Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Automatisering af en Positron-emissions-tomografi (PET) Radiotracer syntese protokol for kliniske produktion

Published: October 26, 2018 doi: 10.3791/58428
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,4, 1, 2,3, 2,4
1SOFIE, 2Department of Molecular & Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles (UCLA), 3Ahmanson Translational Imaging Division, University of California, Los Angeles (UCLA), 4Crump Institute for Molecular Imaging, University of California, Los Angeles (UCLA)
* These authors contributed equally

Summary

Positron-emissions-tomografi (PET) imaging websteder, der er involveret i flere tidlige klinisk forskning forsøg har brug for robuste og alsidige radiotracer fremstilling kapaciteter. Ved hjælp af radiotracer [18F] BSA som et eksempel, vi illustrere hvor hen til automatisere syntesen af en radiotracer ved hjælp af en fleksibel, kassette-baserede radiosynthesizer og validere syntese til klinisk brug.

Abstract

Udviklingen af nye positron-emissions-tomografi (PET) røbestoffer er aktivering af forskere og klinikere til at afbilde en stadig bredere vifte af biologiske mål og processer. Men det stigende antal forskellige røbestoffer skaber udfordringer for deres produktion på radiopharmacies. Historisk set har det været praktisk at dedikere en custom-konfigureret radiosynthesizer og hot celle til gentagne produktion af hver individuel tracer, er det nødvendigt at ændre denne arbejdsproces. Seneste kommercielle radiosynthesizers baseret på disponible kassetter/kits for hver tracer forenkle produktionen af flere røbestoffer med ét sæt udstyr ved at eliminere behovet for brugerdefinerede tracer-specifikke ændringer. Endvidere, at nogle af disse radiosynthesizers operatør til at udvikle og optimere deres egen syntese protokoller ud over køb af kommercielt tilgængelige kits. I denne protokol, vi beskrive den generelle procedure for hvordan den manuelle syntese af en ny PET-sporstof kan automatiseres på en af disse radiosynthesizers og valideret for fremstillingen af klinisk-grade røbestoffer. Som et eksempel, vi bruger ELIXYS radiosynthesizer, en fleksibelt kassette-baserede radiokemi værktøj, der kan understøtte både PET tracer udviklingsbestræbelser, samt rutinemæssig klinisk sonde produktion på det samme system, til at producere [18F] BSA ([ 18 F] CFA), en PET sporstof til at måle i vivo deoxycytidine kinase (dCK) enzymaktivitet. Oversætte en manuel sammenfatning indebærer nedbryde den syntetiske protokol i grundlæggende radiokemi processer, der derefter oversat til intuitiv kemi "enhed operationer" understøttes af synthesizer software. Disse operationer kan derefter hurtigt konverteres til en automatiseret syntese program ved at samle dem ved hjælp af træk-og-slip grænseflade. Efter grundlæggende test, kan den syntese og rensning procedure kræver optimering til at opnå det ønskede udbytte og renhed. Når den ønskede ydeevne opnås, foretages en validering af syntesen for at bestemme dets egnethed til produktion af radiotracer til klinisk brug.

Introduction

En stigende række af biologiske mål kan visualiseres dynamisk i levende fag via til molekylær imaging modalitet PET. PET giver i vivo assays af specifikke biologiske, biokemiske og farmakologiske processer ved hjælp af specifikke radiotracers (molekyler mærket med positron-emitting radionuklider), der er sprøjtet ind i emnet før imaging1. Øget anvendelse af PET til at studere en bred vifte af disse processer i grundforskning og klinisk forskning2,3,4, og i opdagelse, udvikling og klinisk brug af narkotika i patientpleje5, 6, fører til en stigende efterspørgsel efter forskellige radiotracers7,8. Undgå stråling til radiochemist og sikre en reproducerbar produktion af disse kortlivede sporstoffer, er de typisk fremstillet ved hjælp af en automatiseret radiosynthesizer opererer inde i en "hot cell". De seneste radiosynthesizers bruge en engangs-kassette/kit arkitektur til at forenkle opgaven med at overholde klinisk-grade fremstilling og giver samtidig fleksibilitet for at forberede flere typer af radiotracers ved blot at bytte ud kassetter9 . Men i klinisk vorden, der er normalt ingen kommercielt tilgængelige kassetter/kits til at udføre den automatiserede radiosynthesis; dermed, PET drug produktionsfaciliteter kamp at tilpasse systemer til at gennemføre cGMP-grade tracer produktion kapaciteter inden for en passende tidsramme og til en rimelig pris. Således er blevet radiosynthesizers udviklet, der kombinerer kassette/kit arkitektur med funktioner til at lette udvikling og optimering af røbestoffer.

ELIXYS FLEX/CHEM (ELIXYS) er et eksempel på en fleksibel kassette-baseret radiosynthesizer med en bred reagens, opløsningsmiddel og reaktion temperatur kompatibilitet10. Det har tre reaktion fartøjer og bruger en robot mekanisme til dynamisk konfigurerer den flydende pathway som krævet af enhver særlig syntese protokol11. Synthesizer software tillader oprettelsen af syntese programmer (sekvenser) for forskellige røbestoffer af dragging og opgav Enhed operationer såsom Trap isotop, Elueres isotop, Tilføje reagens, reagere, og fordampe12. Hver enhed drift har en bred vifte af programmerbare parametre tilgængelige til operatøren, såsom varighed, temperatureller inaktiv gas kørsel tryk (pres). Ved at forstå karakteren af hver enhedsoperation, en manuel syntese let kan oversættes til en sekvens af handlinger, enhed og derefter redigeres under optimering af protokol13. Kombineret med modulet ELIXYS PURE/FORM, kan det integrerede system også udføre en automatiseret rensning og formulering af PET-sporstof. Ved hjælp af denne radiosynthesizer, har vi tidligere rapporteret automatiseret syntesen af 24 forskellige 18F-mærket roebestoffer og prostetiske grupper11,14,15,16, som samt den automatiserede enzymatisk radiofluorination af biomolekyler17, ved blot at ændre reagenser og ikke konfiguration af systemet. Andre har vist den automatiserede syntese af [18F] RO6958948 for billeddannelse af tau neurofibrillary tangles18, automatiseret syntesen af proteser gruppe [18F] F-Py-TFP med en efterfølgende mærkning af peptider19 , og den automatiske syntese af [18F] AM580 for billeddannelse af phosphodiesterase 10a (PDE10A)20. Desuden flere grupper har vist produktion af røbestoffer egnet til klinisk brug, herunder 4-[18F] Fluorobenzyl-triphenylphosphonium ([18F] FBnTP) til billeddannelse af mitokondrielle membran potentielle21, [ 18 F] DCFPyL for billeddannelse af prostata-specifikt membran antigen (PSMA)22og [18F] THK-5351 til billeddannelse af tau23.

