Summary
טיפולים רבים, מוטציות גנטיות להשפיע על התזמון של בגרות מינית ופוריות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית כדי להעריך את התפתחות המתבגר ב עכברים וחולדות לפני הגדרת מחקר פוריות בחיות בגרו.
Abstract
הערכה של יכולת הרבייה היא קריטית להבנת ההשפעה של הטיפול או מניפולציה גנטית על ציר הרבייה, גם כינה את הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים. הציר הרבייה היא אינטגרטור מפתח של קלט סביבתי ופנימיים בהתאמת לפוריות תנאים נוחים עבור רבייה. לפני היציאה על מחקר פוריות עכברים וחולדות, בגרות מינית מוערך לשלול את האפשרות כי הפנוטיפים הרבייה שנצפה נגרמות על ידי עיכוב או נעדר תחילת המתבגר. פרוטוקול זה מתאר בגישה פולשנית כדי להעריך את התפתחות המתבגר אצל זכרים באמצעות הקביעה של ההפרדה preputial, אצל נקבות דרך פתח הנרתיק, ייחום ראשון. לאחר האישור של סיום ההתבגרות, ההישג של בגרות מינית, יכול להיות יזם מחקר פוריות. ההליך מתאר את תנאי גידול אופטימליים עבור עכברים, חולדות, כיצד להגדיר מחקר פוריות אילו פרמטרים כדי להעריך ולקבוע אם הטיפול או מחיקה ג'ין יש השפעה על פוריות.
Introduction
המעבר לבגרות נדרש להשיג בגרות מינית וכשירותם הרבייה. המעבר המתבגר ותחזוקה של פוריות בבגרות מוסדר על ידי הציר הרבייה, גם כינה את הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים (איור 1). העיתוי של תחילת המתבגר ותחזוקה של פוריות מוסדר בחוזקה על ידי גורמים פנימיים, כמו גם הסביבה כדי להגדיל את סיכויי ההישרדות של הצאצאים וההורים1,2. פרוטוקול זה מספקת גישה פולשנית לקבוע המתבגר התחלתה של עכברים וחולדות לאשר בגרות מינית לפני הגדרת מחקר פוריות כדי להעריך את יכולת הרבייה.
מחקר פוריות מבוצעת בבעלי חיים בגרו, ניתן לאתחל לאחר החיות עברו גיל ההתבגרות. לפני תחילת המתבגר, הציר הרבייה היא השבתה הדרגתית, הנהג מפתח של התבגרות מינית, גונדוטרופין – releasing הורמון (GnRH), הוא שוחרר לתוך בלוטת יותרת המוח בכמויות לא מספיקות כדי ליזום גיל ההתבגרות (איור 1). תחילת המתבגר היא תהליך מורכב שתוצאתו שחרור מוגבר GnRH קדושתו החציוני. GnRH מעודד הורמון מחלמן (LH) ואת זקיק מגרה הפרשת הורמון (FSH) של בלוטת יותרת המוח, שני הורמונים חיוניים עבור ההבשלה האשכים ותפקוד הרבייה (איור 1)3,4,5 .
עלבונות לציר הרבייה לגרום הפריון, ויכול גם מראש או עיכוב התפתחות המתבגר. תנאים ידוע להשפיע על התזמון של תחילת המתבגר וכשירותם הרבייה כוללים את החשיפה משבשי כימיקלים6,7, הגוף עלה/ירד במשקל1,8, שינויים היום אורך2,9 , מוטציות גנטיות10,11,12,13,14,15.
תחילת הבגרות המינית היא צעד קריטי זה צריך להסתיים לפני הגדרת וזמינותו של פוריות. היתרונות של קביעת תחילת המתבגר דרך ההפרדה preputial, פתח הנרתיק, ייחום ראשון, הם המאפיינים לא פולשנית של נהלים אלה, כפי שהם אינם מצריכים איסוף דם או הקרבת בעלי חיים16, 17.
לאחר תחילת המתבגר נקבע, הגדרת כראוי מחקר פוריות יספק מידע חשוב אודות השלמות של הציר הרבייה, בדרך כלל יש היתרון השני של יצירת חיות ניסוי ללימודי (עידון) 18. הגדרת המחקר פוריות שמתואר פרוטוקול זה יכול לזהות חסרונות קטנים וגם גדולים ביכולת הרבייה של זכרים ונקבות. מפתח הערכה שפרמטרים 1) זמן ההמלטה הראשונה, 2) מספר המלטות המופקים גודל מסגרת הזמן וחול 3) נתון. לבסוף, המלצות עבור הסוג של מעקב מחקרים אשר יכול להתבצע כדי לזהות את הגורם ליקוי פוריות הינם כלולים.
