Summary
Hier ist ein Protokoll für Medium-High Throughput Analyse von Protein-Phosphorylierung-Veranstaltungen auf der zellulären Ebene präsentiert. Phospho-Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiger Ansatz charakterisieren Signalisierung Aberrationen, identifizieren und Biomarker zu validieren und Pharmakodynamik zu beurteilen.
Abstract
Aberrante Zelle Signalisierung spielt eine zentrale Rolle bei der Krebsentstehung und Progression. Am meisten neue zielgerichtete Therapien richten sich in der Tat an Proteine und Proteinfunktionen und Zelle Signalisierung Aberrationen können daher als Biomarker an personalisierte Behandlungsmöglichkeiten dienen. Im Gegensatz zu DNA und RNA Analysen können Veränderungen der proteinaktivität die Mechanismen, die Droge Sensibilität und Widerstand effizienter auswerten. Phospho-Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik, die Protein-Phosphorylierung-Veranstaltungen auf der zellulären Ebene, ein wichtiges Merkmal misst, das diese Methode von anderen Antikörper-basierten Ansätzen unterscheidet. Die Methode ermöglicht simultane Analyse von mehreren Signalproteine. In Kombination mit fluoreszierenden Zelle Barcoding können größere Medium-Hochdurchsatz-Datensätze von standard Cytometer Hardware in kurzer Zeit erworben werden. Phospho-Durchflusszytometrie hat Anwendungen in Studien der grundlegende Biologie und in der klinischen Forschung, einschließlich der Entdeckung von Biomarkern, Analyse und Bewertung der Pharmakodynamik-Signalisierung. Hier wird ein detaillierte experimentelle Protokoll für Phospho-Flow-Analyse der gereinigten peripheren mononukleären Blutzellen, mit chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen als Beispiel bereitgestellt.
Introduction
Phospho-Durchflusszytometrie wird verwendet, um Protein-Phosphorylierung-Spiegel bei einzelligen Auflösung zu analysieren. Das übergeordnete Ziel der Methode ist zellulären Signalisierung Muster unter bestimmten Bedingungen zuordnen. Durch die Ausnutzung der multiparameter Kapazität der Durchflusszytometrie, können mehrere Signalwege gleichzeitig in verschiedenen Teilmengen eine heterogene Zellpopulation wie peripheren Blut analysiert werden. Diese Eigenschaften bieten Vorteile gegenüber anderen Antikörper-basierten Technologien wie Immunohistochemistry, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), Protein Arrays und umgekehrter Phase Protein Arrays (RPPA)1. Phospho-Durchflusszytometrie kombinierbar mit fluoreszierenden Zelle Barcoding (FCB), was bedeutet, dass einzelne Zellproben mit eindeutige Signaturen von Fluoreszenzfarbstoffen gekennzeichnet sind, so dass sie miteinander vermischt, gebeizt und, wie eine einzelne Probe2 analysiert. Dies reduziert den Antikörper erhöht die Robustheit der Daten durch die Kombination von Steuerung und behandelten Proben und erhöht die Geschwindigkeit des Erwerbs. Die Gesamtbevölkerung der FCB kann dann in kleineren Proben unterteilt und befleckt mit bis zu 35 verschiedene Phospho-spezifische Antikörper, abhängig von der Menge des Ausgangsmaterials. Großen Profilerstellung Experimente können dabei mit standard Cytometer Hardware ausgeführt werden. Phospho-Durchflusszytometrie wurde auf Profil Signalwege in Patientenproben aus mehreren hämatologischen Krebserkrankungen einschließlich chronischer lymphatischer Leukämie (CLL)3,4,5, akute myeloische Leukämie (AML) angewendet 6 und non-Hodgkin Lymphome7. Phospho-Durchflusszytometrie ist somit ein leistungsfähiger Ansatz charakterisieren Signalisierung Aberrationen, identifizieren und Biomarker zu validieren und Pharmakodynamik zu beurteilen.
Hierbei ist die optimierte Protokoll für die Analyse von CLL Patientenproben von Phospho-Durchflusszytometrie (Abbildung 1A) vorgesehen. Beispiele für basale Signalisierung Charakterisierung, Anti-IgM/B-Zell-Rezeptor-Stimulation und Droge Störung sind. Eine detaillierte Beschreibung einer FCB-Matrix wird zur Verfügung gestellt. Das Protokoll kann leicht auf andere Zelltypen Fahrwerk angepasst werden.
