因でした。
思春期発症の確認とヘット マウスは不妊研究を設定する使用されました。不妊治療法は、12 h 光およびトランスジェニック マウス c57bl/6 j の遺伝的背景に 12 h 暗い条件 (LD12:12) に設置されました。マウスが実験開始時 10-16 週間高齢者。マウスの 4 つのグループが調べた: 交配 (WTxWT) をコントロール、ヘット女性 (WTxHET)、WT 女性 (HETxWT) とヘット男性とヘット女性 (HETxHET) とヘット男性と男性を制御します。最初に、3 カ月で生成された仔の数が定められました。われわれのコントロール (WTxWT) は、ヘット男性コントロール女性 (HETxWT 交尾、図 4 a) とペアに匹敵する 3 カ月で 2.8 リットルの平均を生成しました。ヘット女性 WT 男性 (コントロール) または男性、ヘットと対になっているかどうかで生成された大幅に少ない仔 3 月不妊治療研究ヘット女性が subfertile13であることを明らかに。CKO マウス、どこ包皮分離 (図 3) が遅れていた男性と女性が彼らの最初を持っていなかった不妊治療法を設定する前に思春期の発症を確認することの重要性を示すためには、生殖能力が評価されました。年齢 (図 3E) の 80 日で発情。不妊研究を設置 > 男性いた包皮分離後 1 週間で女性に > 80 日齢。70 日間不妊研究の中にわれわれのコントロールは 2.2 リットルの平均を生成から生成されたくずがないに対し、女性の cKO WT 男性とペアになってまたは cKO 男性これらのマウスを示すコントロール (WT) 女性 (図 4 b) とペアになって不妊5,22はします。
ヘット女性の不妊の表現型を特徴付けるより、最初のゴミを生成するにかかった日数を記録しました。WTxWT 交配は平均 22 日 (図 4)、WT 女性とペアになってヘット男性に匹敵する彼らの最初のごみに生成されます。WT 男性と共にヘット女性 HETxHET 交配 (図 4) に類似していた彼らの最初のごみを生産する 58 日間の平均を取った。しかし、ヘットの女性の最初のごみを生成する際に遅延は非常に異種との表現型、半浸透度と HETxHET 交配13, 受精率低下に HET 雄の貢献を示唆 HETxHET 交配により遅延.
くずサイズの評価は、排卵・着床と精子の生産に関する重要な情報を与えることができます。最初 3 リットルの平均サイズを決定します。興味深いことに、すべては生産の組み合わせ (WTxHET、HETxWT、HETxHET) コントロール (WTxWT、図 4) と比較して大幅に小さい仔を嵌合、両方の男性と女性のヘット マウス、subfertile を見せてします。
図 1: 視床下部-下垂体-性腺軸は、性的成熟と生殖を制御します。生殖軸の頂点では、キスペプチン視床下部ニューロン (黄色の円) および性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) ニューロン (緑の円)。幼齢期 (思春期)、キスペプチン ニューロン GnRH ニューロンに少しキスペプチンをリリースします。思春期の発症後キスペプチン発売 GnRH ニューロンが (ポスト思春期) で補強されています。少年時代後期に GnRH 放出の増加は、黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激成人期における生殖腺の成熟と生殖機能につながる、下垂体からのホルモン (FSH) リリースを大幅に増加します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウスにおける思春期発症の定量します。マウスにおける思春期発症の外部マーカーは、 (A)包皮分離, 男性と女性で開く膣です。スケール バー = 1 cm。 (B)の例の画像から膣洗浄の最初の発情期を決定するために使用します。スライドが 30 counterstained 0.1% メチレン ブルー、airdried と s と 20 倍の倍率で観察。黒い矢印を示す核の上皮細胞、黄色矢印黒のアウトラインを示す白血球、白い矢印を示す角化上皮細胞。最初の発情は、膣開口部の後 10 日目で発生しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 思春期発症の研究から生成される代表的なデータ。(B)膣口とトランスジェニック マウス モデルの膣にオープニングでの重量。(C)重量コントロールと cKO 女性 4.5 週。(D, E)年齢と体重で発情。(F, G)年齢と包皮分離の体重。(H)体重コントロールと cKO 男性で 4.5 週。データを表すことを意味 ± SEM. N = 5-10 グループ、統計分析学生の t テストあたり。p< 0.01;p< 0.001。これらの数字は、前文書13,22から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な事例の分析、不妊からトランスジェニック マウスの。