I dette papir, vi bruger vores erfaringer med [18F] CFA til at illustrere, hvordan en manuel radiosynthetic procedure kan ligefrem og hurtigt oversættes til en automatiseret syntese egnet til rutinemæssig produktion efter cGMP retningslinjer. Tracer [18F] CFA var designet til billeddannelse af dCK aktivitet. Den manuelle radiosynthesis [18F] CFA blev oprindeligt beskrevet af Shu et al. 24 som en procedure, ved hjælp af to reaktion fartøjer, mellemliggende silica patron rensning og en afsluttende HPLC rensning skridt (Se Supplerende materiale, afsnit 1 for detaljer). Seneste in vitro- og prækliniske undersøgelser har vist ekstraordinære specificiteten af dette sporstof til dCK, og først i menneskelige undersøgelser har vist gunstig biodistribution25. Der er en umiddelbar interesse i større skala kliniske undersøgelser for at bekræfte følsomheden af [18F] CFA PET variationer i dCK aktivitet og en langsigtet interesse i de potentielle kliniske anvendelser af dette sporstof26. Det kan være en nyttig biomarkør for behandlinger, der udløser T-celle aktivering, inducerer DNA-skader eller stole på dCK-afhængige nucleoside analoge prodrugs. Navnlig [18F] CFA kan aktivere stratificering af patienter til en potentielle respons på behandlingen med BSA. [18F] CFA kan også lette undersøgelse og udvikling af dCK hæmmere, der fremme mod kliniske forsøg. Da denne tracer har traditionelt været syntetiseret manuelt, fremme alle disse undersøgelser kræver en pålidelig, automatiseret syntese af [18F] CFA egnet til klinisk brug.

Selv om vi tidligere rapporteret en automatiseret syntese af [18F] CFA for prækliniske undersøgelser16, denne protokol bygger videre på disse bestræbelser og beskriver yderligere ændringer nødvendige for den kliniske produktion af dette sporstof, herunder integration fuldt automatiseret rensning og formulering, validering af protokollen og kvalitetskontrol test. De almindelige procedurer beskrevet her er ikke begrænset til at udvikle en automatiseret og klinisk passende syntese af [18F] CFA men kan generaliseres på en enkel måde at udvikle automatiserede synteser egnet til klinisk brug af andre radiotracers mærket med fluor-18.

Protocol

1. generelle Procedure for Automation og validering af en Radiosynthesis protokol for kliniske fremstilling