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Protocol
Blutproben gingen nach schriftlicher Einwilligung von allen Spendern. Die Studie wurde vom Regionalkomitee für Medizin und Gesundheit Forschung Ethik des Südost-Norwegen genehmigt und die Forschung auf menschliches Blut erfolgte in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki-8.
Hinweis: Schritte 1 bis 3 sollte unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube durchgeführt werden.
1. Isolierung der peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von CLL-Patienten Blutproben
Achtung: Menschliches Blut sollte gemäß den Vorschriften für Biosafety Level 2 behandelt werden.
- Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 2 H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) und Transfer zum 50 mL Röhrchen (30 mL/Tube).
- Sorgfältig Schicht 10 mL eine Dichte Gradienten Medium (z.B.Lymphoprep) an der Unterseite des Rohres mit einer 10 mL-Pipette.
- Zentrifuge bei 800 X g für 20 min bei 4 ° C. Die PBMCs sind jetzt am Anfang der Dichte Gradienten mittlere Schicht sichtbar.
- Mithilfe einer Pasteurpipette um die Zellen in zwei neuen 50 mL Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie zweimal mit PBS (füllen sich die Röhren).
- Zentrifugieren bei 350 X g für 15 min. überstand verwerfen und in 3 mL PBS aufzuwirbeln.
- Zählen Sie die Zellen mit einer bevorzugten Methode.
- Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min. verwerfen des Überstands. Hinweis: 1.8 bis 3.2 Schritte sind optional. Es ist möglich, direkt mit Schritt 3.3 fortfahren.
- Aufschwemmen der Zellen im fetalen bovine Serum (FBS) mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) ergänzt und nach unten in geeigneten Aliquote mit Cryo-Röhrchen einfrieren.
Hinweis: DMSO ist giftig für die Zellen. Arbeiten Sie schnell, sobald die Zellen mit FBS/DMSO vermischt werden. Zellen können in flüssigem Stickstoff gespeicherte langfristig sein.
(2) Auftauen von Zellen
- Schnell Auftauen der Zellen in einem 37 ° C-Wasserbad.
Hinweis: DMSO ist giftig für die Zellen. Arbeiten Sie schnell, um die Belichtung zu DMSO zu begrenzen. - Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL kaltes Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640 mit ergänzenden GlutaMAX, siehe Tabelle of Materials).
- Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
- Aufschwemmen der Zellen in RPMI 1640 Medium ergänzt mit Natrium Pyruvat, MEM nicht-essentiellen Aminosäuren und Penicillin/Streptomycin (bei 1 X Verdünnung gemäß Anweisungen hinzugefügt) und 10 % FBS. Die Zellen in eine kleine Zelle Kultur Kolben übertragen und in einem Inkubator bei 5 % CO2, 37 ° C für 1 Stunde, um die Zellen zu kalibrieren lassen.
3. Vorbereitung der Zellen
- Zählen der lebensfähigen Zellen mittels eine bevorzugte Methode.
- Übertragen Sie die Zellen auf ein 50 mL-Tube und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
- Aufschwemmen der Zellen in RPMI 1640 Medium (Schritt 2.2) ergänzt mit 1 % FBS zu nicht mehr als 50 x 106 Zellen/mL.
- Übertragen Sie die erforderliche Menge an Zellsuspension auf Brunnen in eine 96-well-V-Boden-Platte.
Hinweis: Anzahl der Bohrungen entspricht die Anzahl der Bedingungen getestet werden. Proben für eine Stimulation Zeitverlauf werden aus einem einzigen Brunnen gezeichnet. 50 µL Probe pro Zeit-Punkt + 50 µL Totvolumen zu berechnen. Proben für Entschädigung Steuerelemente (eine ungefärbte Probe + eine Probe pro Barcode Farbstoff) zu speichern. - Übertragen Sie die 96-well-Platte auf einem vorgewärmten 37 ° C Wasserbad. Ruhen Sie die Zellen für 10 min.
4. Stimulation und Fixierung der Zellen
Hinweis: Führen Sie die Schritte 4 bis 8 auf dem Labortisch (d. h. nicht steril).