הפרוטוקול המתואר מתייחס עכברים ומשקפים הנתונים נציג העבודה העכברים הטרנסגניים. עם זאת, כל הפרוטוקולים כלולים תקפות באותה מידה בחולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן מאושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת מישיגן, שנערכו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה.
1. לקבוע את תחילת המתבגר
- פעל לפי ההנחיות מוסדי עבור בגדים, לכל הפחות, יש צורך ללבוש חלוק מעבדה נקייה והכפפות נקיות. תמיד להתמודד עם עכברים לבש כפפות נקיות.
- הכינו את משטח העבודה על-ידי הצבת משטח על השולחן.
- מניחים מלמעלה כלוב עכבר נקי עם רשת כלפי מעלה על משטח.
- הגדר בקנה מידה באזור העבודה. במקום גביע נקי 500-1000 מ"ל על הסולם ואת טרה.
- הנח גיליון ליד אזור העבודה משקל הגוף הרשומה ואת ההפרדה preputial, פתח הנרתיק או ייחום ראשון.
- לזהות עכברים לצורך המחקר. לבצע בדיקות מדי יום עבור המתבגר התחלתה עד גיל ההתבגרות. לבצע את הבדיקה באותו זמן של יום לאורך כל תקופת המחקר. תחילת המתבגר יכול להתרחש מוקדם ככל כמחנכת יום 11-12-19, עם זאת, ב setups האקספרימנטאלי ביותר, תחילת המתבגר ניטור מתחיל ~ 22 ימים.
- למקם את הכלוב העכבר באזור העבודה (שלב 1.2). לפתוח את הכלוב ולמקם את המכסה, בקבוק מים, מזון מחזיק על השולחן.
- קביעת הפרדה preputial בעכברים זכרים.
- בעוד אתה מחזיק את העכבר בזנבו, למקם אותו על גבי כלוב עכבר נקיים מ שלב 1.2.1. כשאני בעדינות מחזיק הזנב, תן את העכבר לחקור את הרשת של הכלוב העליון ~ 5 s.
- משוך בעדינות את הזנב לאחור; בדרך כלל התוצאה החיה לנוע קדימה בזמן שהחזיקו. הרשת עם הרגליים הקדמיות שלה. הגישה היד השנייה על העור מקרבת הצוואר והאוזניים.
- לתפוס את העור רופף בין הכתפיים לצוואר עם האגודל והאצבע. חשוב להשיג אחיזה טובה של העור, כמו זה ימנע את העכבר מסתובב הראש שלו לנשוך.
- . תפוס את העור על הגב עם האצבעות הנותרות והחזק אותו על ידי לחיצה על היד. תחזיק ביציבות ללא הפרעה הנשימה, הדם זרימה או מזיק העצמות, השרירים או העור. הפעל את היד כדי לחשוף את הבטן של העכבר, תוך תמיכה האחורי של העכבר בתוך כף היד.
- עם יד חופשית, דחף בעדינות בחזרה את העור סביב הפין מבלי לכפות. -הפרדת preputial, העור preputial שקופיות אחורה לחשוף את העטרה הפין (איור 2 א, חץ מציג ההפרדה preputial). רישום נוכחות או היעדרות של הפרדה preputial.
- שוקל את העכבר בעדינות זה, להניח הספל 500-1000 מ ל מ שלב 1.2.2 ולהקליט את המשקל.
- להציג מחדש את העכבר בתוך הכלוב לדיור על-ידי החזקת את הספל 0-2 ס"מ על רצפת הכלוב, לאט להתהפך כשהספל ומאפשר את העכבר כדי לצאת בכוחות עצמו. לנקות את. הספל עם סבון עדין ומים, תייבש את זה לפני להחזירו הסולם ואת taring את קנה המידה.
- קביעת פתח הנרתיק בעכברים הנשי.
- מניחים כדור צמר גפן, גביע, בקבוק מים סטרילי באזור העבודה (שלב 1.2). שופכים את המים לתוך הספל. ללחלוח על כדור צמר גפן עם מים סטריליים והצב אותה ליד הכלוב העליון מ שלב 1.2.1.
- למקם את הכלוב העכבר באזור העבודה (שלב 1.2), להעביר את העכבר מכלובה הביתה לפסגה הכלוב (שלב 1.2.1) על ידי החזקתה בבסיס הזנב. משוך בעדינות בחזרה את הזנב לעודד תנועה קדימה של העכבר.