  1. Analysere støtteberettigelse af manuel syntese for kliniske fremstilling
    1. Udfør risikoanalyse af produktkontaminering med nogen uønskede resterende kemikalier.
      1. Undgå klasse 1 opløsningsmidler som benzen og erstatte dem med passende alternative opløsningsmidler (klasse 2 eller klasse 3).
      2. Undgå kemikalier, der ville være svært at opdage i den endelige formulering som potentielle resterende urenheder.
      3. Vælg kun kemikalier, der er kommercielt tilgængelige i høj renhed grade (den USP eller Ph.Eur. klasse ønskes) og er forsynet med et certifikat for analyse.
    2. Forfine ordningen syntese, hvis uønskede kemikalier eller opløsningsmidler er opdaget af risikoanalysen og Gentag afsnit 1.1, indtil ingen tilbage.
  2. Automatisere syntese-protokollen
    1. Hvis et automatiseret protokol for tracer ved hjælp af den samme synthesizer har allerede oprettet og overført til et online repository, downloade en kopi af programmet syntese.
    2. Hvis en automatiseret syntese program ikke allerede findes, skal du oprette en.
      1. Med papir og pen, opdele den manuelle syntese i højt trin (f.eks. tørring/aktivering [18F] fluor, varme for at lette radiokemiske reaktion, udføre en rensning skridt, osv.). Yderligere nedbryde de højtstående skridt ind i diskrete, grundlæggende processer, der er nødvendige. Som et eksempel, ordningen syntese af [18F] CFA er vist i figur 1, identifikation af højtstående trin er vist i figur 2A, og opdelingen i processer er vist i figur 2B.
      2. Med papir og pen, kort hver proces i de enkelte enhed operationer fra synthesizer software. Som et eksempel, en analyse af kortlægning af grundlæggende processer i syntesen af [18F] CFA til passende enhed operationer i synthesizer software13 er vist i figur 2 c.
      3. Ved hjælp af radiosynthesizer programming interface, oprette en tom program og Føj hver af de identificerede enhed operationer i rækkefølge ved at klikke på knappen Menu (øverst til venstre) og vælge sekvenserog derefter klikke på nye Rækkefølge knappen. For hver enkelt enhed operationer identificeret i trin 1.2.2.2, træk enhedsoperation fra de tilgængelige handlinger til billedserievisning og klik eller type til at udfylde den ønskede værdi for hver parameter for handlingen enhed. Figur 3 viser et eksempel på grænsefladen, når alle operationer til at syntetisere [18F] CFA har været befolket, og brugeren har valgt den første reagere enhedsoperation til at redigere parameterværdier. Den endelige sammenfattende program for [18F] CFA er beskrevet i den Supplerende materiale, Tabeller S1 og S2.
    3. Kontrollere syntesen program.
      1. Udføre en tør køre. Oprette og køre programmet som i trin 2.1-2.3, bruger alle reagenser og opløsningsmidler end radionuklid (fx [18F] fluorid) for at kontrollere forventede funktionsmåde.
      2. Hvis det er nødvendigt, justere enhed drift parameterværdier i programmet (f.eks. den tid eller drivende pres til fuldstændig overfører et reagens, tid og temperatur til at fordampe en opløsningsmiddel til det ønskede niveau, osv.), og test igen. For at indstille parameterværdier, først vende tilbage til redigeringstilstanden ved at vælge sekvenser fra hovedmenuen (øverst til venstre) og vælge den nyoprettede program. Næste, klik på den ønskede enhedsoperation i billedserievisning (bunden af skærmen), navigere til den ønskede parameter, og vælg eller Indtast den nye værdi.
    4. Udføre en lav-aktivitet (< 370 MBq) testkørsel til at evaluere programmet.
      1. Optimere den automatiserede syntese ved at justere parameterværdier for at forbedre udbyttet, syntese tid, repeterbarhed og eventuelle andre ønskede målbart resultat.
  3. Udvikle kvalitetskontrol (QC) testing procedurer
    1. Ved hjælp af en ikke-radioaktive henvisning af det endelige produkt og prøver af potentielle kemiske urenheder, udvikle en analytisk radio-HPLC og/eller radio-tynde lag kromatografi (radio-TLC) metode med tilstrækkelig adskillelse af arter til bestemmelse af kemiske renhed, molar aktivitet, radiokemiske renhed og radiokemiske identitet. Validere den analytiske metode(r) til repeterbarhed og linearitet og bestemme påvisning og kvantificering grænserne.
    2. På samme måde, udvikle og validere en gaskromatografi metode til at analysere flygtige urenheder (f.eks., resterende beløb af opløsningsmidler, der anvendes under syntesen).
    3. Udvikle og validere analytiske assays, der giver mulighed for påvisning og kvantificering af andre potentielle urenheder (f.eks.cryptand 222 via standard farve spot test).
    4. Bruge standard procedurer til bestemmelse af sterilitet, pH, den radionukleidiske identitet, den radionukleidiske renhed, radioaktivitet koncentration, produktet volumen og endotoxin niveauer.
  4. Udføre syntese validering
    1. Etablere standardforskrifter (standardforskrifter) til syntese og QC testprocedurer og integrere en materialer og udstyr tracking systemet kompatibelt med nuværende god fremstilling praksis (cGMP) krav.
    2. Validere syntese procedurer via tre uafhængige og fortløbende produktionen kører på de samme radioaktivitet som beregnet til klinisk fremstilling efter standardforskrifterne. Dokumentere syntese præstationer og resultater af QC test.
    3. Alle træk validering kørsler skal passere de forudindstillede QC grænser. Hvis en validering køre fejler, Gentag hele valideringsprocessen efter passende løse den egentlige årsag til svigt.