Achtung: Die wichtigste Zutat des Puffers zu beheben ich ist Paraformaldehyd, giftigen (Einatmen und Haut-Kontakt). Mit Vorsicht handhaben.
- Bereiten Sie eine 96 well V-Boden-Platte mit 60 µL Puffer zu beheben ich pro Bohrloch pro Probe. Lassen Sie in das 37 ° C-Wasserbad.
Hinweis: Zellen: Fix Puffer sollte 1:1 sein. Um Verdunstung bei 37 ° C zu ermöglichen, ist der Fix-Puffer zunächst in Hülle und Fülle. - Optional, behandeln Sie die Zellen mit Drogen vor der Stimulation.
- Übertragen Sie eine Kontrollprobe 50 µL auf Fix-Platte. Mischen von pipettieren rauf und runter.
- Optional, zunächst den Zeitverlauf Stimulation der Zellen 10 µg/mL Anti-IgM hinzu. Mischen von pipettieren rauf und runter.
- Übertragen Sie zu jedem Zeitpunkt eine 50 µL Probe auf Fix Platte. Mischen von pipettieren rauf und runter.
Hinweis: Anti-IgM induzierte Signalisierung in der Regel früh eingeleitet wird (Minuten). - Verlassen Sie die Fix-Platte bei 37 ° C für 10 min nach die letzte Probe hinzugefügt wurde.
5. fluoreszierende Zelle Barcoding (FCB)
Hinweis: Siehe Tabelle 1 für eine Liste der Barcoding Reagenzien.
- Waschen Sie die festen Zellen 3 X mit PBS (füllen Sie den Brunnen).
- Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
- Bereiten Sie einen 96 well V-Boden-Platte mit Barcoding Reagenzien. Pipettieren 5 µL jedes Barcoding Reagenz pro Bohrloch in die Anzahl der Kombinationen erforderlich, alle Proben nach der Färbung Matrix, z. B. in Abbildung 1 bzu beflecken. Jede Probe wird eine einzigartige Kombination aus verschiedenen Barcoding Konzentrationen haben.
- Die Zellen in 190 µL PBS und Übertragung auf die Platte Barcoding aufzuwirbeln. Mischen Sie gründlich.
Hinweis: Fleck eine Entschädigung Probe mit der höchsten Endkonzentration für jeden Barcode-Reagenz verwendet und eine ungefärbte Probe zu retten. - Lassen Sie die Zellen für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Waschen Sie die gefärbten Zellen 2 X mit Fluss waschen (PBS, 1 % FBS, 0,09 % Natriumazid) (füllen Sie den Brunnen).
- Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
- Die Zellen fügen Sie 190 µL Fluss waschen hinzu und kombinieren Sie die Barcode-Proben in einem 15 mL-Tube. Übernahmesteuerung jede Entschädigung an eine separate 1,7 mL-Tube.
- Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
6. Zelle Permeabilisierung zum intrazellulären Antigen Beizen
Achtung: Der Hauptbestandteil von Perm Puffer III ist Methanol ist giftig (Einatmen und Haut-Kontakt) und entzündlich. Mit Vorsicht handhaben.
- Übertragen Sie 2 mL Perm Puffer III auf eine 15 mL Tube. Lassen Sie bei-20 ° C, so ist es eiskalt bei Verwendung.
Hinweis: Perm-Puffer kann von Beginn des Experiments bei-20 ° C belassen werden. - 1,5 mL eiskaltes Perm-Puffer, die Barcode-Zell-Population (in der 15 mL Tube) und 100 µL jeder Entschädigung Steuerelement fügen Sie hinzu (in 1,7 mL Röhrchen) tropfenweise beim aufschütteln zu vermeiden, dass die Zellen verklumpen.
- Übertragen Sie die Zellen direkt auf-80 ° C. Lassen Sie für ein Minimum von 30 Minuten.
Hinweis: Es ist natürlich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten. Zellen in Perm Puffer können gespeicherte langfristig bei-80 ° c sein.
(7) Antikörper Färbung
Hinweis: Tabelle der Materialien finden Sie eine Liste der gemeldeten Phospho-spezifische Antikörper.