- הרם את הזנב תוך תמיכה המותניים עם האצבעות חינם. אפשר את hindlimbs לשמור על קשר עם החלק העליון של הכלוב. אם העכבר זז יותר מדי, החזק אותה ביד כפי שמתואר שלבים 1.5.1-1.5.4.
- בעדינות לנקות הפות עם הכדור כותנה humidified מים מ שלב 1.6.1. השתמש כדור צמר גפן נקי humidified עבור כל עכבר. כדי לקבוע את פתח הנרתיק, לבחון את הפות, לקבוע אם הנרתיק היא פתוחה לחלוטין (איור 2 א, פתח הנרתיק הנשי).
- להקליט אם אירעה פתח הנרתיק. שוקל את העכבר ולהחזיר אותה לכלוב הביתה כפי שמתואר שלבים 1.5.6-1.5.7.
- ייחום ראשון מחוון הביוץ הראשון.
- מניחים גביע במים סטריליים, זכוכית עם תוויות על פיפטה 200 µL עם טיפ נקי באזור העבודה (שלב 1.2).
- החזק את הנקבה כפי שמתואר בשלב 1.6.2-1.6.3. מניחים את קצה פיפטה המכיל ~ 50 µL של מים סטריליים על פתח הנרתיק.
- בעדינות לרוקן את התאים של קיר הנרתיק ע י החדרת reabsorbing ~ 50 µL של מים 2 - 4 פעמים. כתם בתוכן מהקצה פיפטה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית עם תוויות.
- בזהירות לצפות המורפולוגיה הסלולר על מיקרוסקופ brightfield באמצעות 10 X או 20 X המטרה או לתת את airdry השמצות על ~ 1 h, ואז counterstain עם פתרון מתילן כחול 0.1% (מומס ddH2O) (איור 2B). כדי counterstain, לטבול את השקופית מיובשים בתוך תמיסת מתילן כחול 0.1% עבור ~ 30 s. תנו לאוויר שקופית יבש לשעה.
- לבחון את השקופיות מהשלב 1.7.4 על מיקרוסקופ שדה בהיר 10 X או 20 X. להקים את השלב של ייחום (איור 2B)20 על ידי התבוננות המורפולוגיה תא המאפשר להבחין את ארבעת השלבים ברורים ייחום (איור 2B).
הערה: Metestrus מאופיין על ידי תערובת של cornified לתאי האפיתל הקשקש, לויקוציטים, diestrus על ידי לויקוציטים, proestrus על ידי עירוב של לויקוציטים nucleated בתאי אפיתל, ואת ייחום על ידי תאים אפיתל cornified (איור 2B) 20. - להקליט את משקל הגוף ולחזור העכבר לכלוב שלו הביתה, כפי שמתואר צעדים 1.5.6-1.5.7. . מריחות הנרתיק הסתיימו ביום כאשר העכבר יש שלה ייחום ראשון (איור 2B).
2. רצוי גידול בתנאי החדר
- להבטיח החדר הרבייה לטמפרטורה של ~ 20-24 ° C, עם 55 ± 10% לחות, ואחידה חדר האור של עוצמות של ~ 300-400 לאקס כ- 1 מ' מעל קומה21. עוצמת האור הזה מאפשר עוצמת האור רצוי כלוב בינוני של 25-80 lux. כדי לבדוק את עוצמת האור, השתמש מד האור.
- השתמש במערכת אוטומטית כדי לקבוע את התאורה בחדר הרבייה כדי להבטיח העיתוי המתאים של תאורה לאורך כל הניסוי. תנאים אופטימליים אורך היום כדי להעריך את פוריות בטווח מכרסמים מיום 12 שעות (12 שעות אור וחושך 12 שעות, LD12:12), בתנאי "קיץ כמו" עם 14 h של החושך (LD14:10) של אור ו- 10 h-21.
- להכין את כלובי רבייה.
- להכין כלוב עכבר נקי עם מכסה, מים, אוכל, מצעים וקינון לכל רבייה זוג.
- למלא את הקלפים כלוב עם כל המידע הנדרש, כולל מין, תאריך לידה, המתח העכבר ואת תאריך בעת הזדווגות מוגדר.
3. פוריות המחקר
- לזהות את החיות כדי לשמש לחקר הפוריות. ודא כי כל בעלי החיים הם בגרו (שלב 1). טווח הגיל בדרך כלל משמש כדי להגדיר מחקר פוריות בעכברים הוא 10-16 שבועות של גיל, עידן שבו התבגרות מינית הושלמה בתנאים הכי ניסיוני.
- על שולחן נקי, למקם את הכלוב הרבייה המבושלות 2.3 שלב.