2. eksempel: Automatiseret syntese af [18F] CFA til klinisk brug

  1. Forberede radiosynthesizer
    1. Tænd for radiosynthesizer.
    2. Sikre inaktiv gas supply er tændt med tilstrækkeligt pres og at de nødvendige ventiler er åben, så radiosynthesizer er forbundet til gasforsyningen.
    3. Installere nye engangs kassetter i reaktoren #1 og #2 positioner og indsætte reaktion fartøjer der indeholder magnetiske rør barer. Sikre, at hver kassette overførsel stigrøret er pegede lige ned.
    4. Forberede reagens hætteglas og installere dem i kassetter efter diagrammet i figur 4.
    5. Installere en tom [18O] H2O opsving hætteglas i positionen W1 kassette # 1.
    6. Aktivere en Kvartære methylammonium (QMA) patron ved første passerer 12 mL 1 M KHCO3 løsning gennem det, efterfulgt af 12 mL deioniseret vand. Betingelse en silica Sep-Pak patronen ved at overføre 5 mL ethylacetat igennem den.
    7. Tilslut patroner og gøre alle kassette slanger forbindelser, som vist i figur 5A. Kontrollér, at ingen kassette slanger (herunder ubrugte slanger) hænger i kraterets, hvor det kan forstyrre robot bevægelser.
    8. Tilslut [18F] fluor kilde linie fra cyclotron til [18F] fluor inputlinjen på kassette #1.
    9. Sikre spildbakken er tom. Sted affald linjer fra delsystemet rensning/formulering til spildbakken (dvs., prøve loop 1 affald line, HPLC delsystemet affald line, og sprøjten pumpe affald linje).
    10. Forbinde HPLC input linjer. Sted HPLC Mobil fase input linje "A" i en beholder med 25 mM ammoniumacetat og HPLC Mobil fase inputlinje "B" i en beholder med EtOH.
    11. Reagensglasset rensning/formulering delsystem og HPLC kolonne.
      1. Åbne siden kontrol for modulet rensning/formulering i softwaren ved at vælge HPLC fra hovedmenuen (øverst til venstre). Fanen rensning vil allerede valgt som standard. (Denne side er vist i figur 6.)
      2. Indstille flowet til 5,0 mL/min. ved den definerede opløsningsmiddel sammensætning og vælg hvilken kolonne position kolonnen rensning er installeret i. Drej på HPLC pumpen i isocratic tilstand i mindst 10 min.
      3. Skyl produktlinje og alle brøkdel samling linjer med den mobile fase, hver i 1 minut.
      4. Skyl hver HPLC prøve loop og HPLC prøve loop transfer slanger med 10 mL af den mobile fase ved hjælp af en sprøjte.
    12. Forbinde rensning/formulering delsystemet sprøjten pumpe input linjer. Brug koncentreret natriumklorid (90 mg/mL) for den Elute linje og 0,9% saltvand for at rekonstruere linje.
    13. Prime delsystemet formulering.
      1. Naviger til fanen formulering af rensning/formulering kontrolside.
      2. For at prime koncentreret natriumklorid (90 mg/mL), skal du vælge Elute tab. Tryk initialisere initialisere sprøjten pumpe. Der afpipetteres 5 mL.
      3. For at prime 0,9% saltvand, skal du vælge rekonstruere tab. afpipetteres 5 mL.
    14. Forbinde linjerne produkt og slutproduktet fra forsiden af delsystemet rensning/formulering i en T-forbindelsen. Forbind udgangen af T-forbindelsen til en steril filter (0,22 µm), som igen er forbundet til sterile slutproduktet hætteglas. Indsæt en udluftningsanordning nål med en steril filter i headspace af slutproduktet hætteglas. Et fotografi af det endelige system set-up er vist i figur 5B.
    15. Tilføje tøris og EtOH eller MeOH til den kolde fælde.
  2. Køre programmet syntese
    1. Naviger til listen over programmer ved at vælge sekvenser fra knappen hovedmenuen (øverst til venstre). Vælg [18F] CFA program og starte programmet ved at trykke på knappen Kør .
    2. Omhyggeligt gennemgå hvert element på kontrollisten pre-opstille og tjekke dem, som de er fuldført. En del af skærmbilledet pre-opstille checkliste er vist i figur 7.
    3. Tryk på Fortsæt for at bekræfte, at installationen er fuldført og forårsage den automatiserede syntese til at begynde.
      1. Hvis det ønskes, overvåge syntese i realtid via visuel feedback (reaktor kameraer), sensoren aflæsninger (f.eks. temperatur, tryk, vakuum, stråling læsning, osv.) og Nedtælling timere. En repræsentativ screenshot er vist i figur 8.
      2. Vælg produkt under enhedsoperation rensning når produkt peak er begyndt at dukke op på stråling detektor kromatogram. En repræsentativ screenshot under denne enhed handling (som indeholder et kromatogram af UV-detektor og stråling detektor output) er vist i figur 9.
      3. Når stråling detektor kromatogrammet peak er vendt tilbage til den oprindelige plan, skal du vælge affald at aflede strømningsbane af delsystemet HPLC til spildbakken.
  3. Oprette og køre programmet formulering
    1. Åbn fra listen over programmer (sekvens skærm), den [18F] CFA formulering program.
    2. Justere parametrene for handlingen formulering enhed.
      1. Beregne mængden af indsamlede produkt brøkdel (Vbrøkdel) baseret på HPLC pumpens strømningshastighed og varigheden af samlingen brøkdel.
      2. Beregne omfanget af yderligere natriumchlorid (90 mg/mL) kræves for at opnå isotonicity og beregne mængden af ekstra saltvand skal fortyndes EtOH koncentration under 10%.
      3. Ændre program med disse værdier. Mængden af natriumchlorid (90 mg/mL) er angivet for Elute skridt og mængden af saltvand er indtastet for trinnet rekonstruere . (Beregningerne er beskrevet i det Supplerende materiale, Figur S2.)
      4. Gem programmet.
    3. Kør programmet. Systemet vil udvande den indsamlede rensede produkt fraktion med natriumchlorid og saltvand til at sikre isotonicity af formuleringen og levere det via en sterilisering filter i sterilt produkt hætteglas.
  4. Indsamle formuleret [18F] CFA for kvalitetskontrol og forsendelse
    1. Fjerne formulerede [18F] CFA produkt fra den varme celle.
    2. Brug steril arbejde teknikker, trække to prøver (300 µL) til at udføre kvalitetskontrol tests.
    3. Brug den første prøve for at teste for sterilitet af den endelige udformning ved at vaccinere væske thioglycolate medier og tryptic soja bouillon til 14 d uden at observere nogen vækst.
    4. Brug den anden prøve skal udføre kvalitetskontrol efter procedurer udviklet i trin 1.3. Procedurerne på UCLA Ahmanson biomedicinsk Cyclotron anlægget i overensstemmelse med den amerikanske Farmakopé er beskrevet nedenfor.
      1. Vurdere udseende ved besigtigelse.
      2. Vurdere pH med en indikator papir.
      3. Vurdere bakteriel endotoxin indhold ved hjælp af en kinetisk kromogent bakteriel Endotoxin Test (BET).
      4. Vurdere radiokemiske identitet med analytiske radio-HPLC ved at kontrollere fælles eluering af det radioaktive prøve og en ikke-radioaktive reference sammensatte.
      5. Vurdere radiokemiske renhed med analytiske radio-HPLC ved at sammenligne arealet under kurven (AUC) af radioaktivt urenheder i gamma-detektor kromatogrammet med AUC svarende til det ønskede produkt.
      6. Vurdere kemiske renhed med analytiske HPLC ved bestemmelse af AUC i UV-detektor kromatogrammet af alle UV-aktive urenheder.
      7. Vurdere molar aktivitet og carrier masse med analytiske radio-HPLC ved bestemmelse af AUC svarende til den ønskede vare i UV-detektor kromatogram.
      8. Vurdere half-life af sonden ved at måle dens aktivitet på to forskellige timepoints og montering af et henfald kurve.
      9. Vurdere det resterende indhold af formuleringen opløsningsmiddel ved gaskromatografi.
      10. Vurdere radionuklid energi ved hjælp af en gamma spektrometer.
      11. Vurdere cryptand 222 indhold ved hjælp af et TLC-baserede spot test.
    5. Hvis alle tests passere, frigive sonde formulering til forsendelse til den kliniske imaging websted.
  5. Post-kørsel og ordning lukning
    1. Skylles kolonnen HPLC rensning og alle slanger anvendes til produkt samling med 70% (v/v) EtOH i vand. Dette bør ske med PURE/formularkontrolelement side, svarende til trin 2.1.12.
    2. Lukket ned radiosynthesizer via knappen strømforsyning på software. Et pop-up-vindue vil angive når beføjelse til at systemet kan være slukket.
    3. Slukke trykluft og inaktiv gas forsyningerne ved at lukke de passende lukkeventilerne.
    4. Give tid til resterende radioaktivitet i cellen hot til forfald (typisk natten over).
  6. Ren radiosynthesizer
    1. Fjerne og bortskaffe alle kassetter, patroner, reaktor hætteglas og reagens hætteglas anvendes under syntesen.
    2. Tømme indholdet i en kold fælde.
    3. Rens rensning delsystemet væske stier.
      1. Åbne en eksisterende rengøring program eller oprette et nyt program, som indeholder en rensning enhedsoperation i rengøring tilstand (dvs. med rene afkrydsningsfelt markeret). Se Supplerende materiale, Figur S9 for eksempel.
      2. Vælg den kolonne, der blev brugt til rensning og HPLC Mobil fase input-linie, der er forbundet med en flaske, der indeholder 70% på konfigurationssiden parameter EtOH i vand. Programmere en gennemstrømningshastighed på 2 mL/min., en føres varighed for hver injektion sløjfe på 5 min, og en føres varighed for hvert produkt og brøkdel output af 30 s. Vælg Tør linjer og programmere en varighed af 30 s.
      3. Placere alle brøkdel line output i en stor spildbakken.
      4. Kør programmet.
      5. Efter færdiggørelsen, Tøm spildbakken.
    4. Ren formulering delsystemet væske stier.
      1. Åbne et eksisterende program eller oprette et nyt program, som indeholder en formulering enhedsoperation i rengøring tilstand (dvs. med rene afkrydsningsfelt markeret under fanen Clean ). Se Supplerende materiale, Figur S10 for eksempel.
      2. Fyld en ren fortynding reservoir (på forsiden af delsystemet rensning/formulering) med 100 mL EtOH.
      3. Placer delsystemet rensning/formulering Elute input line i en EtOH reservoir (indeholdende > 50 mL EtOH).
      4. Placere de skylles og rekonstruere input linjer i en spildbakken sammen med den endelige produkt outputlinje.
      5. Kør programmet.
      6. Efter færdiggørelsen, Tøm spildbakken.