- Übertragen Sie die Zellen von-80 ° C auf eine Schachtel mit Eis.
- Waschen Sie 3 X mit Fluss waschen.
Hinweis: Es ist wichtig, Fluss waschen im Übermaß zu sehen, die Zelle Pellet hinzufügen, z. B. 3 mL Fluss waschen, die Barcode-Zell-Population und 1 mL jede Entschädigung-Steuerelement hinzufügen. - Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
- Aufzuwirbeln Sie die Barcode-Zell-Population in einem Volumen von Fluss waschen, wodurch 25 µL Zellsuspension pro Phospho-Antikörper Fleck. Die Entschädigung Steuerelemente in 200 µL Fluss waschen aufzuwirbeln.
- Bereiten Sie vor, dass Antikörper Färbung in eine 96-well-V-Boden-Platte. Das Endvolumen werden 50 µL/Well. Fügen Sie pro Bohrloch Phospho-spezifische Antikörper im Fluss Waschen zu einem Endvolumen von 10 µL, Surface Marker verdünnt im Fluss Waschen zu einem Endvolumen von 15 µL und 25 µL Zellsuspension verdünnt.
Hinweis: Antikörper-Verdünnungen sollten vor dem Experiment titriert werden. Umfassen Sie die Isotype Kontrolle. - Lassen Sie die Zellen für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Waschen Sie die gefärbten Zellen 2 X mit Fluss waschen (füllen Sie den Brunnen).
- Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
- Die Zellen in 150 µL Fluss waschen aufzuwirbeln.
8. Vorbereitung der Entschädigung steuert
- Die Antikörper konjugiert Fluorochromes parallel mit dem Antikörper Beflecken Entschädigung Kontrollen vorbereiten. Verwenden Sie Perlen der Entschädigung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
9. Flow Cytometry Analysis
Hinweis: Das Experiment kann auf einem Durchflusszytometer mit einem hohen Durchsatz Sampler (HTS) ausgeführt werden.
- Die Photomultiplier (PMT) röhrenspannung mit der ungefärbten Steuerung zu optimieren.
- Führen Sie Entschädigung Kontrollen und berechnen Sie die Entschädigung-Matrix zu.
- Laufen Sie Proben. Die Ereignisrate sollte gemäß den Spezifikationen des Instruments.
10. Anspritzung Strategie und Datenanalyse
- Importieren Sie die FCS-Dateien aus dem Experiment, eine Flow-zytometrie-Analyse-Software wie FlowJo oder Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
- Gating Strategie
- Wählen Sie Lymphozyten von SSC-A im Vergleich zu Plotten FSC-A in eine Dichte-Dot-Plot.
- Die Lymphozyten und wählen Sie die Unterhemden von SSC-A im Vergleich zu FSC -W. Plotten
- Zeigen Sie die Einzelzellen und Tor die Zelle geben Sie durch Plotten SSC-A im Vergleich zu der Oberfläche Marker an.
- Typ Zellpopulation in Pacific Blue vs. SSC-A Dichte Handlung anzeigen, und wählen Sie die verschiedenen FCB-Populationen anhand ihrer Pacific Blue Färbung Intensität (siehe Abbildung 1A).
- Plot den Phospho-Antikörper-Kanal gegen den FCB-Kanal oder als eine Heatmap (siehe Abbildung 1A), die Phosphorylierung Ereignisse anzuzeigen.
- Phospho-Signale mit Hilfe des inversen hyperbolischen Sinus (Arcsinh) des MFI (Median Fluoreszenz Intensität) des Phospho-Signal im Vergleich zu Isotype-Steuerelements zu berechnen (basale Phosphorylierung Ebenen, siehe Abbildung 1), oder der stimulierten im Vergleich unstimulierte Zell-Populationen (siehe Abbildung 1E).
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Representative Results
Die wichtigsten Schritte des Phospho Flow Cytometry Protokolls sind in Figur 1Adargestellt. Im dargestellten Beispiel waren die CLL-Zellen mit dem Barcode-Reagenz Pacific Blue bei vier Verdünnungen befleckt. Dreidimensionale Barcoding kann durchgeführt werden, durch die Kombination von drei Barcoding Farbstoffe, wie in Abbildung 1 bdargestellt. Die Einzelproben sind dann deconvoluted durch nachfolgende Anspritzung auf jeden Barcode Reagenz gegen SSC-A (Abbildung 1). Detaillierte Informationen über die Barcode-Reagenzien sind in Tabelle 1aufgeführt.