肥沃度評価(A) Vax1 ヘット ハツカネズミと cKO (B)は処女 10-16 週齢のマウスで行われ、示された時間枠のリットル数を記録しました。データを表す手段 ± · ダネットの多重比較検定が続く一方通行 ANOVA で SEM. 統計分析を行った。*p< 0.05;p< 0.001。(C)日の最初のごみの数 (n = 5-12)、および最初の 3 リットルの(D)平均くずサイズ (n = 10-13) 決定しました。データを表す WT に比べて学生の t テストによって SEM. 統計分析を行ったことを意味 ± 重量 x *p< 0.05;p< 0.01。これらの数字は、前文書13,22から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 不妊治療法を設定します。(A)育成スキームと不妊のアッセイに必要な動物の候補数の例です。ようと両方の男性と女性の不妊治療を評価する、高脂肪食と KO またはコントロールの食事コントロールが 2 つの条件で研究に必要な動物の数: 交尾 (1 男性 1 女性 x) 各グループ x 2 条件 x 2 性別 8 動物 x あたり 2 マウス(両方の男性と女性の生殖の評価) に s = 64 の動物研究の合計。男性と女性の生殖の勉強を並行している場合コントロール交配 x コントロールの 1 つのセットは通常両方の男性と女性の生殖への影響を比較する使用できます。(B)不妊治療法を設定する際使用マウスを成熟に達している必要があります。マウスの異なった緊張生殖特性が異なるし異なる年齢24で性的に成熟に達する。ラットについては、以前の文書25を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マウスの全面的な福利は成功した不妊試金21にとって重要です。不妊治療法を実行すると、物理的にマウスを毎日チェックこれはストレスを引き起こす可能性があることが重要です。これらはストレスも、さらにケージの頻繁な変更を避けます。理想的には週に 1-2 回以上ケージの変更が行われます。暗い段階露光夜行性の齧歯動物の繁殖に悪影響します。暗い時間の間飼育室でライトを切らないでください。暗い時間の間に部屋にエントリが必要な場合赤薄明かりの照明を使用します。別のストレス過剰な悪臭、振動やノイズ研究のすべてまたは一部のビバリウムでの存在であります。ストレスの緩和し、マウスの健康と繁殖の向上が、濃縮の材料または他の型の入れ子マウスを与えます。巣作りはマウスで重要な動作で、繁殖成功を高めます。巣はまたマウスを非表示にし、再生する場所を許可します。健康で栄養状態が良く動物の品種がよく、したがって自由への高品質の食品と水を提供するために重要です。繁殖ペアなど皮膚炎 (c57bl/6 j で頻繁に)、歯の不正咬合等の疾患の症状を示すように開始する場合は、研究からこれらのマウスを除外します。さらに、研究は、免疫不全マウスで行われている、キー マウスの部屋は妊孕性温存にきれいです。
不妊治療研究を適切に設定、研究、処女マウスで行われるか実績のあるブリーダーと同様に慎重に選択コントロール交配用マウスかを決定することが重要です。われわれのコントロールは、実験のブリーダーと並行して実行する必要があります。これは不明なまたは予期しないストレッサーとして不可欠と環境の変化が繁殖率の変化を引き起こすことができます。われわれのコントロールは、優先的に実験的マウス (図 5 a) のごみの仲間の構成されます。繁殖マウス系統 (図 5 b) 間の特性に大きな変化による混合の遺伝的背景を持つマウスで不妊治療の研究が行われるとき、これは特に重要です。
受精率低下の表現型を識別するはその原因を明らかにするための研究とその他のパラメーターを分析する必要性の長期の長さのために挑戦することができます。代表的なデータでヘット マウスはささやかな受精率低下の表現型 (図 4) の良い例、男性受精率の低下を識別するために必要な拡張の解析。代表結果(図 3および4) に示すとおり、通常思春期の発症 (図 3 a D、およびF) が (図 4 a, C, D男女ともに受精率低下を関連付けることができます。).この場合、マウスはサブ肥沃なだけだった、従って調査の長さは 120 日に延長だった。これは短い不妊治療研究として重要 (e.g。 60 日) 表現型を明らかにすることができるされていないと思います。男性受精率の低下、控えめだったし、最初ときに明らかに HET 男性 subfertile (図 4 a) でもあったヘット女性と対になった。確かに、同腹子 (図 4) の平均サイズを評価する際、HET 雄の受精率低下が確認されました。フォロー アップの研究は男性受精率の低下を確認し、運動精子13〜 80% 削減とヘット男性の悪い精子の質を明らかにしました。