Representative Results

En metode til at automatisere produktionen af [18F] CFA blev udviklet og tre validering partier blev syntetiseret. Syntese, rensning og formulering af [18F] CFA blev opnået i 90 ± 5 min (n = 3) og ikke-henfald-korrigeret radiokemiske udbyttet var 8,0 ± 1,4% (n = 3). Aktivitet udbyttet af de tre kører var 3,24 GBq, 2.83 GBq og 3,12 GBq, startende fra 34.3 GBq, 41,8 GBq og 41.1 GBq, henholdsvis. Opnåede [18F] CFA formuleringer bestået alle kvalitetskontrol tests (tabel 1). Automatiseret protokollen er i øjeblikket anvendes til produktion af klinisk-grade [18F] CFA for at støtte kliniske forsøg.

Quality control data Validering køres 1 Validering køres 2 Validering køres 3
[krav om "Pass"]
Udseende Pass Pass Pass
[klar, farveløs, fri af partikler]
Radioaktivitet koncentration på EOS 213 MBq/mL 210 MBq/mL 180 MBq/mL
[≤ 740 MBq/mL @ EOS]
pH 6 5.8 6
[5.0 – 8.0]
Half-Life 115 min. 108 min 112 min
[105-115 min]
Radiokemiske renhed 99% 99% 99%
[> 95%]
Radiokemiske identitet ved relative retentionstid (RRT) 1,01 1,01 1,01
[1,00 < RRT < 1.10]
Molar aktivitet 314 GBq/µmol > 370 GBq/µmol > 370 GBq/µmol
[≥ 3,7 GBq/µmol]
Samlede carrier massen i slutproduktet 3.1 µg < 1 µg < 1 µg
[≤ 50 µg/dosis]
Samlede urenhed massen i slutproduktet ND ND ND
[≤ 1 µg / dosis]
Maksimalt tilladte Injektionsvolumen baseret på samlede carrier masse ≤ 50 µg/dosis og samlede urenhed masse ≤ 1 µg/dosis Hele batch Hele batch Hele batch
EtOH residualindholdet af GC 8,90% 9,50% 9,60%
[≤ 10%]
EtOAc residualindholdet af GC < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm
[≤ 5000 ppm]
MeCN residualindholdet af GC < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm
[≤ 410 ppm]
Resterende K222 af farve spot test Pass Pass Pass
[< 50 µg/mL]
Filter membran Integritetstest Pass Pass Pass
[bubble punkt ≥ 50 psi]
Bakteriel endotoksiner Pass Pass Pass
[≤ 175 EU/batch]
Den radionukleidiske renhed af gamma spektroskopi Pass Pass Pass
[> 99,5%]
Sterilitet Pass Pass Pass
[opfylder USP < 71 >]

Tabel 1: kvalitetskontrol (QC) test dataoversigt for tre validering batchnumre. EOB = slutningen af bombardement; EOS = slutningen af syntese; ND = ikke opdaget.