Nach der hier beschriebenen Vorgehensweise waren Phospho-proteingehalte in B-Zellen von Patienten mit CLL und normalen Kontrollen unter verschiedenen Bedingungen3gekennzeichnet. Beide Ebenen basale und Anregung-induzierte Phosphorylierung von 20 Signalisierung Moleküle stromabwärts von der B-Zell-Rezeptor (BCR) wurden analysiert (siehe Tabelle der Materialien für eine Liste der gemeldeten Phospho-spezifische Antikörper). Basalen Phospho-proteingehalte wurden in 22 CLL Patientenproben bezogen auf den Mittelwert der normale Steuerelemente zugeordnet. Diese Analyse ergab, dass STAT3 (pY705) ist deutlich hochreguliert in CLL-Zellen (Abbildung 1). Konstitutiven Aktivierung STAT3 in anderen hämatologischen malignen Erkrankungen gemeldet und ist verbunden mit einer Resistenz gegen Apoptose-9.
Um Signalisierung Aberrationen induziert durch den BCR Weg zu identifizieren, wurden Zellen mit Anti-IgM für bis zu 30 min stimuliert. Es hat sich gezeigt, dass CLL von Patienten mit IgVH Krebszelle Status (UM-CLL) Display erhöhte Sensibilität für Anti-IgM Stimulation10Zellen. Dies war in der Tat für die Mehrheit der untersuchten Proteine beobachtet, aber die Wirkung war statistisch signifikant nur für AKT (pS473) (Abb. 1E, UM-CLL im Vergleich zu M-CLL und Normal). Um zu testen ob das aberrante AKT (pS473) Signal rückgängig gemacht werden konnte wurden CLL-Zellen die PI3Kδ Inhibitor Idelalisib ausgesetzt, die in der Klinik zur Behandlung von CLL-Patienten-11. Wie in Abbildung 1Fdargestellt, wurden AKT (pS473) Ebenen deutlich reduziert auf Idelalisib Behandlung in einer Konzentration-abhängigen Weise, zeigen, dass um aberrante Signalisierung in CLL-Zellen zu normalisieren Kinase-Inhibitoren angewendet werden können.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Phospho Durchflusszytometrie in Kombination mit FCB ist ein leistungsfähiger Ansatz zu Signalisierung Analysestudien durchzuführen, potenzielle Biomarker identifizieren und bewerten Pharmakodynamik.
Abbildung 1. Arbeiten Sie Fluss und Beispiele für angewandte Phospho-Flow-zytometrie-Analyse.
(A) die wichtigsten Schritte des Verfahrens Phospho-Fluss dargestellt. Zellen sind zunächst stimuliert, dann fixiert und FCB ausgesetzt, bevor sie in eine Röhre für Permeabilisierung und anschließende Antikörper Färbung kombiniert werden können. Die Zellen werden auf einem Durchflusszytometer und Zell-Populationen sind durch Anspritzung während der Daten-Analysis deconvoluted. Die Ergebnisse können als Histogramme oder Heatmaps, visualisiert werden, wie gezeigt. (B) Beispiel für eine dreidimensionale FCB Färbung Matrix mit Alexa Fluor 488 (drei Verdünnungen), Pacific Blue (vier Verdünnungen) und Pacific Orange (drei Verdünnungen). Diese Matrix wird bis zu 36 Proben erlauben. (C) die FCB-Zelle Bevölkerung kann durch Anspritzung auf jeden FCB Kanal versus deconvoluted SSC-A. Kombination der Tore in der Analysesoftware erzeugt die richtige Bevölkerung für die Analyse. (D) Unstimulierte B Zellen von gesunden Spendern (n = 25) und Patienten mit CLL (n = 22) wurden von Phospho-Fluss nach dem Verfahren in (A) Analyse unterzogen. Die basalen Fluoreszenz-Intensität-Signale waren relativ IgGκ Isotype Steuerelement als Arcsinh Verhältnis berechnet. Die Signale in CLL B-Zellen wurden dann auf die Signale in B-Zellen von normalen Kontrollen normalisiert. p < 0,01 berechnet, indem eine ungepaarte zwei-Stichproben- t-test. UM-CLL: IgVH Krebszelle CLL, M-CLL: IgVH