- לתפוס והחזק את העכבר.
- לאט לאט להציג יד בכפפה לתוך הכלוב העכבר. תשאיר את היד לכלוב לתקופה קצרה של זמן (s ~ 5-30), המאפשר העכברים להתאים ריח הכפפה והיד. הימנע תנועות קופצניות קדחתני.
- תוריד את היד היו כפות קרוב בתחתית הכלוב, לאט התקרבו אליו כדי העכברים. הם אני אברח הם עלו על היד, השמנה זנב עכבר אחד בין האגודל לאצבע.
- הרם את העכבר בזנב עבור s 2-3. אם העכבר צריך להיערך זמן רב יותר, להחזיק הזנב, הנח את העכבר ביד היו כפות שמירה על החסימה על הזנב.
- להעביר 1 זכר, לאחר מכן 1 נקבה לתוך הכלוב רבייה על-ידי החזקת אותם בזנב (שלב 3.3). ודא כי הנקבות הן בשלב estrous אותו בעת הגדרת וזמינותו פוריות. לקבוע את שלב estrous של הנקבות על-ידי ביצוע כתם הנרתיק כפי שמתואר בשלב 1.7.
- לסגור את הכלוב ולהבטיח כי העכברים יש חומר מזון, מים ומחסה. לצרף בעל הכרטיס כלוב עם הכרטיס כלוב לכלוב.
- למקם את הכלוב רבייה על המדף דיור. להשאיר הכלוב רבייה גם ללא הפרעה ככל האפשר משך המחקר פוריות מלא. לנהל את המחקר פוריות למשך 30 יום. עבור כל זוג הרבייה, שומרים פרטים, הערה 1) תאריך שההזדווגות הוא להגדיר, 2) התאריך המלטות נולדים או 3) את מספר הגורים נולד, כולל הגורים מתים וחיים. לבצע בדיקות המלטה מדי יום לאורך כל תקופת המחקר.
- להאריך את הפוריות מחקר עבור ימים 30-60 נוספים אם אין או השפעה חלשה על פוריות נוסדה ב- 3.6 צעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות שהוצגו מגיעים בשני דגמים שונים בעכבר הטרנסגניים איפה שעתוק מקדם הגחון הקדמי גנים homeobox 1 (Vax1) נמחקה הגוף כולו על אחד אלל, המכונים כאן heterozygote עכברים (HET)13, או Vax1 נמחקה מותנית בתוך GnRH נוירונים22, כאן כינה מותנה KO (cKO). לפני הגדרת המחקר פוריות, חשוב לאשר תחילת המתבגר כל בעכברים.
ראשית, היום, משקל פתח הנרתיק והפרדה preputial הוקמו. בעכברים הט, פתח הנרתיק והפרדה preputial אירעה באותו גיל, משקל כמו עכברים שליטה (איור 3 א ו- F, בהתאמה). לעומת זאת, פתח הנרתיק והפרדה preputial היו באופן משמעותי להתעכב על cKO נקבות וזכרים ומשויכים bodyweight מוגברת (איור 3B ו- G, בהתאמה). תחילת המתבגר הוא במידה מסוימת המשויכת משקל הגוף, זה נכון במיוחד נקבות23. כדי לקבוע אם העיכוב פתח הנרתיק והפרדה preputial היה קשור עם עיכוב במשקל, משקל הגוף בגיל ממוצע של פתח הנרתיק והפרדה preputial בפקדים (בגיל 4.5 שבועות) היה לעומת משקל הגוף ב- cKO אצל גברים הנקבות רוב בגיל 4.5 שבועות. בגיל 4.5 שבועות, פקדים הנשי, cKO היה משקל הגוף דומה (איור 3C), ואילו הזכרים cKO היו מעט כבד יותר פקדים (איור 3 H). אפשרות זו מציינת כי העיכוב ב פתח הנרתיק והפרדה preputial ב cKO אינה קשורה עיכוב במשקל.
פתח הנרתיק הוא סמן מוקדם של התבגרות מינית, ייחום הראשון מציין הביוץ הראשון התרחש, סמן סיום ההתבגרות17. כדי לקבוע אם הנקבות הט ו cKO הגיע ייחום ראשון-באותו גיל ומשקל כפקדי, מריחות הנרתיק בוצעו מדי יום מהיום של פתח הנרתיק עד ייחום ראשון (3E איור ותלת מימד). בעכברים הט, ייחום ראשון, ומשקל -ייחום ראשון היה דומה בין פקדים, HETs (דמות תלת-ממד). לעומת זאת, cKO לא התקדמות לעבור ייחום, לא היה ייחום ראשון בגיל 80 יום (איור 3E). עיכוב זה לא היה בגלל משקל הגוף מופחתת (איור 3E).