Figure 1
Figur 1: [18F] CFA radiosynthesis ordningen. MMT = Monomethoxytrityl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Oversættelse af en manuel syntese til en automatiseret sekvens af enhed operationer. (A) dette panel giver en oversigt over de højtstående trin i manuel syntesen af [18F] CFA. (B) dette panel viser de grundlæggende procedurer, der kræves for at udføre hvert af trinene på højt niveau. (C) Radiosynthesizer-specifikke enhed operationer bruges til at udføre de grundlæggende procedurer er vist som kort. Hver enhedsoperation har sit eget sæt af parameterværdier (vist som understreget) som er konfigureret via softwaren. Notationen "R1" og "R2" angiver reaktion fartøjer #1 og #2, henholdsvis. Reagenserne svarende til reagens numre er identificeret i figur 4. Serien af enhed operationer er gemt som en sekvens og henrettet af software til at udføre automatiseret syntesen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Screenshot af radiosynthesizer (ELIXYS) software interface til at skabe et sammenfattende program. Enhed operationer er placeret i den ønskede rækkefølge i filmstrimlen ved hjælp af en træk-og-slip grænseflade. I dette skærmbillede, en reagere enhedsoperation er valgt, og dens redigerbare parameterværdier er vist i den største del af skærmen. I dette eksempel, vil blive gennemført fluorination reaktion i reaktion fartøj #1 (forseglet) ved 120 ° C i 10 min med aktive omrøring. Fartøjet bliver afkølet til 35 ° C, efter at reaktionen er udløbet. Detaljer af parameterværdier, der kan programmeres til andre enhed operationer er vist i den Supplerende materiale, afsnit 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Screenshot af reagens konfigurationsskærmbilledet. For [18F] CFA syntese sekvens indlæses alle reagenser i engangs kassette #1, som er vist fremhævet i markeringsområdet komponent. For [18F] CFA syntese beskrevet her elueringsvæsken er 1,0 mg K2CO3 + 5,0 mg af K222 i 0,4 mL H2O/0.5 mL MeCN, forløber er 6 mg af CFA forløber i 0,6 mL af MeCN og HPLC Mobil fase er 85:15 v /v 25 mM ammonium acetat: ethanol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Radiosynthesizer set-up til syntese af [18F] CFA. (A) Dette er en skematisk viser kassette væske stier, forbindelser til patroner, og forbindelsen til at overføre rå slutproduktet fra modulet radiosynthesis til rensning/formulering modul. (Begge moduler er kontrolleret med en enkelt computer og software interface.) (B) Dette er et fotografi af radiosynthesizer inde i en varm celle efter forberedelse til [18F] CFA syntese. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Screenshot af rensning/formulering modul kontrol interface. Denne skærm er tilgået af operatøren til at manuelt kontrollere HPLC og formulering delsystemerne under opsætningen af syntese. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Pre-opstille tjekliste skærmen. Operatøren indtaster serienummeret på kassetter installeret i systemet og skal afkrydse hver vare til at sikre, at systemet er korrekt konfigureret og forberedt til syntese. Ud over disse sektioner, operatøren er også bedt om et navn og en beskrivelse af syntesen køre (afsnit 1) og mange numre for alle reagenser, der anvendes (afsnit 2) og bliver bedt om at kontrollere alle reaktor video feeds fungerer korrekt (afsnit 6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Screenshot af radiosynthesizer software mens du kører [18F] CFA syntese sekvens. Softwaren viser rækkefølgen af enhed operationer i området filmstrimlen. Afsluttede transaktioner er nedtonet og fremhævet i hvid, den aktuelle handling er fremhævet i grå og kommende operationer er vist i mørkegrå. Center området af skærmen viser status for den aktive enhedsoperation, herunder hvilke underkommando udføres, samt den nuværende systemstatus (reaktor video feeds og sensordata). Denne særlige reagere enhedsoperation er fluorination reaktionen. I Temp området vises den aktuelle temperatur af reaktoren ved siden af målet (programmeret) temperatur. Nedenfor dette viser aktivitetsområdet stråling sensorværdier fra de tre sensorer tilknyttet trinnet reaktion. Endelig viser en video-feed til venstre en levende opfattelse af reaktoren hætteglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Skærmbillede af brugergrænsefladen radiosynthesizer mens du kører handlingen rensning enhed under syntesen af [18F] CFA. The UV-detektor og stråling detektor udgange af modulet rensning/formulering vises på den centrale figur i realtid. Yderligere feedback fra detektorer og HPLC pumpe er vist på højre side af skærmen. Operatøren indsamler produkt peak ved midlertidigt at vælge produkt når peak begynder at dukke op og derefter skifte tilbage til affald efter den komplette peak er blevet set. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol definerer de grundlæggende trin, der skal træffes når automatisere en manuel syntese protokol at opnå produktion af kliniske grade tracer formulering. Den hele udviklingscyklus, herunder kvalitetskontrol udvikling, eksemplificeret ved radiotracer [18F] CFA (for billeddannelse af dCK aktivitet). Særlig opmærksomhed blev betalt til at ændre den automatiske syntese til at sikre den tracer egnetheden til klinisk brug. Syntesen indebærer grundlæggende processer såsom aktivering af [18F] fluor, radiofluorination af forløber molekyle, mellemliggende patron rensning, beskytte gruppe fjernelse, og semi-forberedende HPLC rensning og formulering til injektion. Disse grundlæggende processer omfatter en standard repertoire, der er tilstrækkelig til syntese af størstedelen af 18F-mærket PET røbestoffer.

Mens designe syntesen, er valget af reagenser og deres kvalitetssikring af særlig betydning for klinisk brug. At sikre den korrekte programmering og ordentlig forbindelser ved at udføre en mock syntese (kun opløsningsmidler) er bydende nødvendigt at eliminere uventede fejl, når syntesen er udført med radioaktivitet. De efterfølgende syntese optimeringer (opløsningsmidler, diskenheder, beløb, temperaturer, reaktionstider og rensning betingelser) afhænger af den specifikke PET tracer i udvikling. Under disse eksperimenter, bør særligt fokus være skinnede på de kemiske og radiokemiske renhed af det færdige produkt, der kan opnås, som disse skal opfylde strenge krav til klinisk brug. En syntese, der pålideligt producerer et rent produkt i lavere men tilstrækkelig aktivitet udbytter er normalt foretrukne over en højere-fremstilling proces, der har en risiko at svigte sporadisk. Når syntesen er blevet tilstrækkeligt optimeret, skal den endelige proces gennemgå valideringstest (en regulerende krav) til at sikre kliniske egnethed. Metoden validerede syntese kan derefter bruges til at producere PET-sporstof til klinisk brug. Når syntetisere en PET tracer efter en valideret metode, bør standardprocedurer følges grundigt. For at sikre overensstemmelse, er softwaren programmeret til at have operatoren bekræfte fuldførelse af vigtige skridt via en pre-opstille tjekliste efter at klikke på Kør begynde syntesen. Mens systemet vil udføre syntesen i en automatiseret måde, kræver rensning trin manuel indgriben. Operatøren skal, derfor nøje iagttage kromatografiske skærmen under trinnet HPLC rensning, og manuelt input i realtid når til start og stop indsamling produkt brøkdel.