mutiert CLL. Symbole der gleichen Farbe stehen für Patientenproben, die in einer hierarchischen agglomerative Cluster basierend auf Level 20 Phospho-Proteine3zusammengefasst. (E) B-Zellen von normalen Kontrollen (n = 10, Mittel + SEM) oder CLL-Patienten (n = 11 [M-CLL] und n = 8 [UM-CLL], Mittel + SEM) wurden für den angegebenen Zeit-Kurs mit Anti-IgM angeregt und Phospho-Flow-Analyse unterzogen. Die Fluoreszenz-Intensität-Signale waren relativ unstimulierte Proben gemessen und als Arcsinh Verhältnis dargestellt. p < 0,01 (normale Vs UM CLL) und ***p < 0,001 (M-CLL Vs UM-CLL), durch mehrere Vergleich Tests mit Holm-Sidak Korrektur berechnet. UM-CLL: IgVH Krebszelle CLL, M-CLL: IgVH mutiert CLL. (F) CLL-Zellen wurden mit DMSO oder Idelalisib wie für 20 min vor Anti-IgM-Stimulation für 3 min inkubiert. Die Zellen wurden dann nach dem Phospho-Flow-Protokoll verarbeitet. p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,0001, durch mehrere Vergleich Tests mit Holm-Sidak Korrektur berechnet. UM-CLL: IgVH Krebszelle CLL, M-CLL: IgVH mutiert CLL. (D) Erläuterung der Symbolfarbe zu sehen. (D-F) werden von3geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Serielle verdünnen wie folgt (beginnend mit der Stammlösung) | ||||||
| Barcoding Reagenz | Lager Konzentration | #1 | #2 | #3 | #4 | ungefärbten |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1: 500 | 1:5 | x | ||
| Pacific Blue | 10 mg/mL | 1:2500 | 1:4 | 1:4 | 01:10 | |
| Pazifische Orange | 2 mg/mL | 01:50 | 01:12 | 01:24 | ||
Tabelle 1. Barcoding Reagenzien.
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Discussion
Phospho-Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik, Phosphorylierung proteingehalte in einzelnen Zellen zu messen. Da die Methode stützt sich auf die Färbung mit Antikörper, ist Phospho-Durchflusszytometrie durch Antikörper Verfügbarkeit begrenzt. Außerdem, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, alle Antikörper sollten titriert und vor Gebrauch überprüft. Ein detailliertes Protokoll für die Titration von Phospho-spezifische Antikörper wurde an anderer Stelle12beschrieben. Während Panel-Design ist die Berücksichtigung der Signal-Rausch-Verhältnis entscheidend. Im vorliegenden Beispiel wurden alle Phospho-Antikörper an Alexa Fluor 647 konjugiert. Diese Fluorophor bietet oft die optimale Differenz zwischen Proben mit geringer im Vergleich zu hohes Maß an Phospho-Protein. Darüber hinaus werden nur eine Farbe für die Phospho-Proteine mit die anderen Kanälen für FCB und Färbung der Oberfläche Marker freigelassen werden. Dieses Panel-Design reduziert Spillover in den Phospho-Kanal. Dadurch, dass alle Phospho-Antikörper konjugiert, die gleichen Fluorophor, wird die Datenanalyse auch vereinfacht werden.
Im vorliegenden Protokoll wurden alle Antikörper Verfärbungen nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen durchgeführt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Oberfläche Marker Färbung durch die Fixierung und Permeabilisierung Schritte durch Denaturierung der Oberflächenantigen oder erhöhte unspezifische Färbung13beeinträchtigt werden kann. Der Anwender sollte daher die Reaktivität der Antikörper auf einen Einzelfall zu testen. Ressourcen auf kompatiblen Klone können auch hilfreich sein, wie die Übersicht der verschiedenen Fixierung/Permeabilisierung Verfahren und deren Kompatibilität mit verschiedenen Antikörpern bei https://www.cytobank.org/facselect/ sein.
Protein-Phosphorylierung oder de-Phosphorylierung ist eine vorübergehende Änderung, die in Reaktion auf extrinsischen und intrinsischen Signale erfolgt. Beim Vergleich von Phosphorylierung Muster ist es daher entscheidend, dass die Experimente unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden. Wenn vergangen studieren Signalisierung in primäre Zellen aus Blut, Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen könnten Zeit gehören nach Zeichnung, Blut, Lagerbedingungen und für wie lange die isolierten Zellen vor Beginn des Experiments ausgeruht sind. Beim Vergleich von Signalisierung Muster in Cryo aufbewahrt und frisch isolierte Zellen aus Blut konnte nur sehr geringe Unterschiede (Skånland, unveröffentlicht) beobachtet werden. Es empfiehlt sich jedoch noch Cryo normale Zellen als Kontrolle beibehalten, wenn Biobanked Patientenproben, z. B. Studium verwenden. Die optimalen Bedingungen für die Durchführung der Phospho flow Cytometry Experimente und die Auswirkungen von externen Faktoren sollten von den einzelnen Benutzern getestet werden.
Hier ist ein Protokoll für Phospho-Flow-Analyse der Aussetzung Zellen präsentiert. Das Protokoll kann auf andere Zelltypen angepasst werden, aber es ist eine Voraussetzung, die die Zellen in Suspension als Einzelzellen für die Analyse von Durchflusszytometrie. Das Verfahren dazu muss zart zu bewahren und nicht beeinflussen, Phosphorylierung Muster sein. Es gibt Beispiele, wo adhärente Zellen sind losgelöst von der Kultivierung Dish durch kalte Trypsination12,14, oder eher auf Mikrosphären15angebaut. Wenn es um Phospho-Durchflusszytometrie auf festen Gewebe kommt, ist ein Bericht auf Lungentumoren, wo einzelne Zellen gewonnen wurden, indem man die Zellen durch ein Rohr mit einer Zelle Sieb16,vorhanden. Phospho-Durchflusszytometrie wurde vor kurzem mit einem neuartigen Ansatz bezeichnet Aufschlüsselung für die intrazelluläre Signalisierung in einzelnen Epithelzellen aus Gewebe (DISSECT) um Phospho-Proteine in epithelialen Geweben17 und Darmkrebs zu studieren kombiniert. 18.
Das FCB ist ein entscheidender Schritt im Protokoll, da Dekonvolution der Proben am Ende des Experiments stützt sich auf verschiedene FCB-Populationen. Um dies zu erreichen, müssen die Zellen homogen gefärbt werden. Es ist daher wichtig, einen Barcode-Teller vorzubereiten, dem die Zellen hinzugefügt werden können. Hinzufügen der Reagenzien zu den Zellen führt ungleichmäßige Färbung und gemischte Bevölkerung, die durch gating deconvoluted werden können nicht. Es wird dringend empfohlen, führen Sie einen Test der Barcoding Verdünnungen, bevor das Experiment durchgeführt wird, wie die Intensität der Färbung Zelltyp abhängigen.
Weitere Antikörper-basierten Techniken wie Protein Arrays und umgekehrter Phase Protein Arrays (RPPA) können zur Quantifizierung von Phospho-proteingehalte in einem Medium auf Hochdurchsatz-Art und Weise angewendet werden. Einige Eigenschaften des Phospho-Durchflusszytometrie unterscheidet jedoch diese Methode von den anderen. Ein wichtiger Vorteil des Phospho-Durchflusszytometrie ist, dass es für die einzelne Zelle Profilierung ermöglicht. Durch die Einbeziehung oberflächenmarker für verschiedene zelluläre Teilmengen, kann zwischen zellulären Heterogenität erkannt werden. Kombination mit FCB ermöglicht darüber hinaus für die Analyse von mehreren Bedingungen in der gleichen experimentellen ausgeführt. Diese Eigenschaften machen Phospho-Durchflusszytometrie eine attraktive Methode für zukünftige Anwendungen in Biomarker Discovery und Präzision Medizin19.
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Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde im Labor von Professor Kjetil Taskén durchgeführt und wurde von der norwegischen Krebsgesellschaft und Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen unterstützt. Johannes Landskron und Marianne Enger sind für kritische Lektüre des Manuskripts anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
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| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
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| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
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| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
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