העכברים הט עם תחילת המתבגר מאושרות שימשו כדי להגדיר את המחקר פוריות. וזמינותו הפוריות הוקם ב 12 שעות אור ומצבים 12 h כהה (LD12:12) בהעכברים הטרנסגניים על רקע גנטי C57BL/6J. העכברים היו בגילאי 10-16 שבועות בתחילת הניסוי. ארבע קבוצות של עכברים נחקרו: בקרה matings (WTxWT), לשלוט זכרים עם הט נקבות (WTxHET), הט זכרים עם הנקבות WT (HETxWT) ו הט זכרים עם הנקבות הט (HETxHET). ראשית, נקבע מספר המלטות שנוצר תוך 3 חודשים. שליטה matings (WTxWT) שנוצר ממוצע של המלטות 2.8 תוך 3 חודשים, אשר היה להשוות זכרים הט לזווג עם הנקבות שליטה (HETxWT הזדווגות, איור 4A). הט נקבות, אם מזווג עם זכר WT (בקרה), או של הט זכר, שנוצר באופן משמעותי פחות המלטות במחקר פוריות 3 חודש, הגילוי HET הנקבות subfertile13. כדי להמחיש את חשיבות המאשרת תחילת המתבגר לפני הגדרת וזמינותו של פוריות, יכולת הרבייה הוערך בעכברים cKO, כאשר הזכרים התעכב ההפרדה preputial (איור 3G) והנקבות לא היה הראשון שלהם ייחום לפי 80-ימים של גיל (איור 3E). המחקר הפוריות הוקם > 1 שבוע לאחר הזכרים היה הפרדה preputial, ולא אצל נקבות-> 80 ימים של גיל. במהלך המחקר 70-יום הפוריות, שליטה matings שנוצר ממוצע של 2.2 המלטות, ואילו המלטות לא נוצרו מן cKO הנשי לזווג עם זכר WT או הזכר cKO לזווג עם נקבה שליטה (WT) (איור 4B), מראה כי אלו עכברים הם עקרים5,22.
כדי לאפיין טוב יותר את פריון ותפקיד של הנקבות הט, הקלטנו את מספר הימים שלקח להפיק ההמלטה הראשונה. WTxWT matings שנוצר ההמלטה הראשונה שלהם בממוצע 22 ימים (איור 4C), אשר היה להשוות זכרים הט לזווג עם הנקבות WT. נקבות הט לזווג עם זכרים WT לקח ממוצע של 58 ימים כדי לייצר ההמלטה הראשונה שלהם, אשר היה דומה HETxHET matings (איור 4C). עם זאת, העיכוב ביצירת ההמלטה הראשונה של הנקבות הט היה מאוד heterogenous, מתעכב יותר ב- matings HETxHET, רומז על penetrance למחצה של פנוטיפ, תרומה של הזכר הט ל subfertility הנהוגות HETxHET matings13 .
הערכת גודל המלטה יכול לתת מידע חשוב על ביוץ/השרשה וייצור הזרע. גודל ממוצע המלטות הראשון 3 היה נחוש. מעניין, כל הזדווגות שילובים (WTxHET, HETxWT, HETxHET) המיוצר המלטות הקטנה משמעותית לעומת פקדים (WTxWT, איור 4D), מראה כי גם זכר וגם נקבה הט עכברים הם subfertile.