Inden for vores automatisering og optimering indsats for [18F] CFA syntese, har vi strømlinet semi-forberedende HPLC-metoden rensning af produkt blandingen ved hjælp af en injicerbar opløsningsmiddel system bestående af ammonium acetat løsning og EtOH ; vores tidligere metode kræves yderligere trin for at udveksle opløsningsmidlet efter rensning16. Den efterfølgende formulering behandle således behov for kun at reducere EtOH indholdet af de indsamlede brøkdel tilladte niveauer og sikre dets isotonicity, som begge kan ske ved fortynding. Trinnet formuleringen blev udført ved hjælp af et andet program bestående af en enkelt formulering enhedsoperation til at tillade variabel volumen tilføjelser af NaCl-løsninger til renset produkt brøkdel via modulet formulering at tage højde for variablen volumen opnås efter HPLC rensning. Hvis indsamlet produkt brøkdel volumen var indstillet til at være konstant i stedet, kunne enhedsoperation formulering indgå i programmet vigtigste syntese, undgå behovet for et uafhængigt program. En alternativ metode til at undgå manuel intervention ville være at bruge den fulde funktionalitet af modulet formulering (fxfortyndes den renset tracer med vand, fælde på et C18 fast-fase ekstraktionspatron, vaske det, elueres det med en fast volumen af EtOH og endelig fortynd det med et fast volumen af saltvand).

Teknikken præsenteret her til automatisering og validerer en sammenfattende protokol til klinisk brug er bestemt til at være ganske almindelige. Gennem valg af radiosynthesizer (ELIXYS), kan en lang række sammenfatninger automatiseret og valideret. Dette omfatter komplekse 3-pot synteser, eller synteser involverer høje temperaturer af flygtige opløsningsmidler. Optimere en syntese kan opnås ved at ændre parametrene for programmet. Synthesizeren har funktioner til at overvåge virkningen af ændringer, såsom positionering reaktion fartøjer til fjernelse af prøver til radio-TLC eller radio-HPLC analyse. Dog uden system ændringer, systemet i øjeblikket tillader ikke for håndtering af meget lav reagens diskenheder (~ 5-20 µL), mellemprodukt destillation eller håndtering af [18F] AlF, 68Ga, eller andre radiometals. Hvis manuel syntese til automatiseres indeholder sådanne skridt, og de kan ikke omgås, kan automatisering og validering med en anden radiosynthesizer platform være passende.

Selv om dette arbejde er fokuseret på udviklingen af en protokol til automatiseret produktion af [18F] CFA til klinisk brug, syntesen af mange andre PET røbestoffer kan automatiseres i en måde, der er egnet til klinisk produktion, følger den samme logik og metoder. Efter den metode, der præsenteres her, har vi også tilpasset den automatiserede syntese af 9-(4-[18F] fluoro - 3-[hydroxymethyl] butyl) guanin ([18F] FHBG) og valideret det til klinisk brug. Bruger-etablerede protokoller kan uploades til og hentet fra SOFIE sonde netværk, en webportal til deling syntese programmer og tilhørende dokumentation blandt forskellige radiofarmaci websteder27. Dette kan undgå en dobbeltarbejde i Fællesskabet og lette multicenter kliniske undersøgelser, hvor PET billeddannelse.