時思春期発症の主要な遅延を用いるマウスの研究出生と思春期の発症を実行する (> 5 日間)、思春期発症26を規制するさまざまな要因を考慮することが重要です。膣口と発情ラットにおける付随して起こるほとんどの場合、マウスの発情には通常後膣口25,27〜 10 日が発生します。したがって、ラットおよびマウスの18,28で作業するとき、膣口と最初の発情が確立されていることを確認することをお勧めします。思春期の発症は代謝状態と体重女性と男性1,7,9,29のマイナーな程度にリンクされなど、治療や遺伝子変異動物の成長鈍化が遅発思春期性の結果となるケース。思春期発症の遅延/進歩は高速/低速の成長と関連付けられるかもしれない場合を決定するには、思春期発症の評価時に毎日マウスを比較検討することが重要です。図 3 b Cと同様、 GおよびHに見られる、思春期発症の遅延減少、体重と関連付けられなかったが本当の遅延は、生殖腺組織およびホルモンの循環によって確認として、思春期の発症レベル22。思春期発症のマーカーは、両方がしばしば起こる機構により時間をかけて最終的に以外と包皮分離と膣に開口部を使用しての主要な制限の 1 つは生殖軸18,の活性を増加30,31 (図 1)。この例は、cKO 女性 (図 3 b) の遅延膣口です。CKO 女性は決して排卵22 (図 3E) の不在のために肥沃になります。確かに、さらにホルモンのレベル、cKO マウスの生殖腺組織を評価する試験を示したこれらのマウスは決して完了する思春期、不妊22 (図 4 b)。これは思春期の発症を決定する外部のマーカーを使用しての制限を示しています。思春期の性的成熟に達する所要増加の GnRH リリースと生殖軸 (図 1) の活性化と完全に性的に成熟を確認する生殖腺形態と血中ホルモン濃度の両方を評価する必要22,31. 男性のテストステロンの測定と精嚢サイズと精巣の形態および精子の質だけでなくサイズを評価確認思春期だった達成16,22,32。女性で思春期17,19,22,33の完了の確認、子宮と卵巣の重量、形態との組み合わせでプロゲステロンとエストロゲンのレベルを測定します。
くずサイズは在胎および思春期の手始めの年齢の両方に影響します。ほとんどのマウス系統 18 〜 22 日の妊娠期間があります。しかし、母は大ごみ、期待して妊娠期間は減少34,35傾向します。その一方で、母親看護前ごみとは場合、これは5妊娠期間の延長につながります。大きい仔仔も思春期の発症を遅らせている傾向にあります。これは原因の成長で少し遅れて1,9,34,35。不妊治療研究が実行された場合、マウスのグループの 1 つ (コントロールか実験) 非常に大きいくずを生成くずサイズとも呼ばれます、殺処分に匹敵するサイズを持っている勉強の仔を許可するを均質化をお勧め。
再現評価体内の複数の臓器 (図 1) の複製に関与して生殖軸3を制御する広範なフィードバック機構のためできるだけです。生殖能力の特定の側面は、膣に栓のアッセイは、女性をマウントし、膣の物理的なプラグのまま男性の容量は13、36を観察を通じて急速に評価できます。これは、男性の性的行動を評価するために有用なアプローチ、研究のこのタイプは、再生、マイナーな問題の検出を許可されません。 また、それを評価する親の行動や結果の一腹時間の長い期間のための地力の維持。ここで説明されているプロトコル接続分析、主要な多くの利点を提示されてマイナーおよびメジャーの影響 (図 4) 男女の生殖能力を識別する能力。
不妊治療は年齢とともに減りますなり、さらに女性の発情周期より長く、不規則な高齢化5,28中。したがって、ヤングで不妊治療の研究を開始し、性的成熟動物ことをお勧めします。不妊治療研究を設定する一般的に使用される年齢の範囲は、10-16 週齢です。ただし、別のマウスまたはラット系統 (図 5 b) 間生殖と性的成熟度に大きな差異が存在する、研究で使用されるマウス緊張の特定の生殖特性に精通することが重要です。JAX マウス フェノーム情報データベース https://phenome.jax.org/ の生殖特性に関する追加情報を見つけることが。長く実行する (> 4 ヶ月) 不妊研究初期の生殖減少、マウスが不妊治療法の最初の 1-2 ヶ月のための普通繁殖可能性がありますが複製前に開始の早期減少をあるを検出することができるという利点があります生後 6 ヶ月。
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Disclosures
著者は、何を開示します。
Acknowledgments
この文書の基礎である初期の作品への貢献の著者に感謝します。おかげでアイトール アギーレ, ジュヌビエーブ E. ライアンとエリカ L. ソエラーさんの原稿を準備をお手伝い。ジェシカそらリーとオースティンあごに原稿に関する技術的な支援ありがとう。H.M.H. は、ユーニス · ケネディ · シュライバー国立衛生研究所の子 & 受賞番号 R00HD084759 の下で健康の国民の協会の人間の開発によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
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