איור 1: הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים שולט התבגרות מינית ורביה. -השיא של הציר הרבייה הם נוירונים kisspeptin ההיפותלמוס (מעגלים צהובים) גונדוטרופין – releasing הורמון (GnRH) נוירונים (עיגולים ירוקים). בתקופת ילדותי (prepubertal), kisspeptin נוירונים שחרור kisspeptin קטן על גבי GnRH נוירונים. לאחר תחילת המתבגר, שחרור kisspeptin על נוירונים GnRH מהסוללות מומר (פוסט-המתבגר). GnRH מוגברת, במהדורה בשלהי תקופת ילדותי מגדיל באופן דרמטי הורמון מחלמן (LH) ואת זקיק מגרה את שחרור ההורמון (FSH) בלוטת יותרת המוח, שמוביל ההבשלה האשכים ותפקוד הרבייה בבגרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: קביעת תחילת המתבגר בעכברים. סמן חיצוני תחילת המתבגר בעכברים היא הפרדה preputial (א) בקרב הזכרים, ו בנרתיק פתיחת אצל הנקבות. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. (B) דוגמה תמונות משטיפת הנרתיק כדי לקבוע ייחום ראשון. שקופיות היו counterstained ל 30 s עם 0.1% מתילן כחול, airdried, שנצפה בהגדלה X 20. חיצים שחורים מציינים nucleated בתאי אפיתל, חיצים צהובים עם מתאר שחור מציינים לויקוציטים ולציין החצים הלבנים cornified תאים אפיתל. ייחום ראשון אירעה ביום 10 לאחר פתח הנרתיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג נתונים אשר ניתן להפיק של מחקר התפתחות המתבגר. (A, B) פתח הנרתיק, משקל פתח הנרתיק במודלים הטרנסגניים העכבר. (ג) משקל 4.5 שבועות אצל נקבות cKO ובקרה. (יח, E) גיל ומשקל -ייחום ראשון. (F, G) גיל ומשקל -ההפרדה preputial. משקל (H) 4.5 שבועות אצל זכרים cKO ובקרה. נתונים מייצגים ± באמצעים ב- SEM. N = 5-10 לכל מבחן t של סטודנט ניתוח קבוצתי, סטטיסטית. p< 0.01; p< 0.001. הדמויות שונו מן הפרסום הקודם13,22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ניתוח נציג ממחקר פוריות של העכברים הטרנסגניים. פוריות הערכה של עכברים (א) Vax1 HET cKO (B) בוצעה בעכברים 10 עד 16-בת בתולה והקליט מספר המלטות במסגרות זמן שצוין. נתונים מייצגים ± באמצעים Statistical ב- SEM. הניתוח בוצע על ידי חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן השוואה מרובים של Dunnett. * p< 0.05; p< 0.001. (ג) מספר ימים המלטה ראשונה (n = 5-12), וגודל (D) המלטה הממוצע שלוש המלטות (n = 10-13) היה נחוש. נתונים מייצגים ± באמצעים Statistical ב- SEM. ניתוח בוצע על ידי מבחן t של סטודנט לעומת WT x WT. *p< 0.05; p< 0.01. הדמויות שונו מן הפרסום הקודם13,22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: הגדרת וזמינותו של פוריות. (א) דוגמה רבייה ערכת ומספר המוצע של חיות הדרושות וזמינותו פוריות. המספר הכולל של בעלי חיים נדרש ללמוד עם 2 התנאים כגון פקד לעומת דיאטה KO או שליטה לעומת בשומן איפה פוריות מוערך בזכרים ונקבות: שני עברים לכל ההזדווגות (1 זכר x 1 נקבה) x 8 בעלי חיים לכל קבוצה x 2 תנאים x 2 מין s (כדי להעריך פוריות גם זכר וגם נקבה) = סה"כ 64 בעלי חיים לכל מחקר. אם המחקר פוריות נשי נעשה במקביל, ערכה אחת של שליטה x matings הבקרה יכול לשמש בדרך כלל להשוות בין שני ההשפעה על רבייה זכריים ונקביים. (B) בעת הגדרת וזמינותו של פוריות, העכברים היה צורך הגיעו לבגרות מינית. זנים שונים של עכברים יש מאפיינים שונים הרבייה ולהגיע לבגרות מינית בגילאים שונים24. לקבלת מידע על חולדות, ראה הפרסום הקודם25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רווחתם הכללית של העכברים הוא קריטי עבור assay פוריות מוצלחת21. בעת ביצוע וזמינותו של פוריות, חשוב לבדוק לא פיזית העכברים כל יום כמו זה יכול לגרום ללחץ. דרך נוספת להימנע שינויים תכופים בכלוב, כמו אלה גם מלחיץ. אידיאלי שינויים כלוב ייעשה יותר מ 1 - 2 פעמים בשבוע. לאור החשיפה במהלך שלב כהה משפיע באופן שלילי הרבייה בחולדות ליליים. לא להדליק אורות בחדר הרבייה במהלך השעות כהה. אם הכניסה לחדר נדרש במהלך השעות כהה, השתמש האור האדום העמום תאורה. עוד גורם הלחץ היא הנוכחות של ריחות מופרז, תנודות או רעש ביבר כולו או חלקים של המחקר. כדי לעזור להקל על הלחץ ולשפר את רווחתם העכבר והשבחה, לתת העכברים קינון גשמי או שאר סוגי העשרה. בניית הקן התנהגות חשוב בעכברים, יגדיל את הצלחת הרבייה. הקנים מאפשרות גם העכברים מקום להתחבא ולשחק. גזע בעלי חיים בריא ואכל היטב היטב, לכן זה חשוב לספק גישה ad libitum מים ואוכל איכותי. אם זוגות מתחילים סימפטומים של המחלה, כגון דרמטיטיס (בתדירות גבוהה ב C57BL/6J), דנטלי ליקוי סגר או השני, הכללת אלו עכברים מן המחקר. בנוסף, אם המחקר נעשה בעכברים immunodeficient, זה המפתח לחדר העכבר נשמר נקי לשמר פוריות.
כדי להגדיר כראוי את מחקר פוריות, חשוב להחליט אם המחקר יבוצע בעכברים בתולה או מגדלים מוכח גם בזהירות בחר העכברים שימשו השליטה matings. Matings הבקרה צריכה לפעול במקביל הברידרז ניסיוני. זהו ציווי כמו לחצים לא ידועים או בלתי צפויות, שינויים בסביבת יכול לגרום לשינויים רביה קצב. Matings שליטה מורכבים מעדיפים בנות זוגם המלטה כדי העכברים ניסיוני (איור 5A). הדבר חשוב במיוחד כאשר המחקר פוריות נעשה בעכברים עם רקע גנטי מעורבים עקב הווריאציות נהדר רביה מאפיינים בין זנים העכבר (איור 5B).
זיהוי הפנוטיפ subfertility עשויה להיות מאתגרת בשל אורך ממושך של המחקר, ואת הצורך לנתח פרמטרים נוספים כדי לחשוף את הסיבה שלו. העכבר הט נציג נתונים היא דוגמה טובה של הפנוטיפ subfertility צנוע (איור 4) ולאחר הניתוח מורחב נחוץ כדי לזהות את subfertility זכר. כפי שניתן לראות את התוצאות נציג (איור 3 ו- 4), נורמלי בפרוץ גיל ההתבגרות (איור 3A, Dו- F) יכול להיות משויך subfertility גם זכר וגם נקבה (איור 4A, C, D ). במקרה זה, העכברים היו רק תת פוריות, ולכן אורך המחקר הוארך עד 120 ימים. זה חשוב, כמו מחקר פוריות קצר יותר (למשל., 60 ימים) לא היה מסוגל לחשוף את פנוטיפ. Subfertility זכר היה צנוע, לראשונה נחשף כאשר זכרים הט היו זיווג עם הט נקבות, שהיו גם subfertile (איור 4A). ואכן, subfertility של הזכרים הט אושר בעת הערכת הגודל הממוצע של המלטות הוליד (איור 4D). המשך לימודים אישרה את subfertility זכר ואת חשף איכות הזרע המסכן בקרב הזכרים הט, עם הפחתה של ~ 80% תאי זרע13.
כאשר ביצוע של פוריות, תחילת המתבגר ללמוד בעכברים עם עיכוב גדול התפרצות המתבגר (> 5 ימים), חשוב לקחת בחשבון את הגורמים השונים אשר לווסת התפרצות המתבגר26. למרות פתח הנרתיק, ייחום ראשון לרוב יקרה/ת בחולדות, ייחום ראשון בעכברים מתרחשת בדרך כלל ~ 10 ימים לאחר פתח הנרתיק25,27. לכן, מומלץ לוודא כי פתח הנרתיק והן ייחום ראשון נקבעו בעת עבודה ב18,של חולדות ועכברים -28. תחילת המתבגר מקושר מצב מטבולי ומשקל הגוף אצל נקבות, תואר של קטין זכרים1,7,9,29, בתור שכזה, טיפול או מוטציה גנטית האטת גידול בעלי חיים יהיה ב כמה המקרים תוצאה התפתחות המתבגר מושהית. כדי לקבוע אם העיכוב/קידום בתחילת המתבגר עשויה להיות קשורה צמיחה מהירה/איטית, חשוב לשקול העכברים מדי יום במהלך המבדק תחילת המתבגר. כפי שניתן לראות באיור 3B ו- C, כמו גם G ו- H, עיכוב התפתחות המתבגר לא הייתה קשורה עם משקל הגוף מופחת, אבל היה עיכוב נכון בתחילת המתבגר, כפי שאושר על ידי הורמון היסטולוגיה האשכים ופיזור רמות22. אחת המגבלות הגדולות של שימוש preputial בין פתח הנרתיק כמו סמני תחילת המתבגר הוא כי שניהם לעיתים קרובות יקרה בסופו של דבר עם הזמן עקב מנגנונים אחרים מאשר פעילות ציר הרבייה18, מוגברת 30 , 31 (איור 1). דוגמה לכך היא פתח הנרתיק מתעכב אצל הנקבות cKO (איור 3B). הנקבות cKO לעולם לא להיות פוריים בשל העדר ביוץ22 (איור 3E). ואכן, בהמשך במחקרים להערכת רמות ההורמונים, היסטולוגיה האשכים של העכברים cKO הוכיח כי אלו עכברים מעולם לא השלים את גיל ההתבגרות, עקרה22 (איור 4B). זה מראה את הגבול של באמצעות סמנים חיצוניים כדי לקבוע את תחילת המתבגר. סיום ההתבגרות להגעה לבגרות מינית דורש GnRH שחרור מוגבר והפעלה של הציר הרבייה (איור 1), לאשר באופן מלא לבגרות מינית מורפולוגיה האשכים וגם במחזור רמות ההורמונים צורך להעריך 22 , 31. אצל הזכרים, מדידת טסטוסטרון, והערכת גודל שלפוחית הזרע, testis מורפולוגיה וגודל בנוסף איכות הזרע יאשר ההתבגרות היה מושגת16,22,32. אצל נקבות, מדידת רמות פרוגסטרון ואסטרוגן בשילוב עם משקל הרחם ואת השחלות מורפולוגיה יאשר סיום ההתבגרות17,19,22,33.
המלטה גודל יכול להשפיע על אורך ההיריון והן בגיל תחילת המתבגר. רוב זני העכבר יש תקופת ההיריון 18-22 ימים. עם זאת, אם האם היא מצפה בהמלטה גדולים, תקופת ההיריון נוטה להיות מופחת34,35. מצד שני, אם האמא מיניקה בהמלטה הקודם, התוצאה יכולה להיות הרחבה של תקופת הריון5. כלבים גדולים המלטות נוטים גם התעכבנו תחילת המתבגר. זה נגרם על ידי הצמיחה שלהם מעט שעיכבו1,9,34,35. אם מתבצע מחקר פוריות, אחת הקבוצות העכבר (שליטה או ניסיוני) מייצרת המלטות גדולים מאוד, מומלץ homogenize הגורים גדלים, גם ליקוט ומאפשר את המלטות למדה שיש גדלים דומים.
רבייה ניתן רק המוערך ויוו עקב מספר האיברים מעורב רבייה (איור 1) ואת מנגנוני משוב מפורט המסדיר את ציר הרבייה3. היבטים מסוימים של יכולת הרבייה ניתן להעריך במהירות דרך הנרתיק חיבור assay, איפה הקיבולת של הזכר הר הנקבה ולעזוב פקק פיזי בתוך הנרתיק הוא ציין13,36. למרות זאת בגישה שימושי כדי להעריך את ההתנהגות המינית הגברית, מסוג זה אינו מאפשר זיהוי בעיות קטנות ברבייה, וגם זה להעריך הקפיד פוריות במשך תקופה ארוכה של זמן או וכתוצאה מכך גודל המלטה והתנהגות הורית. הפרוטוקול המתואר כאן מציג יתרונות רבים על פני חיבור assay, סרן להיות היכולת לזהות השפעות משניות והן הגדולות על תחום הרבייה זכרים ונקבות (איור 4).
פוריות פוחתת עם הגיל, בנוסף ייחום הנשי הופך יותר ולא סדירות במהלך ההזדקנות5,28. לכן מומלץ להתחיל מחקר פוריות צעירים ולומדים מינית חיות. טווח הגיל בדרך כלל משמש כדי להגדיר מחקר פוריות היא מגיל 10-16 שבועות. עם זאת, חשוב להיות מוכר בעל מאפיינים ספציפיים הרבייה של המתח העכבר השתמשו במחקר, כמו רבייה, בגרות מינית הבדלים משמעותיים בין שונה עכבר או חולדה זנים (איור 5B). מידע נוסף על מאפייני הרבייה ניתן למצוא ב https://phenome.jax.org/ ג'אקס העכבר Phenome מסד נתונים. ביצוע ארוך יותר (> חודש 4) מחקר פוריות יש את היתרון של להיות מסוגל לזהות מוקדם ירידה הרבייה, איפה העכברים עלול מתרבים בדרך כלל החודשים הראשונים 1-2 של וזמינותו פוריות, אבל אז יש ירידה מוקדמת ברבייה החל לפני בגיל 6 חודשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אין לחשוף.
Acknowledgments
אני מודה המחברים לתרום העבודה ההתחלתית אשר הוא הבסיס של פרסום זה. תודה Aitor אגירה, ג'נביב א, ריאן ואריקה Schoeller ל' לעזרה בהכנת כתב היד. תודה לי סורה ג'סיקה, אוסטין הסנטר לקבלת סיוע טכני עם כתב היד. H.M.H. נתמכה על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות & פיתוח אנושי של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E.
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