Disclosures

Regents af University of California har licenseret teknologien til SOFIE, der blev opfundet af Jeffrey Collins og R. Michael van Dam og have taget egenkapital i SOFIE som en del af den licensudstedende transaktion. Derudover er R. Michael van Dam grundlægger og konsulent for SOFIE. Vilkårene i denne aftale har gennemgået og godkendt af University of California, Los Angeles i overensstemmelse med dens interessekonflikt politikker. Eric Schopf og Christopher Drake er medarbejdere og aktionærer i SOFIE.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet i en del af National Cancer Institute (R44 CA216539) og UCLA Foundation fra en for donation af Ralph og Marjorie Crump for UCLA Crump Institut for Molekylær Imaging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ELIXYS FLEX/CHEM Sofie (Culver City, CA, USA) 1010001 Radiosynthesizer
Radiosynthesizer cassette Sofie (Culver City, CA, USA) 1861030400 Cassette for ELIXYS FLEX/CHEM
ELIXYS PURE/FORM Sofie (Culver City, CA, USA) 1510001 Radiosynthesizer purification module
[O-18]H2O IBA RadioPharma Solutions (Reston, VA, USA) IBA.SP.065 >90% isotopic purity
[F-18]fluoride in [O-18]H2O UCLA N/A Produced in a cyclotron (RDS-112; Siemens; Knoxville, TN, USA) by the (p,n) reaction of [O-18]H2O. Bombardment at 11 MeV using a 1 mL tantalum target with havar foil.
Deionized water UCLA N/A Purified to 18 MΩ and passed through 0.1 µm filter
Acetonitrile (MeCN) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 271004 Anhydrous, 99.8%
Ethanol (EtOH) Decon Laboratories, Inc. (King of Prussia, PA, USA) 2701 Anhydrous, 200 proof
Sodium hydroxide (NaOH) solution Merck (Burlington, MA, USA) 1.09137.1000 1M solution
Hydrochloric acid (HCl) solution Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) SA48-500 1M solution
Ethyl acetate (EtAc) Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) E195SK-4 HPLC grade
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) S-640-500 USP grade
Ammonium acetate Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) A639-500 HPLC grade
Potassium carbonate (K2CO3) Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) P-208-500 Certified ACS
CFA precursor CalChem Synthesis (San Diego, CA, USA) N/A Custom synthesis
Cryptand 222 (K222; Kryptofix 2.2.2) ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Germany) 800.1000 >99%
Sodium chloride (NaCl) solution (saline) Hospira (Lake Forest, IL, USA) 0409-4888-02 0.9%, for injection, USP grade
Silica cartridge Waters (Milford, MA, USA) WAT051900 Sep-pak Classic
Quaternary methylammonium (QMA) cartridge Waters (Milford, MA, USA) WAT023525 Sep-pak Light Plus
Sterile syringe filter (0.22 µm) Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) SLGSV255F Millex-GV
Glass V-vial (5 mL) Wheaton (Millville, NJ) W986259NG Used for reaction vessels
Septa Wheaton (Millville, NJ) 224100-072 Used for reagent vials
Crimp cap Wheaton (Millville, NJ) 224177-01 Used for reagent vials
Amber serum vial (2 mL) Voigt (Lawrence, KS, USA) 62413P-2 Used for reagent vials
Magnetic stir bar Fisher Scientific (Hampton, NH, USA) 14-513-65 Used for reaction vessels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Phelps, M. E. Positron emission tomography provides molecular imaging of biological processes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (16), 9226-9233 (2000).
  2. Kitson, S., Cuccurullo, V., Ciarmiello, A., Salvo, D., Mansi, L. Clinical Applications of Positron Emission Tomography (PET) Imaging in Medicine: Oncology, Brain Diseases and Cardiology. Current Radiopharmaceuticalse. 2 (4), 224-253 (2009).
  3. Sengupta, D., Pratx, G. Imaging metabolic heterogeneity in cancer. Molecular Cancer. 15, 4 (2016).
  4. Rabinovich, B. A., Radu, C. G. Imaging Adoptive Cell Transfer Based Cancer Immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 672-684 (2010).
  5. Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
  6. Hargreaves, R. The Role of Molecular Imaging in Drug Discovery and Development. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 83 (2), 349-353 (2008).
  7. Radiosynthesis Database of PET Probes (RaDaP). , Available from: http://www.nirs.qst.go.jp/research/division/mic/db2/ (2017).
  8. 18F-Database of Imaging Radiolabelled Compounds (DIRAC). , Centre National de la Recherche Scientifique. Available from: http://www.iphc.cnrs.fr/dirac/ (2013).
  9. Keng, P. Y., Esterby, M., van Dam, R. M. Emerging Technologies for Decentralized Production of PET Tracers. Positron Emission Tomography - Current Clinical and Research Aspects. Hsieh, C. -H. , InTechOpen. London, UK. 153-182 (2012).
  10. Lazari, M., Irribarren, J., Zhang, S., van Dam, R. M. Understanding temperatures and pressures during short radiochemical reactions. Applied Radiation and Isotopes. , 82-91 (2016).
  11. Lazari, M., et al. ELIXYS - a fully automated, three-reactor high-pressure radiosynthesizer for development and routine production of diverse PET tracers. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (EJNMMI) Research. 3 (1), 52 (2013).
  12. Claggett, S. B., Quinn, K., Lazari, M., Esterby, J., Esterby, M., van Dam, R. M. A new paradigm for programming and controlling automated radiosynthesizer. Journal of Nuclear Medicine. 53 (suppl. 1), 1471-1471 (2012).
  13. Claggett, S. B., Quinn, K. M., Lazari, M., Moore, M. D., van Dam, R. M. Simplified programming and control of automated radiosynthesizers through unit operations. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (EJNMMI) Research. 3, 53 (2013).
  14. Lazari, M., et al. Fully Automated Production of Diverse 18F-Labeled PET Tracers on the ELIXYS Multireactor Radiosynthesizer Without Hardware Modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
  15. Lazari, M., et al. Fully-automated synthesis of 16β-18F-fluoro-5α-dihydrotestosterone (FDHT) on the ELIXYS radiosynthesizer. Applied Radiation and Isotopes. 103, 9-14 (2015).
  16. Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
  17. Drake, C., et al. Enzymatic Radiofluorination of Biomolecules: Development and Automation of Second Generation Prosthetic on ELIXYS Radiosynthesizer. Journal of Nuclear Medicine. 58 (supplement 1), 1 (2017).
  18. Gobbi, L. C., et al. Identification of Three Novel Radiotracers for Imaging Aggregated Tau in Alzheimer's Disease with Positron Emission Tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (17), 7350-7370 (2017).
  19. Ippisch, R., Maraglia, B., Sutcliffe, J. Automated production of [18F]-F-Py-peptides. Journal of Nuclear Medicine. 57, 275 (2016).
  20. Chen, H., et al. AMG 580: A Novel Small Molecule Phosphodiesterase 10A (PDE10A) Positron Emission Tomography Tracer. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 327-337 (2015).
  21. Waldmann, C. M., et al. An Automated Multidose Synthesis of the Potentiometric PET Probe 4-[18F]Fluorobenzyl-Triphenylphosphonium ([18F]FBnTP). Molecular Imaging and Biology. 20 (2), 205-212 (2018).
  22. Ravert, H. T., et al. An improved synthesis of the radiolabeled prostate-specific membrane antigen inhibitor, [18F]DCFPyL. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 59 (11), 439-450 (2016).
  23. Betthauser, T. J., et al. Characterization of the radiosynthesis and purification of [18F]THK-5351, a PET ligand for neurofibrillary tau. Applied Radiation and Isotopes. 130, 230-237 (2017).
  24. Shu, C. J., et al. Novel PET probes specific for deoxycytidine kinase. Journal of Nuclear Medicine. 51 (7), 1092-1098 (2010).
  25. Kim, W., et al. [18F]CFA as a clinically translatable probe for PET imaging of deoxycytidine kinase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (15), 4027-4032 (2016).
  26. Barrio, M. J., et al. Human Biodistribution and Radiation Dosimetry of 18F-Clofarabine, a PET Probe Targeting the Deoxyribonucleoside Salvage Pathway. Journal of Nuclear Medicine. 58 (3), 374-378 (2017).
  27. SOFIE. Sofie Probe Network. , Available from: http://www.sofienetwork.com/ (2018).

Tags

Kemi spørgsmål 140 Positron-emissions tomografi automatiseret radiosynthesis klinisk validering ELIXYS BSA kliniske anvendelighed radiotracer
Automatisering af en Positron-emissions-tomografi (PET) Radiotracer syntese protokol for kliniske produktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schopf, E., Waldmann, C. M.,… More

Schopf, E., Waldmann, C. M., Collins, J., Drake, C., Slavik, R., van Dam, R. M. Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production. J. Vis. Exp. (140), e58428, doi:10.3791/58428 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter